Method Article

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

DOI:

10.3791/56498

⸱

December 8th, 2017

 , 
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

In This Article

Summary

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Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Abstract

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Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell der verschiedenen menschlichen Krankheiten und ein nützliches Werkzeug für eine zunehmende Anzahl von experimentellen Studien über grundlegende Entwicklungsbiologie durch zu großen genetischen und chemischen Bildschirme. Allerdings setzen viele Experimente, insbesondere im Zusammenhang mit Infektionen und Xenograft Modelle auf Mikroinjektion und Bildgebung von Embryonen und Larven, die aufwändige Techniken sind, die Fähigkeit und Kompetenz erfordern. Um die Präzision und den Durchsatz des aktuellen Mikroinjektion Techniken zu verbessern, entwickelten wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate zu orientieren und zu stabilisieren Zebrafisch-Embryonen im 2 Tage Post Düngung (Dpf) ventral, dorsal oder seitliche Ausrichtung vor der Verfahren. Um die Darstellung der Embryonen zu erleichtern, haben wir auch ein einfaches Gerät mit Kanälen, die 4 Zebrafisch seitlich parallel gegen ein Glas Deckglas orient entwickelt. Zusammen, belegen die Werkzeuge, die wir hier präsentieren die Wirksamkeit photolithographische Ansätze um nützliche Geräte für die Optimierung von Zebrafisch-Techniken zu generieren.

Introduction

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Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell für viele Bereiche, von der grundlegenden Entwicklungsbiologie, umfangreiche genetische Studien und chemische Bildschirme1,2. Routinemäßige genetische Manipulationen, wie gen-Überexpression, Zuschlag, CRISPR/Cas9 Mutagenese und Transgenese verlassen sich auf Mikroinjektion von genetischem Material in der einzelligen Zygote, die zur Entwicklung von einfachen, leicht zu bedienende, kommerziell geführt hat verfügbare Tools zur Ausrichtung und Stabilisierung von Eiern für Injektion3. Andere Ansätze, wie z.B. Transplantation und Infektion....

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Protocol

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Mikroinjektion der Larven wurde von der Massachusetts General Hospital Unterausschuss für Forschung Animal Care unter Protokoll 2011N000127 genehmigt.

1. Gerät Fertigung

Hinweis: Alle Computer-gestützte (CAD) Zeichnungsdateien verwendet Photolithographie-Masken, die hier beschriebenen entwerfen (Abbildung 1) sind zum Download zur Verfügung. Siehe Tabelle der Materialien für Links.

  1. Den master-Form-Wafer im Reinraum Klasse 1.000 mit Standardtechniken photolithographische7zu fabrizieren. Für die Mikrostruktur Arrays und Kanäle Muster der Epoxy-basierte ....

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Results

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Der hier beschriebene Ansatz zeigt die Konstruktion (Abbildung 1) und Herstellung von Geräten für den Einsatz mit 2 Dpf Zebrafisch, photolithographische (Abbildung 2) und weichen lithografischen (Abbildung 3) Techniken. Mit dieser Methode können Schnelltests vieler Design-Iterationen und Änderungen und Umbauten und Optimierung der Mikrostruktur Dimensionen für die Verwendung mit Zebrafisch auf andere.......

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Discussion

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Hier beschreiben wir die Verwendung von Geräten wir vor kurzem entwickelt, um 2 Dpf Zebrafisch Mikroinjektion5erleichtern und stellen eine einfache Agarose-freie Halterung für die komfortable Darstellung von Embryonen. Diese Werkzeuge markieren Sie das Dienstprogramm photolithographische Techniken für die Herstellung von Geräten nützlich für Zebrafisch-Techniken.

Wir haben gefunden MSA Geräte besonders nützlich für die Injektion von Zellen oder Partikel anfällig für Agg.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgements

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Die Autoren möchte David Langenau danken für die großzügige Bereitstellung von Aquarium Raum; Eric Stone, John C. Moore und Qin Tang für Hilfe bei Zebrafisch Wartung und Reagenzien, und Anne Robertson und Elliott Hagedorn aus Leonard Zon Labor für die Beschaffung der hier verwendeten Zebrafisch-Stamm. Sie möchte auch Octavio Hurtado für Ratschläge, photolithographische Techniken zu danken. FE wurde durch Stipendien aus Shriner es Krankenhaus für Kinder und der amerikanischen Australian Association finanziert. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert GM92804 zu gewähren.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)Ellsworth Adhsives184 SIL ELAST KIT 0,5KGZum Gießen der Geräte. Das Kit enthält PDMS-Monomer und Initiator
Agarose mit niedriger GeliertemperaturSigma AldrichA9414-10GZum Gießen von Agarose-Geräten
PFDTS SilanSigma Aldrich448931-10GZum Gießen von negativen PDMS-Formen
Tricain (MS-222)Sigma AldrichE10521-10GZur Betäubung von Zebrafischen
Rhodamin Dextran 70.000 DaThermoFisherD1818Zur Rückverfolgung von Mikroinjektionen
Leukotrien B4 (LTB4)Cayman Chemicals20110Neutrophiler Chemolockstoff
N-Formylmethionin-leucyl-phenylalanin (fMLP)Sigma AldrichF3506-50MGNeutrophiler Chemolockstoff
15 cm PetrischaleFisher scientific08-757-148Zum Gießen vom Master-Wafer
6-Well-Platten mit GlasbodenMatTekP06G-0-20-FFür bildgebende Geräte
Mikrokapillaren aus BorosilikatglasWorld Scientific InstrumentsTW-100-4Für Mikroinjektionsnadeln
TransferpipettenSigma AldrichZ350796Für den Transfer von Zebrafischembryonen
Microloader-SpitzenFisher ScientificE5242956003Zum Laden der Mikroinjektionsnadeln
Harris Uni-Core 1,5 mm StanzeTed Pella Inc.15111-15Zum Stanzen von Ports in PDMS-Bildgebungsgeräten
Nr. 11 SkalpellFine Science Tools10011-00Zum Schneiden PDMS
Dumont Nr. 5 PinzettenFine Science Tools11252-10Zum Dechorionieren von Embryonen und Brechen von Mikroinjektionsnadelspitzen
Marzhauser MikromanipulatorASIMM33-RZum Manipulieren von Mikroinjektionsnadeln
Magnetisches StativMSCSPI - 87242624Zur Montage von Mikromanipulatoren
MPPI-3 Picopump ControllerASIMPPI-3Zur Steuerung des Mikroinjektionsvolumens und -timings
EVOS Inverses FluoreszenzmikroskopThermoFisherEVOS FLZur Abbildung von injizierten Embryonen
PräpariermikroskopNikonSMZ745Zur Visualisierung von Mikroinjektionen
AutoCAD SoftwareAutodeskLaden Sie AutoCAD-Dateien herunter von: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 und auf der Wiki-Seite der ZFIN-Community-Protokolle: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protokoll+Wiki  

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916

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