Methodenartikel

Eine effiziente und reproduzierbare Protokoll für Ablenkung Osteogenesis in einem Rattenmodell führt zu einer funktionalen regenerierten Femur

DOI:

10.3791/56433

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23. Oktober 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS, ISM, Inst Movement Sci, Aix Marseille Univ, 2Sainte-Marguerite Hospital, Institute for Locomotion, Department of Orthopaedics and Traumatology, APHM, 3Sainte-Marguerite Hospital, Institute for Locomotion, Department of Peadiatric Orthopaedics, APHM, 4Ecole centrale de Marseille, 5Faculté de Pharmacie, Laboratoire de Biochimie, 6Service Central de la Qualité et de l'Information Pharmaceutiques, APHM

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Studie beschreibt eine reproduzierbare und ausführliche Protokoll mit einem neu entwickelten Fixateur externe für Ablenkung Osteogenesis (tun) in einer femoralen Ratte Modell welche Genehmigungen physiologische Belastung durch das Tier nach der Entfernung der Fixateur externe.

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von einem neu entwickelten Fixateur externe für Ablenkung Osteogenesis in einem Rattenmodell femoral. Ablenkung Osteogenesis (DO) ist eine chirurgische Technik führt zu Regeneration nach eine Osteotomie Knochen. Osteotomized Extremitäten werden voneinander durch allmähliche Ablenkung verschoben, um die gewünschte Dehnung zu erreichen. Dieses Verfahren ist für untere und Obere Extremität Verlängerung, Behandlung nach einem Knochen Pseudarthrose oder die Regeneration von einem Knochendefekt nach der Operation für Knochen Tumor Exzision, sowie Kiefer-Wiederaufbau bei Menschen verbreitet. Nur wenige Studien zeigen deutlich die Effizienz ihrer Protokoll bei der Erlangung einer funktionalen regenerierten Knochen, d.h., Knochen, der physiologischen Belastung ohne Fraktur nach Entfernung von der Fixateur externe unterstützen wird. Darüber hinaus Protokolle für variieren und Reproduzierbarkeit ist begrenzt durch mangelnde Information, Vergleich zwischen Studien schwierig. Das Ziel dieser Studie war es, entwickeln eine reproduzierbare Protokoll umfasst eine entsprechende Fixateur externe Design für Ratte Glied Verlängerung, mit einer detaillierten chirurgische Technik, die physiologische Belastung durch das Tier nach der Entfernung der externen erlaubt Fixateur.

Einleitung

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Ablenkung Osteogenesis (DO) ist eine chirurgische Technik allgemein klinisch1,2,3,4 in Menschen für niedrigere1,2 und oberen3 Gliedmaßen Verlängerung verwendet, Behandlung nach einem Knochen Pseudarthrose oder die Regeneration von einem Knochendefekt nach der Operation für Knochen Tumor Exzision ebenso wie in MKG Wiederaufbau4. Führt zu Regeneration nach Auftragserteilung ein Fixateur externe in Knochen und Osteotomie Knochen zu tun. Osteotomized Extremitäten werden voneinander durch allmähliche Ablenkung2 verschoben, um die gewünschte Dehnung zu erreichen. Eine Konsolidierung folgt, während dessen gibt es keine weitere Dehnung.

Das-Verfahren gliedert sich in drei Phasen: Latenz, Ablenkung und Konsolidierung. Im Allgemeinen beginnt eine 7-Tage Wartezeit direkt nach Osteotomie4. Dies ermöglicht Knochen Reparatur den ersten Schritt der heilende Prozess4beginnen. Die Latenzzeit ist eine Ablenkung folgt wo Zugkräfte auf die regenerierten Kallus und umliegenden Weichteile1,2,4angewendet. Wenn die gewünschte Dehnung erreicht ist, beginnt stoppt der Ablenkung und der Konsolidierungsphase. Während dieser Zeit wird der Fixateur externe beibehalten, bis der regenerierte Knochen funktionell genug, um seine Entfernung zu unterstützen ist.

