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Methodenartikel

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

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DOI:

10.3791/56498

⸱

8. Dezember 2017

 , 
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Zusammenfassung

Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell der verschiedenen menschlichen Krankheiten und ein nützliches Werkzeug für eine zunehmende Anzahl von experimentellen Studien über grundlegende Entwicklungsbiologie durch zu großen genetischen und chemischen Bildschirme. Allerdings setzen viele Experimente, insbesondere im Zusammenhang mit Infektionen und Xenograft Modelle auf Mikroinjektion und Bildgebung von Embryonen und Larven, die aufwändige Techniken sind, die Fähigkeit und Kompetenz erfordern. Um die Präzision und den Durchsatz des aktuellen Mikroinjektion Techniken zu verbessern, entwickelten wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate zu orientieren und zu stabilisieren Zebrafisch-Embryonen im 2 Tage Post Düngung (Dpf) ventral, dorsal oder seitliche Ausrichtung vor der Verfahren. Um die Darstellung der Embryonen zu erleichtern, haben wir auch ein einfaches Gerät mit Kanälen, die 4 Zebrafisch seitlich parallel gegen ein Glas Deckglas orient entwickelt. Zusammen, belegen die Werkzeuge, die wir hier präsentieren die Wirksamkeit photolithographische Ansätze um nützliche Geräte für die Optimierung von Zebrafisch-Techniken zu generieren.

Einleitung

Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell für viele Bereiche, von der grundlegenden Entwicklungsbiologie, umfangreiche genetische Studien und chemische Bildschirme1,2. Routinemäßige genetische Manipulationen, wie gen-Überexpression, Zuschlag, CRISPR/Cas9 Mutagenese und Transgenese verlassen sich auf Mikroinjektion von genetischem Material in der einzelligen Zygote, die zur Entwicklung von einfachen, leicht zu bedienende, kommerziell geführt hat verfügbare Tools zur Ausrichtung und Stabilisierung von Eiern für Injektion3. Andere Ansätze, wie z.B. Transplantation und Infektion, erfordern oft Mikroinjektion in späteren Embryonen und Larven mit größeren Spurweite Kapillare Nadeln4. Verwendung von größeren g-Nadeln stellt jedoch erhebliche technische Herausforderungen, da es immer schwieriger, das Zielgewebe zu durchdringen, ohne Drücken oder Rollen des Embryos ist. Unter diesen Bedingungen kann Einholung der entsprechenden Wasser Spannung erforderlich, um den Embryo zu stabilisieren, während Trocknung während des Verfahrens zu vermeiden schwierig ist und die Embryonen nicht ideal für die Injektion in das Zielgewebe orientieren.

Nach Mikroinjektion ist es oft sinnvoll, Bildschirm injizierte Embryonen diejenigen auswählen, die erfolgreich injiziert wurde und Bilder von den ersten Zeitpunkt zu erfassen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate entwickelt, die helfen, um 2 Dpf Embryonen in verschiedenen Ausrichtungen Mikroinjektion5, sowohl für schnelle Image-basierten Screening nach der Injektion zu stabilisieren.

Um ausreichende strukturelle Auflösung in diesen Geräten zu erhalten, haben wir photolithographische Techniken verwendet. In mikroelektronischen Industrie und mehr vor kurzem hochgerechnet auf mikrofluidischen Fertigung allgemein verwendet, können diese Ansätze vertikale Strukturen von 1-1.000 µm, einer Skala gut geeignet zur Manipulation von Zebrafisch-Embryonen und Larven bis hin erreichen. Alle Geräte wurden hergestellt mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die billig, körperlich robust, biologisch inert und transparent ist.

Mikrostrukturierte Oberfläche Arrays (MSAs) wurden als Blöcke von PDMS mit einer gemusterten Oberfläche formatiert, analog zu der einfache Kanäle in Agarose Blöcken gebräuchlich für Ei Mikroinjektion. Nach der Injektion Screening können 6 imaging-Geräte in ein standard Glasboden-6-Well-Platte angeordnet. Diese Geräte eignen sich für einfache Befüllung von Embryonen, während der Entlade Verfahren bequem Rettung von bestimmten Embryonen, Erleichterung ermöglicht Image-basierte screening Ansätze in benutzerfreundlicher Weise als diese Geräte zuvor erarbeiteten die Beebe-Labor-6.

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Protokoll

Mikroinjektion der Larven wurde von der Massachusetts General Hospital Unterausschuss für Forschung Animal Care unter Protokoll 2011N000127 genehmigt.

