Method Article

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

DOI:

10.3791/56474

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November 15th, 2017

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1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

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Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Abstract

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Viele außergewöhnliche Fortschritte wurden in der Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomics, mit bestimmten technischen Fortschritte in der Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und isobare Kennzeichnung multiplexing Kapazität. Hier stellen wir eine tief-Proteomics Profilerstellungs-Protokoll, die 10-Plex Tandem Masse Tag (TMT) Kennzeichnung mit einem umfangreichen LC/LC-MS/MS-Plattform und Korrektur der Post-MS numerische Störungen genau ganze Proteome quantitate kombiniert. Dieses Protokoll enthält die folgenden Hauptschritten: Proteingewinnung und Verdauung, TMT Kennzeichnung, 2-dimensionale (2D) LC, hochauflösende Massenspektrometrie und computergestützte Datenverarbeitung. Qualitätskontrolle-Schritte sind für die Fehlersuche und Auswertung experimenteller Variation enthalten. Mehr als 10.000 Proteine in Säugetieren Proben können getrost mit diesem Protokoll quantitated. Dieses Protokoll kann auch auf die Quantifizierung der post-translationalen Modifikationen mit geringfügigen Änderungen angewendet werden. Diese gebündelte, robuste Methode ist ein leistungsstarkes Tool für die Proteomik-Analyse in einer Vielzahl von komplexen Proben, einschließlich Zellkultur, tierischen Geweben und menschlichen klinischen Proben.

Introduction

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Next Generation Sequencing technologische Fortschritte führten zu einer neuen Landschaft für die Untersuchung biologischer Systeme und Krankheit beim Menschen. Dies hat eine große Anzahl von Messungen des Genoms, Transkriptom, Proteom, Metabolom und andere molekulare Systeme greifbar werden erlaubt. Massenspektrometrie (MS) ist eine der empfindlichsten Methoden in der analytischen Chemie und ihre Anwendung in der Proteomik expandierte schnell nach der Sequenzierung des menschlichen Genoms. In der Proteomik haben die letzten Jahren erhebliche technische Fortschritte in der MS-basierten quantitativen Analysen, einschließlich Isobaren Kennzeichnung und multiplexing Fähigkeiten kombiniert mit umfangreichen Flüssigchromatographie, neben Instrumentierung ergab. Vorschüsse, ermöglicht schnellere und genauere Messungen mit weniger Probenmaterial erforderlich. Quantitative Proteomik geworden ein mainstream-Ansatz für die Profilerstellung Zehntausende von Proteinen und posttranslationale Modifikationen im sehr komplexen biologischen Proben1,2,3,4 , 5 , 6.

Gemultiplexten isobare Kennzeichnung Methoden wie isobare Tag für relative und absolute Quantifizierung (d.h. iTRAQ) und Tandem-Massen-Tag (TMT) MS haben stark verbesserte Probendurchsatz und stieg die Zahl der Proben, die in einem einzigen analysiert werden können 1,6,7,8zu experimentieren. Zusammen mit anderen MS-basierte Quantifizierung Methoden wie markierungsfreie Quantifizierung und stabilen Isotop Etikettierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (d.h.SILAC), das Potenzial dieser Techniken in der Proteomik ist Feld beträchtliche9 ,10,11. Die TMT-Methode erlaubt zum Beispiel 10 Proteinproben zusammen mit 10-Plex-Reagenzien 1 Experiment analysiert werden. Diese baugleichen TMT-Tags haben die gleiche allgemeine Masse, aber schweren Isotope sind differentiell verteilt auf Kohlenstoff oder Stickstoff-Atome, wodurch eine einzigartige Reporter Ion während MS/MS Zersplitterung der einzelnen Tags, damit die relative Quantifizierung zwischen den 10 Proben. Die TMT-Strategie wird routinemäßig angewendet, um Studium biologischer Signalwege, Krankheitsverlauf und zelluläre Prozesse12,13,14.