Verschiedene Parameter haben Einfluss auf Knochen Reparatur wie Länge und Rate der Verlängerung, Art der Fixateur externe, Häufigkeit der Ablenkung, Dauer der Konsolidierungsphase oder Art von mechanischem Stress auf die abgelenkt Kallus angewendet. Als Beispiel können die Geschwindigkeit und die Häufigkeit der Verlängerung vorzeitige Konsolidierung5 oder Unterbrechung des Prozesses führen, indem man nicht behebbare Schäden wie nekrotischen Gewebes oder Zysten in der Kallus6,7.

Viele-Protokolle wurden an den verschiedenen Tiermodellen8,9,10 , Knochen-Reparatur-Prozesse zu studieren und Knochen Konsolidierung zu maximieren. Bei Ratten die meisten Studien11,12,13,14,15 auf das-Protokoll zu verkürzen, indem Sie Kallus Konsolidierung beschleunigen konzentriert. Einige von diesen experimentellen Studien verwendet bereits im Handel erhältlichen externen Fixateure für menschliche klinische Anwendungen5,13,15,16. Diese Arten von Fixateur externe sind jedoch nicht geeignet für auf die Ratte Femur, das verschiedenen anatomischen Eigenschaften aus menschlichen Oberschenkelknochen ausstellt. Darüber hinaus zeigen nur wenige Studien deutlich die Effizienz ihrer Protokolle bei der Erlangung einer funktionalen regenerierten Knochen7,16. Es ist daher schwierig, die Ergebnisse aus verschiedenen Studien aufgrund ihrer unterschiedlichen Protokollen und Mangel an Informationen über die externen Fixateur12,13,14,17zu vergleichen.

So war das Ziel der vorliegenden Studie zu beschreiben, in einem Rattenmodell eine effiziente und reproduzierbare Protokoll für auf das Femur, der zu einem funktionalen regenerierten Knochen führt. Zu diesem Zweck gestalteten wir eine hausgemachte und easy-to-Use Fixateur externe vor allem für die Ratte Femur, die wir in diesem Protokoll ausführlich beschrieben haben. Bei der Ausarbeitung der technischen Spezifikationen für dieses Gerät, haben wir berücksichtigt alle grundlegenden Abhängigkeiten für eine gute Verteilung der mechanischen Belastungen und die Produktion von Eigenspannungen zu vermeiden. Die technische Spezifikation enthalten eine entsprechende Geometrie für das Gerät um reine Zugkraft auf Knochen und das umliegende Gewebe zu ermöglichen, ein entsprechendes Gewicht für die Gangart des Tieres, die Kontrolle über die Länge der Knochen Dehnung und eine gute Ausrichtung der Knochen-Segmenten ohne Produktion von Scherbeanspruchung an der Kreuzung von Pins und Knochen. Darüber hinaus hatte dieses Gerät ohne Sedierung des Tieres während der Ablenkung, biokompatibel und sterilisierbar ohne Schaden verwendet werden. Nach 7 Wochen der Konsolidierung führte dieses Protokolls für auf die Ratte Femur zu einem funktionalen regenerierten Knochen, nachgewiesen durch physiologische Belastung ohne Fraktur des regenerierten Kallus die Tiere nach der Entfernung der Fixateur externe. Der physiologische Gang der Tiere stand im Einklang mit architektonischen Parameter von Mikro-CT-Analyse der regenerierten Kallus und Röntgenstrahlanalyse erhalten.

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Protokoll

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alle beschriebene Verfahren wurden von der Universität Aix-Marseille institutionelle Tier Pflege und Verwendung Ausschuss und dem französischen Forschungsministerium genehmigt und durchgeführt in der konventionellen Tierhaus der medizinischen Fakultät Marseille ( Frankreich).