1. Gerät Fertigung

Hinweis: Alle Computer-gestützte (CAD) Zeichnungsdateien verwendet Photolithographie-Masken, die hier beschriebenen entwerfen (Abbildung 1) sind zum Download zur Verfügung. Siehe Tabelle der Materialien für Links.

  1. Den master-Form-Wafer im Reinraum Klasse 1.000 mit Standardtechniken photolithographische7zu fabrizieren. Für die Mikrostruktur Arrays und Kanäle Muster der Epoxy-basierte negativer Photoresist nacheinander in 3 Schichten mit 3 separaten Masken, gemäß den Anweisungen des Herstellers: 100 µm für die flachen Features, 200 µm für die mittlere Features und 400 µm für die Tiefe verfügt. Für das Bildverarbeitungsgerät Schichten Muster zwei mit 400 µm für die flachen Features und 600 µm für die tiefen-Features.
  2. Kleben Sie den fertige Wafer auf der Basis eines 15 cm Petrischale für das Gießen (Abbildung 2).

2. Vorbereitung von mikrostrukturierten Oberflächen Arrays - PDMS

  1. Um nutzbare Geräte zu machen, werfen Sie Polydimethylsiloxan (PDMS), mit dem Meister Wafer als Form. 50 g PDMS Monomer mit 5 g des Initiators zu kombinieren und mischen in einem Kunststoff mit einem Gewicht von Schüssel mit einer Gabel aus Kunststoff.
  2. Gießen Sie die Mischung vorsichtig über die Form.
  3. In einem Vakuum Exsikkator bei 16-25 InHg (54-85 kPa) für 1 h entgasen.
  4. Um die PDMS zu heilen, Backen Sie bei 65 ° C für mindestens 3 h. Die PDMS sollte auf eine feste, aber flexible solide heilen.
  5. Schneiden Sie vorsichtig um das Gerät auf dem master Wafer mit einem Skalpell, sicherstellen, dass den Kontakt zwischen der Spitze des Skalpells und der Wafer-Oberfläche zu behalten. Mit Pinzette, Schälen der PDMS-Replikat vom Wafer und Übertragung auf eine saubere 10 cm Petrischale, Funktion Seite nach oben (Abbildung 3).
  6. Behandeln Sie das Gerät mit Sauerstoffplasma mit einem Plasma-Ofen für 35 s, Hydrophobie zu reduzieren.
  7. Deckel mit Zebrafish Embryos (E3)-haltigem Medium 168 mg/L von Ethyl-3-Aminobenoate-Methanesulfonate (MS-222, pH 7,5). Entfernen Sie alle Bläschen aus tieferen Funktionen von fließenden Wasser über die Oberfläche des Gerätes mit einer Transferpipette.

3. Vorbereitung der mikrostrukturierte Oberfläche Arrays - Agarose

  1. Um eine Negativform PDMS zu machen, zuerst behandeln Sie eine PDMS-Gerät mit Sauerstoffplasma.
  2. Behandeln Sie das PDMS-Gerät mit 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) Silan Dampf eine inerte Oberfläche8erstellen. Kurz:
    1. Ort der PDMS behandelten Feature-Seite nach oben in einer Vakuumkammer in einer Dampfhaube sein.
    2. Neben dem PDMS legen eine kleine offene Glas oder Aluminium-Schale und sorgfältig pipette 200 µL des PFDTS (98 % Silan) in die Schüssel.
      Achtung: PFDTS Silan ist sehr volatil, reagiert heftig mit Wasser, ist brennbar und verursacht schwere Haut- und Schäden auf Kontakt. Lesen Sie Muskel-und Skeletterkrankungen im Detail vor Gebrauch.
    3. Schließen Sie die Vakuumkammer und gelten Sie Vakuum für 15-30 Minuten, oder bis die PFDTS Silan vollständig verdunstet ist.
  3. Stellen Sie das Gerät in einer Petrischale und als eine Form für frische PDMS, wie in Schritt 2.1-2.3 beschrieben.
  4. Backen bei 65 ° C für mindestens 3 h, dann schälen die gesamte Schicht frischen PDMS vom behandelten Gerät und in einer frischen Petrischale. Dies dann als eine Negativform einsetzbar, um Agarose zu werfen.
  5. Um die Agarose vorzubereiten, Kochen Sie eine 2 % ige Lösung von niedrigen gelierende Temperatur Agarose in E3 in der Mikrowelle bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.
  6. Die Negativform PDMS übergießen Sie heißen Agarose und entfernen Sie alle Luftblasen in der Agarose für das Gerät durch fließende heißen Agarose über die Features mit einer Transferpipette.
  7. Sobald Bläschen entfernt werden, im Kühlschrank bei 4 ° C die Agarose festlegen.
  8. Entfernen Sie die Agarose-Block aus der Negativform PDMS durch Verformung der PDMS aus unterhalb von hand, übertragen Sie die Agarose-Block auf eine neue Petrischale und nass mit E3 mit MS-222.