Wesentliche technische Verbesserungen haben Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-Systeme, sowohl in Bezug auf LC Trennungen und MS Parameter Proteinidentifikation zu maximieren, ohne Einbußen bei der Quantifizierung Genauigkeit verbessert. Erste Dimension Trennung von Peptiden durch eine Trennung Technik mit hoher Orthogonalität, die zweite Dimension ist entscheidend bei dieser Art der Schrotflinte Proteomics-Methode, um maximale Ergebnisse20zu erreichen. Hohem pH-Wert umgekehrt Phase flüssige Chromatographie (RPLC) bietet eine bessere Leistung als herkömmliche starke Kationenaustausch-Chromatographie20tut. Bei hohem pH-Wert RPLC-mit einer zweiten Dimension der Low-pH-RPLC-kombiniert wird, sind analytische Dynamikbereich und Protein Abdeckung verbessert wiederum die Möglichkeit, den Großteil der exprimierten Proteine zu identifizieren, wenn ganze Proteom Analysen15 durchführen, ,16,17,18. Andere technische Fortschritte sind kleine Partikel in C18 (1,9 µm) und lange Spalte (~ 1 m)19erweitert. Darüber hinaus sind andere bemerkenswerten Verbesserungen neue Versionen von Massenspektrometern mit schnellen Abtastraten, verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung20und anspruchsvolle Bioinformatik Pipelines für MS Data Mining21.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das die neuesten Methoden mit Änderungen zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Durchsatz, während der Fokussierung auf Qualität Kontrollmechanismen in das Experiment beinhaltet. Das Protokoll enthält Proteingewinnung und Verdauung, TMT 10-Plex Kennzeichnung, grundlegende pH-Wert sauren pH-Wert RPLC-Fraktionierung, hochauflösende MS-Detektion und MS Datenverarbeitung (Abbildung 1). Darüber hinaus realisieren wir mehrere Qualitätskontrolle Schritte zur Fehlerbehebung und Auswertung experimenteller Variation. Dieses ausführliche Protokoll soll helfen Forschern neu auf dem Gebiet routinemäßig zu identifizieren und genau quantitate Tausende von Proteinen aus einem lysate oder Gewebe.

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Protocol

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Vorsicht: konsultieren Sie bitte vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (d.h., MSDS). Nutzen Sie alle entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung dieses Protokolls.

Hinweis: TMT 10-Plex isobare Reagenz Beschriftungssatz dient in diesem Protokoll für das Proteom-Quantifizierung von 10 Proben.

1. Vorbereitung der Zellen/Gewebe

Hinweis: Es ist entscheidend für die Proben in kürzester Zeit zu sammeln, bei niedriger Temperatur, Proteine in ihrem ursprünglichen biologischen Zustand zu halten.

  1. Wash adhärente Zellen (z. B. HEK-293-Zellen) auf einem 10 cm Teller zweimal mit 10 mL Eis kalt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Kratzen und Zellen (~ 2 x 10 6-Zellen) in 1 mL PBS zu sammeln. Übertragen auf 1,5 mL Tuben und entfernen Sie PBS nach Zentrifugation bei 600 X g für 5 min bei 4 ° C. Store Zelle Pellets bei-80 ° C bis Lyse.
    Hinweis: Ein Pilotversuch wird häufig durchgeführt, um Proteinausbeute zu untersuchen. Ca. 1 mg Proteine extrahiert werden kann von 10 x 10 6 Säugerzellen oder aus einer 15 cm Platte mit 80 % Zusammenfluss.
  2. Lyse Alternativ adhärente Zellen auf ihrem Teller durch Zugabe von Lyse Puffer direkt auf die Platte nach dem Waschen. Lysates in 1,5 mL Röhrchen sammeln und verwenden Sie die Protokollbeschreibung in Schritt 2.5.
  3. Sammeln Aussetzung Zellen in 15 mL-Tuben, waschen zweimal mit 10 mL Eis kaltem PBS, übertragen in 1,5 mL Röhrchen und Zentrifugieren bei 600 X g, PBS zu entfernen. Die Wäsche Schritte vollständig um die gewünschte Konzentration der Lyse Puffer Zutaten herausnehmen Sie PBS. Zelle Pellets bei-80 ° C bis zur Lyse lagern.
  4. Sammeln und wiegen Gewebe schnell. Halten Sie Gewebe in flüssigem Stickstoff sofort nach Dissektion und Store bei-80 ° c
    Hinweis: Die Proteinausbeute von Geweben ist ca. 5 % bis 10 % des Gewichts Gewebe
  5. verwenden homogenes Gewebe Größen und anatomischen Regionen für die 10 Proben, um Probe Heterogenität zu reduzieren. Entfernen Sie Blut Verunreinigungen durch Spülen Proben zweimal mit 1 mL Eis kaltem PBS, sehr reichlich Blutproteine beeinflussen Protein Quantifizierung und nachgelagerten Datenanalyse zu vermeiden.

2. Proteingewinnung Qualitätskontrolle Western Blotting, In Lösung Verdauung und Peptid Entsalzung

Hinweis: Umgang mit jedem der 10 Proben die gleiche Weise bei jedem Schritt, bevor die Bündelung von TMT-markierten Proben wesentlich zu reduzieren ist Variation.