1. definieren funktionalen Spezifikationen von der externen Fixateur anhand der folgenden Richtlinien

  1. optimieren Knochen Anchorage.
    1. Implantat-Hälfte-Thread Stifte mit einem Durchmesser von 1 mm (von der Gewindeabschnitt).
  2. Wählen Sie ein Design, Beschwerden für das Tier zu reduzieren.
    1. Wählen Sie ein Fixateur externe eine kleine Größe, die in einem Volumen von 7.723 mm 3 (32 x 19 x 12,7 mm) passt.
    2. Wählen Sie ein Fixateur externe mit niedrigem Gewicht, weniger als 13 g ohne Stifte, um nicht zu stören die Tiere ' Gang. Wählen Sie Aluminium als Material für die beiden Blöcke aufgrund seiner geringen Dichte.
      Hinweis: Die Fasen der Blöcke erheblich verringern das Gewicht der beiden Teile.
  3. Die Bewegung des Fixateurs zu kontrollieren, so dass die Richtung der Zugkraft parallel zur Richtung des Knochens beibehalten wird und sorgen für reine Zugkräfte.
    1. Verwendung einer gleitenden bar, durchläuft die beiden Blöcke. Groove und öffnen Sie die Blöcke so jeweils zwei Stifte tragen.
    2. Verwenden eine Dehnung Schraube mit einer glatten Seite, die im Block frei dreht und kann mit den Fingern und mit einem Gewinde, die den zweiten Block verdrängt durch Rotation gegriffen werden. Zwei Stifte bis auf die Knochen, auf jeder Seite der Fraktur, um die Richtung der Zugkraft parallel zur Richtung des Knochens zu halten zu verankern. Pflegen Sie die Zugkräfte in der Längsachse um gute Verteilung des Druckes auf die Pins zu ermöglichen. Sichern Sie die vier Stifte mit Feststellschrauben.
  4. Wählen Sie Materialien wie Aluminium, Titan und Stahl, die Sterilisation Temperaturen standhalten kann.
  5. Stellen Sie sicher, dass Pinplatzierung Fixateur externe Geometrie entspricht ( Abbildung 1 -B).
    1. Verwenden eine bohrende Anleitung, die enthält eine Klemme auf den Knochen weiterhin die Bohrposition festgezogen.
    2. Verkürzen den Hebelarm der Klemme für geringe Spannkraft. Positionieren Sie die Klammer in der Mitte des Geräts, über die zukünftige Fraktur, um die Seiten zu löschen.
  6. Machen die Ablenkung einfach manuell anpassen, indem Sie hinzufügen eine Rändelschraube zum festziehen und lösen des mobilen Blocks.
    1. Verwenden Sie eine Schraube breit genug, um mit den Fingern allein manipulieren.
    2. Fügen Sie eine gebohrte Vierkantmutter in der Mitte der Dehnung Schraube zwischen den beiden Blöcken erlauben einfach Ablenkung.
    3. Machen diese Vierkantmutter (8 mm auf jeder Seite) größer als die beiden Blöcke erlauben manuelle Nutzung mit einem dünnen Stift oder jede Art von Objekt. Umdrehung der Schraube ¼ drehen erlauben eine Verlängerung von 0,125 mm.

2. Operation

Hinweis: Assistent ist für alle chirurgischen Eingriffe erforderlich. Vier 12 Wochen alten männliche Sprague-Dawley Ratten ein Standardlabor Diät Ad Libitum gefüttert wurden.