4. Vorbereitung der PDMS Imaging-Geräte

  1. Um nutzbare Geräte zu machen, werfen Sie PDMS, mit dem Meister Wafer als Form. Kombinieren Sie 50 g PDMS Monomer mit 5 g der Initiator (gleiche wie in Schritt 2.1 verwendet) und Mischung gründlich in einem Kunststoff mit einem Gewicht von Schüssel mit einer Gabel aus Kunststoff.
  2. Gießen Sie die Mischung vorsichtig über die Form.
  3. In einem Vakuum Exsikkator bei 16-25 InHg (54-85 kPa) für 1 h entgasen.
  4. Um die PDMS zu heilen, Backen Sie bei 65 ° C für mindestens 3 h. Die PDMS sollte auf eine feste, aber flexible solide heilen.
  5. Schneiden Sie die Geräte aus dem Master-Wafer und Häfen mit einem 1,5 mm Schlag ausstanzen.
  6. Behandeln die Geräte und einem Glasboden 6-Well gut mit Sauerstoffplasma für 35 Platte s, wie unter Punkt 2.6 beschrieben.
  7. Verbinden Sie ein Gerät Feature-Side-Down zu jedem Glas Deckglas des 6-Well-Platte, indem es auf eine Herdplatte 85 ° C für 10 min.
    Hinweis: Zur Bestätigung der erfolgreichen Verklebung Druck fest auf der einen Seite des verbundenen Geräts mit Pinzette. Das Gerät sollte an den Glas-Deckglas bleiben.

5. Zebrafisch-Kultur

  1. Kultur-Zebrafisch-Embryonen bis 2 Dpf mit Standardtechniken3.
  2. Dechorionate Embryonen mit Zange oder 1 mg/mL Protease mischen (siehe Materialtabelle)3 mindestens 30-60 Minuten vor der Verladung auf Gerät, damit sie sich zu begradigen.
  3. Betäuben Sie Embryonen mit (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5) durch Zugabe von 25 X 1 mL Stammlösung auf der E3 in der Petrischale.

6. Ausrichtung der Zebrafisch auf mikrostrukturierte Oberfläche - Divot-Arrays

  1. Vorbereiten des PDMS-Blocks aus Schritt 2.7 (Abbildung 3A) in der Petrischale, derart, dass sie durch eine dünne (1-2 mm) Schicht von E3, fällt die einfachere Handhabung der Embryonen erlaubt.
  2. Übertragen Sie erforderliche Anzahl von Embryonen (in der Regel 10-20 pro Zustand) auf die Oberfläche des PDMS-Blocks mit einer Transferpipette.
  3. Mit einem Tool Mikromanipulation (Haar Schleife o.ä.), schieben Sie die Embryonen in mikrostrukturierten Divots (Abb. 3A). Verwendung von Divots eignet sich besonders für dorsalen und ventralen Orientierungen.
    Hinweis: Für die Divots mit einer strengeren passen (dorsale und ventrale), versuchen die Embryonen auf der Oberfläche des Blocks parallel zu den Divot zu positionieren und dann Rollen sie mit einer Haar-Schleife in Position. Schob sie tiefer in das Divot hilft um sie stabil zu halten.

7. Orientierung der Zebrafisch auf mikrostrukturierte Oberfläche - mikrostrukturierten Kanäle

  1. Gemustert mit mikrostrukturierten Kanäle (Abb. 3 b) mit einer Transferpipette, bis das Niveau der E3 unter den Rand des Blocks fällt, aber noch vorhanden, in das Reservoir und Kanäle und in einer dünnen Schicht auf die PDMS ist PDMS-Block ziehen Sie E3 ab.
  2. Übertragen Sie 10 Embryonen aus Schritt 5.3 in das Reservoir mit einer Transferpipette, ohne dabei die Kanten zu überlaufen.
  3. Mit einer Haar-Schleife, manipulieren Sie jeder Embryo in den Trichter am Eingang des entsprechenden Kanals zu und orientieren Sie, so dass der Kopf des Embryos in Richtung des Kanals ist und der Embryo die entsprechende Ausrichtung beim Eintritt in den Kanal hat.
  4. Schieben Sie jedes Embryo ab der Kanal mit einer Haar-Schleife, bis es die orientierende Microfeatures in die Kanalwände, die helfen erreicht, um es in Position zu halten. Nutzung von mikrostrukturierten Kanälen empfiehlt sich besonders für die seitliche Ausrichtung.
    Hinweis: Um Embryo während Mikroinjektion zu reduzieren, versuchen Sie Anpassung der Höhe der Oberflächenspannung durch E3 aus dem Behälter ziehen.