  1. Stellen Lyse Puffer (50 mM HEPES [pH 8,5] 8 M Harnstoff und 0,5 % Natrium Deoxycholate) am Tag des Experiments.
    Hinweis: Teilweise Protein-Denaturierung während der Probe Lyse betrifft Protein Verdauung Effizienz.
  2. Add Lyse Puffer, so dass das Verhältnis des Puffers zu Probenvolumen 10:1 und ~ 20 % der das Endvolumen von Glasperlen (0,5 mm Durchmesser) zu Zelle Pellets oder Gewebe (z. B. 10: 1 Volumenverhältnis zwischen Puffer und Proben) ist, die Erreichung eine endgültigen Proteinkonzentration von 5 bis 10 mg/mL. Halten Sie alle 10 Proben die gleiche Konzentration unter Berücksichtigung der Anzahl der verwendeten Zellen oder Gewebe Gewicht jeder einzelnen Probe.
  3. Pflegen Harnstoff-Konzentration auf 8 M durch Zugabe von Harnstoff in fester Form auf die Probe. Denken Sie daran, die das Volumen der Zelle Pellet oder Gewebe bei der Berechnung der Höhe der Harnstoff in fester Form hinzu, die Probe, die 8 M-Konzentration zu erreichen.
    Hinweis: UN-frische Harnstoff Puffer kann künstliche chemische Modifikation (d.h., Protein Carbamylation) einführen und sich negativ auf die Anzahl der Peptide identifiziert. Harnstoff nimmt eine erhebliche Volumen (100 mg Harnstoff belegt ~ 73 µL in Lösung).
  4. Halten der unlöslichen Rückstand in der lysate erlauben Verdauung der unlösliche Proteine 23.
  5. Lyse der Proben in einem Mixer bei 4 ° C mit Geschwindigkeit 8 für 30 s, Rest für 5 s, und wiederholen Sie 5 Mal oder bis die Proben homogenisiert werden. Die Proben können auch durch Vortexen für 30 lysiert s bei Raumtemperatur (RT) mit einem 30 s lang auf Eis ~ 10 Zyklen Kühlung. Anpassen der Lyse Bedingungen bei Bedarf je nach Probentyp.
  6. Mischen lysate Brunnen ohne Zentrifugation und 2 kleine aliquoten (~ 15 µL) machen. Verwenden Sie 1 Aliquot zur Maßnahme Proteinkonzentration und 1 aliquoten Positivkontrolle Validierung ausführen von western-Blot Analyse durchführen. Halten Sie die restlichen großen aliquoten für die Proteomik-Analyse.
  7. Maßnahme Proteinkonzentration durch einen standard Protein Quantifizierung Assay oder durch eine kurze Natrium Coomassie gefärbt Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gel (10 %) 22 mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard. Verwenden Sie einen BSA-Standard mit einem hohen Grad an Genauigkeit bekannter Konzentration. Um höchste Genauigkeit zu erreichen, führen Aminosäureanalyse der BSA Standard.
    Hinweis: Andere genaue Standards möglicherweise verfügbar. Die Proteinkonzentrationen können auch durch Anzahl Zellen oder Gewebe Gewichte geschätzt werden. Obwohl 1 mg Protein (100 µg/Probe) empfohlen wird, kann die Analyse durchgeführt werden, mit weniger als 100 µg Protein (10 µg/Probe).
  8. Add 100 % Acetonitril (ACN), eine Endkonzentration von 10 % ACN und LysC Protease zu einem Enzym-Substrat-Verhältnis von 1: 100 (w/w) zu verdauen Proteine unter höchst denaturierenden Bedingungen bei RT für 2 h 1 zu erreichen. Dithiothreitol (DTT) hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 mM zu reduzieren Disulfid-Bindungen in den Proteinen und 1H durchführen LysC Verdauung auf eine Endkonzentration von 7,2 M Harnstoff inkubieren.