  1. Chirurgische Werkzeuge.
    1. Die folgenden chirurgischen Instrumente sterilisieren: 1 Rugine, 2 Senn ' s Retraktoren, 1 Mikro Olsen-Hegar-Nadelhalter, 1 Nadelhalter Mayo-Hegar, 1 Mayo Schere und Skalpell 1.
    2. Sterilisieren der Fixateur externe, die Bohren Anleitung, 4 halbe Gewinde Stifte, 4 Schrauben, die Spitze und die Zeichenfolge aus der Bohrer und die Spitze und die Zeichenfolge aus dem Piezotome. Diese Instrumente durch Autoklavieren bei 135 ° C für 18 Minuten sterilisieren
    3. Installieren Sie ein Heizkissen unter den sterilen Bereich, auf den OP-Tisch. Legen Sie alle Instrumente oder Werkzeuge auf ein weiteres Sterilbereich.
  2. Anesthetize und das Tier vorbereiten.
    1. Wiegen die Ratte zur Vorbereitung der Narkose und die schmerzstillende Mischung
    2. bestimmen und berechnen Sie die Menge des Bupremorphine und Carprofen die schmerzstillende Mischung aus dem Stegreif vorzubereiten. Verwenden Sie Buprenorphin (0,03 mg/mL) und Carprofen (5 mg/mL) bzw. 0,05 mg/kg und 5 mg/kg
    3. Zurückhalten die Ratte und subkutan injizieren die schmerzstillende Mischung. warten ein paar Sekunden, dann Spritzen intraperitoneal die Narkose Mischung.
    4. Die richtige Hind Gliedmaßen mit einen elektrischen Rasierapparat Rasieren und desinfizieren Sie das Glied mit Povidon-Jod-Lösung.
    5. Lag das Tier seitlich (rechts oben) auf den sterilen Bereich zu ermöglichen, die richtige Positionierung der Fixateur externe entlang der Achse Mediolateral.
    6. Legen Sie eine sterile Kompresse auf den Kopf, seine Augen während der Operation zu schützen.
  3. Implantat der Fixateur externe im Femur.
    1. Wahrzeichen der Hautschnitt. Zeichnen Sie mit einem Stift einen Punkt aus dem distalen Teil (Knie) und einen zweiten Punkt im proximalen Teil (Hüfte) nach der Mittellinie in der Sagittalebene. Zeichnen Sie eine Linie zwischen diesen Punkten 2.
    2. Die gespannte Haut entlang der Zeichnung mit einem Skalpell einzuschneiden.
    3. Schneiden zwischen den Bizeps Femoris und Vastus Lateralis, bis das Femur voll, mit Hilfe eines Skalpells ausgesetzt ist. Verwenden Sie die 2 Senn ' s Retraktoren (erfordert möglicherweise einen Assistenten), den Muskel-Schnitt zu erleichtern.
    4. Heben das Periost und trennen Sie die Weichteile vom Knochen mit Hilfe von einem Rugine.
    5. Prüfen, ob die freiliegenden Oberschenkel lang genug ist.
      1. Stifte im proximalen und distalen Löcher von der Fixateur externe einfügen.
      2. Position der Fixateur externe und überprüfen Sie, ob beide Pins in den Oberschenkelknochen verankert werden können.
    6. Implantat 4 parallel 1 mm halb-Thread Stifte im Femur.
      1. Nehmen Bohr Führer und auseinander zu bewegen, die Muskeln mit 2 Senn ' s Retraktoren. Ziehen Sie die Klammer des Handbuchs Bohrung in der Mitte des Femur.
      2. Pre-Löcher bohren 4 im Femur. Bohren Sie Löcher mit einer Geschwindigkeit von 2.000 u/min mit einer elektrischen Bohrmaschine, indem man einem Metall Bohrer von 0,6 mm Durchmesser durch die Löcher 4 Leitfaden.
        1. Start mit den proximalen und distalen Löcher und Finish mit den beiden mittleren diejenigen des Leitfadens. Seien Sie vorsichtig durch beide Cortex gehen aber nicht zu beschädigen das weiche Gewebe direkt unter dem Femur.
      3. Ausziehen der Bohrungen Guide.
      4. Vergrößern die 4 Pre-Löcher mit 0,8 mm halb-threaded Pin.
        1. Arbeit den Stift hin und her durch die 0,6 mm Löcher. Seien Sie vorsichtig senkrecht auf das Femur und Waschbecken durch beide Cortex bleiben.
      5. Implantat 1 mm halb-Thread Stifte.
        1. Griff die 1 mm halb-Thread Stecknadelkopf mit einem Nadelhalter.
        2. Sinken die Pin ein, um die Pre-Loch zu vergrößern. Überprüfen Sie, ob die Stifte beide Cortex dringen und nicht mehr als 1 mm, mit einem Senn ragen ' s Retraktor.
      6. Der Fixateur externe an den 4 halbe Gewinde Pins zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass der Versatz (Abstand zwischen der Fixateur ' s zwei Blocks und der Knochenoberfläche) ist etwa 6 mm erlauben einfache Stiche und gute Steifigkeit des Systems 18.
      7. Die 4 Befestigungsschrauben zu sichern, so dass der Fixateur externe an den Pins gesperrt ist.
  4. Osteotomize Femur.
    1. Führen eine Osteotomie zwischen den 2 zentrale Pins mit einem Piezotome.
    2. Schließen die woUnd mit einem kontinuierlichen Stich mit einem resorbierbaren Naht Thread (5.0) und Nadelhalter Mayo-Hegar. Achten Sie darauf, nur die Haut wird genäht, und nicht die Muskeln.
  5. Chirurgie und Monitor Tiere zu überprüfen.
    1. Führen eine Röntgenaufnahme nur nach der Operation, während das Tier noch betäubt ist. Prüfen Sie die Tiefe von allen Pins und die osteotomized Extremitäten orientieren sich nach der langen Achse.
    2. Stellen Sie sicher Analgesie und Antibioprophylaxy durch subkutane Injektion von Buprenorphin (0,03 mg/mL) und Enrofloxacine (50 mg/mL) bzw. bei 0,05 mg/kg und 10 mg/kg.
    3. Bestimmen und berechnen die Höhe der Antipamezole, die Narkose rückgängig zu machen. Antipamezole bei 1mg/kg zu verwenden und eine subkutane Injektion um die Anwendung des Arzneimittels zu tun. Dass das Tier Bewusstsein wieder zu erlangen und wieder in seinen Käfig.
    4. Sechs Stunden nach der Operation eine zweite Dosis des Gemisches Analgesie (Buprenorphin und Carprofen) bzw. bei 0,05 mg/kg und 5 mg/kg subkutan injiziert.
      Für die nächsten geben 3 Tage mindestens, diese Injektionen für die Analgesie Mischung zweimal täglich und einmal pro Tag für die Antibioprophylaxy. Regelmäßige klinische Untersuchungen müssen durchgeführt werden, um die Effektivität der Analgesie und müssen je nach Verhalten Anzeichen eines jeden Tieres geändert werden.
    5. Check, die die Tiere mit ihren Betrieben Hind Gliedmaßen normalerweise am Tag nach der Operation gehen kann.