8. die Mikroinjektion Zebrafisch

  1. Mikroinjektion Nadel vorbereiten.
    1. Borosilikatglas Microcapillary Nadeln mit einer Mikropipette Puller als zuvor beschriebenen4zu machen. Die daraus resultierende Nadeln sollten bis zu einem Punkt an einem Ende mit einer konischen Länge von ca. 10 mm abgeschrägt werden.
    2. Bereiten Sie Lösung injiziert werden, in diesem Fall 100 nM Lockstoffgradient (N-Formylmethionine-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) oder Leukotrien B4 (LTB4)) und 100 nM 70 kDa Rhodamine Dextran Tracer mit PBS-Puffer.
    3. Laden Sie 5 µL der Lösung in die Nadel mit einer fein konische Pipette Tipp (siehe Materialtabelle).
    4. Montieren Sie die Nadel in einem Mikromanipulator auf magnetische Stativ montiert und angeschlossen an eine Picopump Microinjector.
  2. Brechen Sie die Spitze der Nadel in einem 45 °-Winkel durch Kneifen die kegelförmige Spitze mit der Pinzette.
  3. Passen Sie Injektion Bolus Größe 1 nL durch die Einspritzzeit auf dem Picopump Controller einstellen.
  4. Stellen Sie den Winkel der Mikroinjektion Nadel. Ein Nadel-Winkel von 45° auf die Mikromanipulation Controller ist im Allgemeinen ein guter Ausgangspunkt, mit der Nadel parallel zu der Länge des Embryos. Ein steilerer Winkel kann verwendet werden, um die seitliche Bewegung des Embryos während der Mikroinjektion zu minimieren.
  5. Steuerung der Petrischale mit der linken Hand und die Nadel Mikromanipulator mit dem Recht, bringen Sie die Nadel so nah wie möglich an den vorgesehenen Ort der Mikroinjektion, in diesem Fall die Gleichheitspartei Vesikel.
    Hinweis: Die Gleichheitspartei Vesikel kann als längliche Organ posterior für das Auge mit zwei kleineren ausgeprägte dunkle längliche Strukturen (Otolithen) identifiziert werden.
  6. Mit dem Mikromanipulation Controller durchdringen Sie das Zielgewebe (in diesem Fall die Gleichheitspartei Vesikel) zu, so dass die Spitze der Nadel in die Blase und injizieren Sie die voreingestellte Lautstärke mit der Picopump-Fuß-Schalter.
    Hinweis: Wenn das Gewebe eindringen widersteht, möglichst leichtes Klopfen des Mikromanipulation Controller Knopfes.
  7. Um die Embryonen zu lösen, fließen Sie E3 über die Oberfläche von oben nach unten mit einer Transferpipette oder durch Schütteln das Gericht, dass die Embryonen in die umliegenden E3 freigesetzt werden.
  8. Übertragen Sie die Embryonen ohne MS-222 mit einer Transferpipette auf eine Erholung Schüssel mit E3.