  9. Verdünnen, 2 M Harnstoff mit 50 mM HEPES (pH 8,5) und weitere Digest Proben mit Trypsin bei RT für 3 h oder über Nacht an einem Trypsin zu Protein Verhältnis von 01:50 (w/w). Verwenden Sie ca. 2 µg von Trypsin für 100 µg Protein und einer Trypsin-Konzentration von ca. 10 ng/µL.
    Hinweis: Faktoren, die für die ineffiziente Trypsin-Verdauung führen können sind pH-Probleme, inaktive Trypsin oder die Verwendung eines ungeeigneten Verhältnisses des Enzyms zum Substrat.
  10. Fügen Sie DVB-t Ertrag 1 mM und weiter verringern Peptide für 2 h bei RT.
  11. Add Iodoacetamide (IAA), 10 mM zu erreichen. 30 Minuten im Dunkeln Cys-haltiger Peptide Alkylat bei RT inkubieren.
  12. Stillen nicht umgesetztes IAA durch Zugabe von DVB-t um 30 mM und 30 min bei RT inkubieren
  13. Überprüfen Sie die Effizienz der Trypsin-Verdauung durch die Untersuchung eine kleine aliquoten jeder Probe. Nach Angaben des Herstellers mit einer 10 µL Pipettenspitze mit Chromatographie Medien eingebettet im Totraum, entsalzen ' s-Protokoll. Analysieren Sie jede Probe von LC-MS/MS.-LC-MS/MS Parameter sind die gleichen wie in Schritt 5, mit der Ausnahme, dass die Steigung 10 min 23 beträgt.
  14. Mit 4 verpasste Spaltungen als Suchparameter ausführen eine Datenbanksuche für MS-raw-Daten (siehe Detail in Schritt 6).
    Hinweis: Wenn die Zahl der Spaltungen verpasst ist > 10 %, es möglicherweise unvollständig Trypsin-Verdauung. Dies wird sich negativ auf nachgelagerten Ergebnisse auswirken. Dies ist ein Schritt der kritischen Qualitätskontrolle (QC).
  15. Proben wieder zu verdauen, wenn die verpasste Spaltung ist > 10 % der Proben eine zusätzliche 10 µL von Trypsin hinzufügen.
  16. Ansäuern der Proben durch Zugabe von Trifluoroacetic Säure (TFA), 1 % Konzentration zu erreichen. Messen Sie den pH-Wert mit einem pH-Streifen. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert Wette istschen Sie 2 und 3. Tropfen mehr TFA klug (1 µL) so lange, bis der richtige pH-Wert erreicht wird.
  17. Zentrifuge bei 20.000 x g bei RT für 10 min und sammeln des Überstands.
  18. Waschen 0,5 bis 60 µg Kapazität Spin Spalten mit C18-Reverse-Phase-Harz mit 0,25 mL Methanol, wenn 100 µg Proben verwenden. Waschen von 0,03 bis 30 µg Kapazität Spin Spalten mit 0,25 mL 60 % ACN/0.1% TFA wenn 10 µg Proben verwenden. Zentrifugieren Sie Spin Spalten bei 500 X g für 30 s.
  19. Equilibrate Spalten mit 0,5 mL 0,1 % TFA und entfernen durch Zentrifugieren bei 500 X g für 30 s.
  20. Laden Proben auf Spalten und binden Proben an Spalten durch Zentrifugation bei 100 X g 3 Minuten lang oder bis die Spalte die Probe durchlaufen hat.
  21. Fügen Sie 0,5 mL 0,1 % TFA zu Spalten und Zentrifuge bei 500 X g für 30 s.
  22. Fügen Sie 125 µL 60 % ACN/0.1% TFA auf jede Spalte und eluieren durch Zentrifugieren bei 100 X g für 3 min. Vergewissern Sie sich die Lösung der Spalte durchlaufen hat.
  23. Trocknen die Eluenten in einem Vakuum Konzentrator. Sicherstellen Sie, dass die Proben sind absolut trocken und nicht flüssig bleibt in den Rohren. Shop bei-80 ° C bis zur weiteren Analyse.

