Ein einfaches Protokoll zur Überexpression und Reinigung von codonoptimierter, menschlicher cis- Prenyltransferase unter nicht-denaturierenden Bedingungen aus Escherichia Coli , wird zusammen mit einem enzymatischen Aktivitäts-Assay beschrieben. Dieses Protokoll kann für die Produktion von anderen cis- Prenyltransferase- Proteinen in Quantität und Qualität geeignet für mechanistische Studien verallgemeinert werden.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Überexpression und Reinigung des Menschen Cis -prenyltransferase in Escherichia coli
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Prenyltransferasen (PT) sind eine Gruppe von Enzymen, die die Kettenverlängerung von Allyldiphosphat unter Verwendung von Isopentenyldiphosphat (IPP) über mehrere Kondensationsreaktionen katalysieren. DHDDS (Dehydrodolichyldiphosphatsynthase) ist ein eukaryotisches langkettiges cis- PT (bildende cis -Doppelbindungen aus der Kondensationsreaktion), das die Kettenverlängerung von Farnesyldiphosphat (FPP, ein allylisches Diphosphat) über mehrere Kondensationen mit Isopentenyldiphosphat (IPP) katalysiert. DHDDS ist von biomedizinischer Bedeutung, da eine nicht-konservative Mutation (K42E) im Enzym zu Retinitis pigmentosa führt , was letztlich zur Blindheit führt. Daher wurde das vorliegende Protokoll entwickelt, um große Mengen an gereinigtem DHDDS zu erwerben, die für mechanistische Studien geeignet sind. Hier wurden die Verwendung von Proteinfusion, optimierten Kulturbedingungen und Codonoptimierung verwendet, um die Überexpression und Reinigung von funktionell aktivem humanem DHDDS in zu ermöglichen cis- PT unter verschiedenen Spezies deutet darauf hin, dass dieses Protokoll auch für andere eukaryotische cis- PT angewendet werden kann, wie jene, die an der Naturkautschsynthese beteiligt sind.
Einleitung
Prenyltransferasen sind eine Gruppe von Enzymen, die die Kettenverlängerung von Allyl-Diphosphat unter Verwendung von Isopentenyldiphosphat (IPP) über mehrere Kondensationsreaktionen 1 , 2 katalysieren. Z-Typ - Enzyme katalysieren die Bildung von cis - Doppelbindungen aus der Kondensationsreaktion, wohingegen E-Typ - Enzyme 3 trans - Doppelbindungsbildung katalysieren. Cis- Prenyltransferasen ( cis- PT, Z-Typ-Enzyme) werden klassisch nach ihrer Produktkettenlänge in kurzkettige (C 15 ), mittelkettige (C 50-55 ) und lang....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1 Klonierung von cis- PT zur Überexpression in E. coli
- Erhalten Sie den pET-32b-Expressionsvektor, der für die Klonierung und die Expression von Proteinsequenzen mit dem 109aa-Thioredoxin (TRX) -Protein 17 und der E. coli- Codon-optimierten 18- kodierenden Sequenz von Volllängen- cis- PT entwickelt wurde.
- Achten Sie darauf, dass eine TEV-Protease (Tabak-Ätzvirus-Protease) -Schnittstelle (ENLYFQ / G, wo "/" den Spaltpunkt anzeigt) 9, gefolgt von einem kurzen flexiblen Linker (SGSGSG, zur Erhöhung der Spaltungsstelle Zugänglichkeit) stromaufw....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Ein allgemeiner Überblick über das hier verwendete Konstrukt und den Reinigungsprozess sind in Abbildung 1 dargestellt . Die bei jedem Reinigungsschritt erhaltenen Proben sind in Fig. 2 gezeigt . Diese SDS-PAGE-Analyse zeigt die schrittweise Reinigung von DHDDS, was zu einem hochgereinigten Produkt führt. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der analytischen SEC des gereinigten Enzyms und zeigt, dass da.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll zur Reinigung von funktionellen humanen DHDDS in E. coli- Zellen ist einfach und effizient, so dass man das Protein in 3 - 4 Tagen überexprimieren und reinigen kann, sobald ein geeignetes Konstrukt vorliegt. Solche Protokolle für die Proteinreinigung sind bei den Durchbrüchen in der Genomsequenzierung von besonderer Bedeutung, die eine Fülle von Informationen über die Genetik vieler Krankheiten 18 lieferte und damit die Entwicklung von Hochdurchsatzmethode.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde gefördert durch das Zentrum für Forschungs-Exzellenz der Israelischen Wissenschaftsstiftung (I-CORE) in der Strukturzellbiologie (1775/12) und die Israelische Wissenschaftsstiftung 1721/16 und 2338/16 (YH) und 825/14 (DK ). Die Unterstützung der Fields Estate Foundation an DK wird sehr geschätzt. Diese Arbeit wurde von Ilan Edri und Michal Goldenberg in Teilerfüllung der MD-Thesis-Anforderungen der Sackler Fakultät für Medizin, Tel Aviv Universität durchgeführt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Kompetent E. coli (Hoher Wirkungsgrad) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-Superflow-Harz | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 Entsalzungssäule | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| Superdex-200 steigen um 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenylpyrophosphat | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesylpyrophosphat | Sigma | 44270-10MG |
Referenzen
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., K....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