3. Ablenkung

  1. verlassen der Fixateur externe im Leerlauf Fixierung für 1 Woche. X-ray das Glied am Ende dieser Phase. Die Positionierung der Stifte und die Ausrichtung der Knochen Segmente.
  2. Manuell Vierkantmutter eine halbe Umdrehung (0,25 mm) im Uhrzeigersinn drehen alle 12 h um die Ablenkung durchzuführen. Für 10 Tage, die zu einer 5 mm Knochen Verlängerung repräsentieren eine 12 führen sollte % bezogen auf die ursprüngliche Länge des Segments operierten Knochen Verlängerung abzulenken.
    1. Nicht das Tier während dieses Schrittes zu betäuben. X-ray das Glied halb durch und am Ende dieser Periode, die Positionierung der Pins und Ausrichtung der Knochen Segmente.
  3. Der Fixateur externe für 47 Tage zu erhalten. Röntgen der Gliedmaßen wöchentlich um den Fortschritt der abgelenkt Spalt Verkalkung überprüfen. Am Tag 64 der Fixateur externe und lassen Sie die Tiere Wanderung frei für 2 weitere Tage (Tag-66). Die vollständige Konsolidierung dauert 7 Wochen.
  4. Alle Ratten nach 7 Wochen der Konsolidierung mit einer Überdosis von inhalativen Sevofluran einschläfern.
  5. Abgelenkte und kontralaterale Oberschenkelknochen ohne das umliegende Gewebe zu resezieren.
    1. Gelegen machen einen Hautschnitt auf der Narbe auf der Mittellinie nach der Sagittalebene mit Hilfe eines Skalpells. Laufen den Schnitt von oben von der Hüfte an der Vorderseite des Knies.
    2. Schneiden zwischen den Bizeps Femoris und Vastus Lateralis mit einem Skalpell, bis das Femur voll ausgesetzt ist. So viel wie möglich, trennen Sie die Muskeln mit den Knochen verbunden.
    3. Schneiden Sie die Bänder des Knies und die Artikulation zu demontieren.
    4. Schneiden die Gelenkkapsel des Hüftgelenks.
    5. Den Knochen gründlich reinigen, ohne die Hälfte-Thread Pins. Das weiche Gewebe mit einem Skalpell entfernen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte von 3.5.1 auf 3.5.5 für die kontralateralen Femur.
  7. X-ray abgelenkte und kontralaterale Oberschenkelknochen. Entfernen Sie die 4 halbe Gewinde Pins und lagern alle Oberschenkelknochen bei-20 ° C für Mikro-CT-Scan Analyse (10 µm Auflösung).