3. TMT Kennzeichnung der Peptide

Hinweis: Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass alle Proben von TMT Reagenzien vollständig beschriftet werden. Mehrere Faktoren (z.B. Menge an TMT Reagenzien, pH-Wert und Genauigkeit der Protein Quantifizierung) beeinflussen TMT Kennzeichnung Effizienz, die sich negativ auf alle nachgeschalteten Ergebnisse verändern werden.

  1. Stellen jedes entsalzten Peptid Probe in 50 µL 50 mM HEPES-Puffer (pH 8,5). Den pH-Wert zu überprüfen und sicherzustellen, dass es zwischen 7 und 8.
    Hinweis: Möglicherweise Probe sauer, wenn nicht vollständig nach der Entsalzung Schritt getrocknet betreffen die Kennzeichnung Effizienz.
  2. ~ 1 µg der unbeschrifteten Samples für einen nachfolgenden TMT Kennzeichnung Effizienz Test halten, wie unter Punkt 3.3 beschrieben.
  3. TMT Reagenzien wasserfrei ACN auflösen und Peptid Proben zu kennzeichnen, indem Sie die folgenden Hersteller ' Anweisungen. Inkubieren Reagenzien bei RT für 1 h
  4. Führen einen QC TMT Kennzeichnung Effizienz Test durch Entsalzung ~ 1 µg jeder TMT beschriftet und -unbeschriftete Probe mit 10 µL Pipettenspitzen mit eingebetteten Chromatographie Medien laut Hersteller ' s-Protokoll. TMT-markierten und unmarkierten Proben von LC-MS/MS. analysieren
    Hinweis: LC-MS/MS-Parameter sind die gleichen wie in Abschnitt 5, mit der Ausnahme, dass die Steigung 10 min. beträgt
  5. Untersuchen die raw-Daten um sicherzustellen, dass die unbeschriftete Peptide in den beschrifteten Proben, vollständige Kennzeichnung Effizienz ( Abbildung 2) nicht erkannt werden. Tun Sie dies für 6 bis 10 separate Peptide, die Kennzeichnung Effizienz zu überprüfen.
  6. Die Reaktion durch Zugabe von 4 µL 5 % Hydroxylamin zu stillen und inkubieren Sie für 15 min.
  7. Mischen Sie eine kleine und gleiche Volumen (2 µL) Aliquot jeder Probe TMT beschriftet. Mit 10 µL Pipettenspitzen mit eingebetteten Chromatographie Medien entsalzen. Analysieren Sie die Proben von LC-MS/MS, wie unter Punkt 3.4 beschrieben. Verwenden Sie das Sprung-Software-Programm (ein Open-Source-Datenbank Suchalgorithmus, der Tandem-MS-raw-Dateien in einer Liste von Peptiden und Proteinen umgewandelt wird) zu bestimmen, die relative Konzentration-Verhältnis aller 10 Proben von TMT Tag Intensitäten aller identifizierten Peptide.
    Hinweis: Dieser QC Premix Verhältnis Test ist hilfreich, um das richtige Verhältnis zum gleich mischen vor der endgültigen Zusammenlegung zu bestimmen, wie Pipettieren Fehler auftreten können das ändert Konzentrationen und Protein Quantifizierung Schritt möglicherweise nicht immer korrekt. Es ist auch der beste Weg um sicherzustellen, dass die Menge des jeweils verwendeten für den finalen Mix 10 Proben sind alle auf eine gleiche Verhältnis wie in Schritt 3.5 beschrieben.
  8. Wiederholen Sie so oft wie nötig, um ein Verhältnis von 1:1 über alle 10 Proben zu erreichen.
  9. Mischen gleich 10 Proben nach den Ergebnissen der Premix-Verhältnis-Test. Anhand des Beispiels mit der niedrigsten Konzentration als Grundlinie, die Mengen der anderen 9 Proben anzupassen.
  10. Entfernen, die Nebenprodukte der abschrecken Reaktion der gepoolten TMT-Label Probe durch Entsalzung.
  11. Wash 1 mL Festphasen-Extraktion Kartuschen mit 50 mg pro Spalte mit 1 mL/0,25 mL Methanol Sorbens, wenn 100 µg Proben verwenden. Waschen von 0,5 bis 60 µg Kapazität C18 Spin Spalten mit 1 mL/0,25 mL 60 % ACN/0.1% TFA wenn 10 µg Proben verwenden. Zentrifugieren Sie Spalten bei 500 X g für 30 s.
  12. Equilibrate Spalten mit 0,5 mL 0,1 % TFA und entfernen durch Zentrifugieren bei 500 X g für 30 s.
  13. Laden Proben auf Spalten und binden durch Zentrifugation bei 100 X g für 3 min oder bis alle der Probe der Spalte durchlaufen hat.
  14. Fügen Sie 0,5 mL 0,1 % TFA zu Spalten und Zentrifuge bei 500 X g für 30 s.
  15. Fügen Sie 125 µL 60 % ACN/0.1% TFA auf jede Spalte und eluieren durch Zentrifugieren bei 100 X g 3 Minuten stellen Sie sicher alle die Lösung der Spalte durchlaufen hat.
  16. Trocknen die Eluenten in einem Vakuum Konzentrator. Sicherstellen Sie, dass die Proben sind absolut trocken und nicht flüssig bleibt in den Rohren. Shop bei-80 ° C bis zur weiteren Analyse.

4. Umfangreiche hochauflösende, Basic pH LC Prefractionation

  1. Satz 2 angeschlossenen C18 Spalten mit überbrückten Ethylen-Hybrid-Partikeln (4,6 mm x 25 cm, Höhe 50 cm; 3,5 µm Partikelgröße) und Einsatz ein Mikroliter Hochleistungs-LC Strömungspumpe für Fraktionierung.
    Hinweis: Die Verwendung von 2 Spalten Peptid Last erhöht und verbessert nicht unbedingt Chromatographie. Für Proben, die ≤ 200 µg von Peptiden, 1 Spalte reicht.
  2. Waschen die 100 µL Schleife mit späteren Ergänzungen von 300 µL von Methanol, Wasser und Puffer A (10 mM Ammonium-Formiat, pH 8,0).
  3. Waschen Sie die Spalten mit 100 µL ebenso gemischten Isopropanol, Methanol, ACN, und Wasser und equilibrate der Spalte in 95 % Puffer A für 2 h.
  4. Anderweitig entsalzten gepoolten TMT-Label Peptid Probe in 65 µL Puffer A. sicherstellen, dass der pH-Wert der Probe ~ 8.0 ist. Wenn immer noch sauer, verwenden Ammonium Hydroxid pH bis 8.0 anpassen.
  5. Fractionate Probe mithilfe des folgenden Farbverlaufs mit Puffer B (Puffer eine plus 90 % ACN): 15 % bis 20 % für 15 min, 20 % bis 35 % für 100 min und 35 % bis 50 % für 30 min. eingestellt Fraktionssammler, Brüche zu sammeln alle 2 min einschließlich Ladezeit. Die Durchflussmenge bis 0,4 mL/min eingestellt. Siehe Referenz 29 und Abbildung 1 für eine repräsentative Chromatogramm.
  6. Insgesamt 80 Brüche zu sammeln und trocknen 40 Fraktionen (alle anderen Bruch) mit Vakuum-Konzentrator, vollständige Trockenheit.
  7. Verwenden die 40 getrockneten Proben für LC-MS/MS-Analyse.
  8. Analysieren alle 80 Bruchteile von LC-MS/MS, ultra-tiefe Proteom-Abdeckung zu erreichen.

