Method Article

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

DOI:

10.3791/56474

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November 15th, 2017

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1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

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Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Abstract

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Viele außergewöhnliche Fortschritte wurden in der Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomics, mit bestimmten technischen Fortschritte in der Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und isobare Kennzeichnung multiplexing Kapazität. Hier stellen wir eine tief-Proteomics Profilerstellungs-Protokoll, die 10-Plex Tandem Masse Tag (TMT) Kennzeichnung mit einem umfangreichen LC/LC-MS/MS-Plattform und Korrektur der Post-MS numerische Störungen genau ganze Proteome quantitate kombiniert. Dieses Protokoll enthält die folgenden Hauptschritten: Proteingewinnung und Verdauung, TMT Kennzeichnung, 2-dimensionale (2D) LC, hochauflösende Massenspektrometrie und computergestützte Datenverarbeitung. Qualitätskontrolle-Schritte sind für die Fehlersuche und Auswertung experimenteller Variation enthalten. Mehr als 10.000 Proteine in Säugetieren Proben können getrost mit diesem Protokoll quantitated. Dieses Protokoll kann auch auf die Quantifizierung der post-translationalen Modifikationen mit geringfügigen Änderungen angewendet werden. Diese gebündelte, robuste Methode ist ein leistungsstarkes Tool für die Proteomik-Analyse in einer Vielzahl von komplexen Proben, einschließlich Zellkultur, tierischen Geweben und menschlichen klinischen Proben.

Introduction

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Next Generation Sequencing technologische Fortschritte führten zu einer neuen Landschaft für die Untersuchung biologischer Systeme und Krankheit beim Menschen. Dies hat eine große Anzahl von Messungen des Genoms, Transkriptom, Proteom, Metabolom und andere molekulare Systeme greifbar werden erlaubt. Massenspektrometrie (MS) ist eine der empfindlichsten Methoden in der analytischen Chemie und ihre Anwendung in der Proteomik expandierte schnell nach der Sequenzierung des menschlichen Genoms. In der Proteomik haben die letzten Jahren erhebliche technische Fortschritte in der MS-basierten quantitativen Analysen, einschließlich Isobaren Kennzeichnung und multiplexing Fähig....

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Protocol

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Vorsicht: konsultieren Sie bitte vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (d.h., MSDS). Nutzen Sie alle entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung dieses Protokolls.

Hinweis: TMT 10-Plex isobare Reagenz Beschriftungssatz dient in diesem Protokoll für das Proteom-Quantifizierung von 10 Proben.

1. Vorbereitung der Zellen/Gewebe

Hinweis: Es ist entscheidend für die Proben in kürzester Zeit zu sammeln, bei niedriger Temperatur, Proteine in ihrem ursprünglichen biologischen Zustand zu halten.

  1. Wash adhärente Zellen (z. B. HEK-293-....

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Results

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Wir verwendet eine zuvor beschriebenen Cross-Arten Peptid-Mischung, um die Wirkung der Kompression Verhältnis in 3 großen Protokoll-Schritte, einschließlich pre-MS Fraktionierung, MS-Einstellungen und post-MS Korrektur23systematisch zu analysieren. Die pre-MS Fraktionierung wurde bewertet und optimiert mithilfe einer Kombination von grundlegenden pH RPLC und sauren pH-Wert RPLC. Für die post-MS Analyse galten nur artspezifische Peptide. Diese Störungen-Modell verwe.......

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Discussion

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Wir beschreiben eine Hochdurchsatz-Protokoll für die Quantifizierung von Proteinen mit einer 10-Plex isobare Kennzeichnung Strategie, die erfolgreich in mehreren Publikationen12,13,14,32 umgesetzt worden . In diesem Protokoll können wir bis zu 10 verschiedene biologische Proteinproben in 1 Experiment analysieren. Wir können routinemäßig identifizieren und quantitate weit über 10.000 Proteine mi.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Die Autoren danken allen anderen Lab und Anlage Mitgliedern für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, und gewährt ALSAC. Die MS-Analyse wurde in der St. Jude Children Hospital Proteomics Forschungseinrichtung, teilweise unterstützt von NIH Cancer Center Support Grant P30CA021765 durchgeführt. Die Autoren danken Nisha Badders um Hilfe bei der Bearbeitung der Handschrift.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1220 LC SystemAgilentG4288B
50% HydroxylaminThermo Scientific90115
AcetonitrilBurdick & JacksonAH015-4
Bullet BlenderNext AdvanceBB24-AU
Schmetterling Portfolio HeizungPhoenix S& TPST-BPH-20
C18 SpitzenHarvard Apparatur74-4607
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
AmeisensäureSigma94318
FraktionssammlerGilsonFC203B
GlasperlenNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
Iodacetamid (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
MethanolBurdick & JacksonAH230-4
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
MassenspektrometerThermo ScientificQ Exactive HF
nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
ReproSil-Pur C18 Harz, 1,9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Self Pck SäulenNeues ObjektivPF360-75-15-N-5
NatriumdesoxycholatSigma30970
SpeedvaThermo ScientificSPD11V
TMT 10plex Reagenz mit isobarer MarkierungThermo Scientific90110
Trifluoressigsäure (TFA)Angewandte Biosysteme400003
TrypsinPromegaV511C
HarnstoffSigmaU5378
Xbridge Säule C18 SäuleWasser186003943
Ziptips C18MilliporeZTC18S096
SepPak 1cc 50mgWasserWAT054960

References

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  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14

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Deep Proteome ProfilingIsobaric LabelingLiquid ChromatographyMass SpectrometryTMT Labeling2D LCHigh Resolution Mass SpectrometryComputational Data ProcessingProtein QuantitationPost Translational Modifications

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