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Ergebnisse

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Die Röntgen-Aufnahmen aus dem Ende des chirurgischen Eingriffs bis zum Ende der Konsolidierung zeigten keine Lockerung der Hälfte-Thread Pins im Femur, stabile Verankerung angibt. Die Stifte wurden parallel und am besten erhaltenen. Die osteotomized Extremitäten waren gut abgestimmten entlang der Längsachse des Knochens bei der (Abbildung 2). Am Ende der Latenzzeit waren keine verkalkte Bereiche sichtbar ist (Abbildung 2B...

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Diskussion

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Diese Studie beschreibt eine reproduzierbare Protokoll umfasst eine entsprechende Fixateur externe Design für Ratte Glied Verlängerung, mit einer detaillierten Operationstechnik, die physiologische Belastung durch das Tier nach der Entfernung der externen Fixateur ermöglicht. Unsere-Protokoll führte zu einem funktionalen regenerierten Knochen. Nach 47 Tagen der Konsolidierung Entfernung von der hausgemachten Fixateur externe und 2 Tage der physiologischen Belastung durch das Tier nicht dazu veranlassen, Fraktur des regen...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt und finanziert von der CNRS Mecabio Herausforderung.

Die Autoren danken den Tierpflege-Techniker für die Betreuung der Tiere während des Verfahrens. Die Autoren erkennen auch IVTV Stadtzentrum von Lyon, durch Thierry Hoc. Dank Marjorie Sweetko Sprache Überarbeitung.

Wir sind dankbar für Marylène Lallemand, Cécile Génovésio und Patrick Laurent für ihren Beitrag zu dieser experimentellen Studie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ké taminRenaudin578 540-2Versorgung durch den Tierstall
Mé dé tomidinVirbac6799091Versorgung durch Ställe
SevofluraneCentravet567 477-2Lieferung durch Ställe
BuprenorphinIndivor Frankreich3400932731060Lieferung durch Ställe
EnrofloxacineChannelPharmaceutical FacturingFR/V/4955220Lieferung durch Ställe
PiezotomeSatelec ActeonF57510
Heizkissen für HaustiereTherasageAL8365936Versorgung durch den Tierstall
Dental X-rayS.A.R.L Innovation mé dicales et dentairesWYZ - BLUEX
Winiwix SoftwareSoftys DentalPFT
Micro-CT SystemnanoScan SPECT/CTGEIT-31105EN (05/14)Unterauftrag durch IVTV Zentrale Lyon
Micro-CT Analyse Softwarephoenix datos X2 RekonstruktionkeineFreie Software
ElektrorasiererBrawnGT415Lieferung durch Tierhaus
Senn' s RetraktorenWord Precision Instruments501718Blunt Version
Betadine SolutionMundipharma Medical CompanyD08AG02Lieferung durch Tierstall
Resorbierbarer Nahtfaden (5.0)EthiconJV1023Lieferung durch Tierstall
RugineWord Precision Instruments503406
Mayo-Hegar NadelhalterWord Precision Instruments
MetallbohrerBeuterlockV020944018003
Micro Olsen-Hegar NadelhalterWord Precision Instruments501989
Mayo SchereWord Precision Instruments501752
SkalpellWord Precision Instruments500236
Sprague-DawleyJanvierkeine12 schwach und männlich
V503382

Referenzen

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Distraction OsteogenesisRat ModelExternal FixatorFemoral LengtheningBone RegenerationSurgical TechniqueOsteotomy ProcedurePin FixationX ray ImagingMicro CT Analysis

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