5. LC-MS/MS-Vorbereitung und Parameter

Hinweis: im TMT-basierte Quantifizierung Peptid-Ionen sind Isobare und erscheinen als 1 Masse in einem MS1-Scan. Jedoch sind sie abhängig von der Intensität der Reporter Ionen (10 einzigartige Reporter Ionen) in der MS/MS-Scan quantitated, nachdem das Peptid-Ion mit höherer Energie Kollision Dissoziation (HCD) fragmentiert wurde. Die TMT-Reporter Ion Verhältnisse können von Co Elution von TMT-Label Ionen 24 unterdrückt werden. Verengung der Ionen-Isolierung Fenster 25, Gasphase Reinigung 26, MultiNotch MS3 Methode 27 oder umfangreiche Fraktionierung mit mehrdimensionalen LC und lange Steigungen (4-8 h) 28 gibt es alternative Verfahrensweisen.

  1. Pack 75 µm Innendurchmesser (ID) leeren Spalten mit 1,9 µm C18 Harz auf 30 bis 40 cm Länge (~1.3 µL Bett Volumen).
  2. Heizen die Spalten bei 65 ° C mit einem Schmetterling-Portfolio-Heizung Gegendruck zu reduzieren und zu verhindern, dass über Druck auf die ultra-high-Druck Flüssigkeitschromatographie (UPLC) System. Rollen Sie die Spalte 2 bis 3 Mal innerhalb der Schmetterling-Heizung um sicherzustellen, dass die ganze Spaltenlänge Bett erhitzt wird. Kleben Sie die Spalte an der Innenseite des Heizgerätes man aufpassen, nicht über den Temperatursensor im Inneren der Heizung Band.
    Hinweis: Die Schmetterling-Portfolio-Heizung montiert und mit Klebeband auf ein maßgeschneidertes Stück Plexiglas an der XYZ-Bühne des Instruments befestigt ist.
  3. Vorbereitung einer (3 % Dimethyl Sulfoxid und 0,2 % Ameisensäure) Puffern und Puffer B (Puffer eine plus 67 % ACN) und waschen Sie die Spalten gründlich mit 95 % Puffer B. Dann voll equilibrate Spalten in 95 % Puffer A (mindestens 3-Spalten-Bände). Verwenden Sie einen Durchfluss von ~0.25 µL/min und Gegendruck von 280 bis 320 Bar
  4. Prüfen die Qualität der LC-MS/MS-System mit 100 ng der Ratte Gehirn Peptide (oder Standard unserer Wahl) zweimal, bevor die TMT-markierten Proben zu analysieren. Überprüfen Sie die folgenden Parameter häufig, um qualitativ hochwertige Datenerhebung zu gewährleisten: Umfrage MS Signalintensität (zwischen e8 und e9 für base Peak-Intensität), Qualität der MS/MS-Spektren (eine gute Darstellung von y und b-Ionen), Spitze Breite (12-22 s), allgemeine Verweilzeit LC-Systemdruck (Druckanstieg > 50 Bar weist auf eine schmutzige Spalte oder verstopfte Emitter Tipp), und Variabilität von Ausführung zu Ausführung (identische Gipfeln sollte < 30 s zwischen den Läufen).
    Hinweis: Um die in der Nähe von Isobaren Reporter Ionen der 10-Plex TMT Reagenzien (6,32 mDa Differenz) zu beheben, muss der MS/MS-Auflösung auf mindestens 30.000 bei 400 m/Z festgelegt werden. HCD dient in der Regel für TMT10-Plex Reporter Ion Fragmentierung, da es nicht die ein-Drittel-Regel unterliegt, die zur Kollision induzierte Dissoziation (CID) in Ionenfallen Instrumente gilt.
  5. Reinigen und die MS-Gerät regelmäßig kalibrieren und frischen LC-Puffer verwenden, um die Systemleistung zu verbessern.
  6. Rekonstruieren die getrockneten Peptide aus der grundlegenden pH-Trennung in 5 % TFA.
  7. ~0.2 µg auf die Spalte während fließende 5 % Puffer A. Laden
  8. Elute mit 15 % bis 45 % der Puffer B in 150 min. Als Ausgangspunkt, verwenden den folgenden Farbverlauf: Zeit 0, Puffer B 5 %; Zeit 2, Puffer B 15 %; Zeit 135, Puffer B 45 %, 145, Puffer B 70 %; und 150, Puffer B 95 % der Zeit. Passen Sie die Steigung etwas für frühe und späte basic pH RPLC-Brüche nach der Überprüfung Basis Peak Chromatogramme.
  9. Betreiben das Massenspektrometer in datenabhängiges Modus mit einem Umfrage-Scan in Ionenfallen Masse Analysator (400-1600 m/Z; 60.000 Auflösung; 1 x 10 6 automatische Gain Control (AGC) Ziel; 50 ms maximale Ion Zeit; und Schwerpunkt-Modus). Führen Sie 20 MS/MS hochauflösende Scans (60.000 Auflösung, 1 x 10 5 AGC Ziel ~ 100 ms maximale Ion Zeit, 35 HCD normalisiert Aufprallenergie, 0,4 m/Z Isolierung Fenster und 20 s dynamische Ausgrenzung).
    Hinweis: Electron Transfer Dissoziation (ETD) wird nicht für TMT10-Plex Reagenzien empfohlen da ETD Spaltstellen von HCD, unterscheiden was Reporter Ion Überlappung. Darüber hinaus ETD ist nicht effektiv, wie HCD weil tryptic Peptide in der Regel + 2 geladene Staaten erzeugen, und ETD effizienter bei höheren Ladungszustände ist.

6. MS-Datenanalyse

Hinweis: Wir beschreiben Datenanalyse mit dem JUMP-Programm. Datenanalyse kann jedoch mit anderen kommerziell verfügbar oder kostenlose Programme ausgeführt werden.

  1. Prozess raw-Dateien aus dem Massenspektrometer mit der Tag-basierten Hybrid Motor JUMP 21, verbindet eine Pattern-basierte Datenbanksuche und eine Tag-basierte de Novo Sequenzierung, Sensitivität und Spezifität zu verbessern suchen.
  2. Konvertiert Rohdaten zu MzXML formatieren und suchen MS2 Spektren gegen die Ziel-Lockvogel UniProt menschliche Datenbank (oder anderen geeigneten artspezifische Datenbank) zum Berechnen der false Discovery Rate (FDR).
  3. Sucht Perform mithilfe einer 10 ppm Masse Toleranz für Vorläufer und Fragment-Ionen. Anderen Such-Parameter soll vollständig folgen Einschränkung mit 2 maximale verpasste Spaltungen, 3 maximale Änderung Seiten pro Peptid und die Zuordnung von einem b und y-Ionen, die Peptide zu erzielen. Stellen Sie statische Änderungen an TMT Tags auf Lys Rückstände und N-Termini (+229.162 Da) und Carbamidomethylation von Cys-Rückständen (+57.021 Da). Legen Sie dynamische Änderungen an Met Oxidation gehören (+15.994 Da), das ist eine gemeinsame Peptid-Artefakt aus Probenbehandlung.
  4. Filtern von Daten durch die folgenden Kriterien: 7 Aminosäure minimale Peptid Länge, Genauigkeit m/Z (z. B. 5 ppm) und passenden Noten (J Partitur und DeltaCn). Gruppieren nach Peptid Länge, Trypticity, Peptide und Ladezustand.
  5. Verwenden ein zusätzliches Maß an Filtern nach passenden Partituren um Protein FDR auf unter 1 % zu reduzieren. Proteine, die von einem einzelnen spektralen Grafen identifiziert erfordern eine höhere Treffergenauigkeit.
  6. Für Peptide, die von mehreren Mitgliedern einer Proteinfamilie geteilt cluster die übereinstimmenden Protein-Mitglieder in Gruppe 1.
    Hinweis: Nach dem Prinzip der Sparsamkeit, der Konzern ist vertreten durch das Protein mit der höchsten Anzahl der zugewiesenen Peptide und andere Proteine einher, einzigartige Peptide 1.
  7. Proteine durch Summierung Reporter Ion zählt über alle übereinstimmenden Peptid Spektrum Spiele (PVSM) mithilfe eines Programms in den Sprung-Software-Suite integriert quantitate.
  8. Für jede PSM akzeptiert, extrahieren und korrigieren die TMT Reporter Ion Intensitäten nach der isotopischen Verteilung der Kennzeichnung Reagenzien und der Laden-Verzerrung, die aus den globalen PSM Quantifizierung Daten berechnet wird. Filtern Sie PVSM mit geringer Intensität und hohen Geräuschpegel mit Benutzer-definierten Schwellenwerte bei der Quantifizierung.
  9. Berechnen eine relative Signal zwischen jedem Reporter Ion und dem Durchschnitt aller 10 Reporter Ionen. Summe der relativen Signale der PVSM für die identifizierten Proteine. Absolute Signale durch Multiplikation der gemittelten Reporter Ion Intensität der Top 3 PVSM in entsprechenden Proteine diese relative Signale umwandeln.
  10. Verwenden eine Post-MS rechnerische Ansatz, Interferenzen. Geht man davon aus, dass die y 1 Ion Intensität proportional zur Intensität Reporter Ion, berechnet die lineare Beziehung von sauberen Scans und den Störpegel aus der kontaminierten y1ion Intensität laut Scans 23.
    Hinweis: Für die TMT-Label tryptic Peptide, K-TMT und R Rückstände sind 2 Arten von y 1 Ionen (376.27574 Da und 175.11895 Da bzw.) in MS2-Scans. Wenn nur 1 y 1 Ion erkannt wird und steht im Einklang mit den identifizierten Peptid, gilt die MS2 sauber Scan ( Abb. 3A). Wenn beide y1ions erkannt werden, gilt die MS2 lauten Scan.
  11. Das Protein Quantifizierung Werte in ein Tabellenkalkulationsprogramm zur weiteren Analyse exportieren. Verwenden Sie paarweise Vergleiche oder eine Analyse der Varianz, um Proteine zu identifizieren, die differentiell exprimiert werden.

7. MS-Datenüberprüfung

Hinweis: um die Qualität der MS Daten auszuwerten, mindestens 1 Methode der Validierung durchgeführt werden, bevor Sie fortfahren mit zeitraubenden biologische Experimente.

  1. Manuell untersuchen die MS/MS-Spektren zur Validierung der Peptidsequenz und TMT Reporter Ion Quantifizierung interessierender Proteine.
  2. Einsatz Protein Quantifizierung Daten bekannt, die MS-Ergebnisse zu bestätigen.
  3. Überprüfen Sie Eiweiß Änderungen mit Antikörper-basierten Ansätzen (z.B., übergehendeRN Blot und immunhistochemische Analysen).
  4. Chemisch synthetisieren die Peptide von Interesse und nutzen sie als interne Standards, um die Identifizierung von native Peptide bestätigen.
    Hinweis: MS/MS-Muster und Verweilzeit im LC-MS/MS sollten identisch sein.
  5. Überprüfen Sie Eiweiß Änderungen mit gezielt MS.

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Results

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Wir verwendet eine zuvor beschriebenen Cross-Arten Peptid-Mischung, um die Wirkung der Kompression Verhältnis in 3 großen Protokoll-Schritte, einschließlich pre-MS Fraktionierung, MS-Einstellungen und post-MS Korrektur23systematisch zu analysieren. Die pre-MS Fraktionierung wurde bewertet und optimiert mithilfe einer Kombination von grundlegenden pH RPLC und sauren pH-Wert RPLC. Für die post-MS Analyse galten nur artspezifische Peptide. Diese Störungen-Modell verwe...

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Discussion

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Wir beschreiben eine Hochdurchsatz-Protokoll für die Quantifizierung von Proteinen mit einer 10-Plex isobare Kennzeichnung Strategie, die erfolgreich in mehreren Publikationen12,13,14,32 umgesetzt worden . In diesem Protokoll können wir bis zu 10 verschiedene biologische Proteinproben in 1 Experiment analysieren. Wir können routinemäßig identifizieren und quantitate weit über 10.000 Proteine mi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Die Autoren danken allen anderen Lab und Anlage Mitgliedern für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, und gewährt ALSAC. Die MS-Analyse wurde in der St. Jude Children Hospital Proteomics Forschungseinrichtung, teilweise unterstützt von NIH Cancer Center Support Grant P30CA021765 durchgeführt. Die Autoren danken Nisha Badders um Hilfe bei der Bearbeitung der Handschrift.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1220 LC SystemAgilentG4288B
50% HydroxylaminThermo Scientific90115
AcetonitrilBurdick & JacksonAH015-4
Bullet BlenderNext AdvanceBB24-AU
Schmetterling Portfolio HeizungPhoenix S& TPST-BPH-20
C18 SpitzenHarvard Apparatur74-4607
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
AmeisensäureSigma94318
FraktionssammlerGilsonFC203B
GlasperlenNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
Iodacetamid (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
MethanolBurdick & JacksonAH230-4
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
MassenspektrometerThermo ScientificQ Exactive HF
nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
ReproSil-Pur C18 Harz, 1,9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Self Pck SäulenNeues ObjektivPF360-75-15-N-5
NatriumdesoxycholatSigma30970
SpeedvaThermo ScientificSPD11V
TMT 10plex Reagenz mit isobarer MarkierungThermo Scientific90110
Trifluoressigsäure (TFA)Angewandte Biosysteme400003
TrypsinPromegaV511C
HarnstoffSigmaU5378
Xbridge Säule C18 SäuleWasser186003943
Ziptips C18MilliporeZTC18S096
SepPak 1cc 50mgWasserWAT054960

References

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