9. screening von Embryonen mit dem PDMS Imaging-Gerät

  1. Erstklassige Gerät aus Schritt 4.7 durch fließende E3 (+ MS-222) durch den Hafen. Dies kann mit einer 1.000 µL Pipette oder eine schmale Spitze Transferpipette.
  2. Füllen Sie den Brunnen mit E3 + MS-222, bis das Gerät bedeckt ist.
  3. Liefern Sie 4 injizierte Embryonen von 8.7 Schritt in jeder gut mit einer Transferpipette. Embryonen können vorher betäubt werden bei Bedarf durch Inkubation in E3 + MS-222 für 1 – 2 min. vor dem Laden (Schritt 5.3).
  4. Mit einem Tool Mikromanipulation (Haar Schleife o.ä.), richten Sie die Embryonen an den Eingängen der bildgebenden Kanäle in der gewünschten Richtung (Tail-erste oder kopfüber, abhängig vom verwendeten Gerät), und schieben Sie sie teilweise in das Gerät (Abb. 4A). Damit sie gleichmäßig in das Gerät zu ziehen.
  5. Zeichnen Sie E3 durch das Gerät aus dem Hafen mit 1.000 µL Pipette oder Transferpipette, bis die Embryonen in die Kanäle in der richtigen Ausrichtung für imaging (Abbildung 4 b) gezeichnet werden.
    Hinweis: Achten Sie darauf, die Embryonen über den Fang Punkt zu saugen, wird die Embryonen schädigen und ihre Ausrichtung ändern.
  6. Übertragen Sie Well-Platte auf Mikroskop für imaging (Abbildung 4).
  7. Bild mit einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop.
    1. Einstellen Sie Vergrößerung durch Auswahl der entsprechenden Objektiv. 10 X ist in der Regel eine nützliche Vergrößerung für imaging Zebrafisch Neutrophilenzahl Migration.
    2. Einstellen Sie Intensität der Lichtquelle und Belichtungszeit für jeden Kanal so, dass jedes Signal klar, aber nicht gesättigt ist.
    3. Die Aufnahmen Sie für jeden Kanal. Hier verwendeten wir grünes fluoreszierendes Protein (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) und Kanäle übertragen. Mehrkanal-Bilder können während der Post-Processing kombiniert werden (Abbildung 4 b-Ich).

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Ergebnisse

Der hier beschriebene Ansatz zeigt die Konstruktion (Abbildung 1) und Herstellung von Geräten für den Einsatz mit 2 Dpf Zebrafisch, photolithographische (Abbildung 2) und weichen lithografischen (Abbildung 3) Techniken. Mit dieser Methode können Schnelltests vieler Design-Iterationen und Änderungen und Umbauten und Optimierung der Mikrostruktur Dimensionen für die Verwendung mit Zebrafisch auf andere...

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Diskussion

Hier beschreiben wir die Verwendung von Geräten wir vor kurzem entwickelt, um 2 Dpf Zebrafisch Mikroinjektion5erleichtern und stellen eine einfache Agarose-freie Halterung für die komfortable Darstellung von Embryonen. Diese Werkzeuge markieren Sie das Dienstprogramm photolithographische Techniken für die Herstellung von Geräten nützlich für Zebrafisch-Techniken.

Wir haben gefunden MSA Geräte besonders nützlich für die Injektion von Zellen oder Partikel anfällig für Agg...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren möchte David Langenau danken für die großzügige Bereitstellung von Aquarium Raum; Eric Stone, John C. Moore und Qin Tang für Hilfe bei Zebrafisch Wartung und Reagenzien, und Anne Robertson und Elliott Hagedorn aus Leonard Zon Labor für die Beschaffung der hier verwendeten Zebrafisch-Stamm. Sie möchte auch Octavio Hurtado für Ratschläge, photolithographische Techniken zu danken. FE wurde durch Stipendien aus Shriner es Krankenhaus für Kinder und der amerikanischen Australian Association finanziert. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert GM92804 zu gewähren.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)Ellsworth Adhsives184 SIL ELAST KIT 0,5KGZum Gießen der Geräte. Das Kit enthält PDMS-Monomer und Initiator
Agarose mit niedriger GeliertemperaturSigma AldrichA9414-10GZum Gießen von Agarose-Geräten
PFDTS SilanSigma Aldrich448931-10GZum Gießen von negativen PDMS-Formen
Tricain (MS-222)Sigma AldrichE10521-10GZur Betäubung von Zebrafischen
Rhodamin Dextran 70.000 DaThermoFisherD1818Zur Rückverfolgung von Mikroinjektionen
Leukotrien B4 (LTB4)Cayman Chemicals20110Neutrophiler Chemolockstoff
N-Formylmethionin-leucyl-phenylalanin (fMLP)Sigma AldrichF3506-50MGNeutrophiler Chemolockstoff
15 cm PetrischaleFisher scientific08-757-148Zum Gießen vom Master-Wafer
6-Well-Platten mit GlasbodenMatTekP06G-0-20-FFür bildgebende Geräte
Mikrokapillaren aus BorosilikatglasWorld Scientific InstrumentsTW-100-4Für Mikroinjektionsnadeln
TransferpipettenSigma AldrichZ350796Für den Transfer von Zebrafischembryonen
Microloader-SpitzenFisher ScientificE5242956003Zum Laden der Mikroinjektionsnadeln
Harris Uni-Core 1,5 mm StanzeTed Pella Inc.15111-15Zum Stanzen von Ports in PDMS-Bildgebungsgeräten
Nr. 11 SkalpellFine Science Tools10011-00Zum Schneiden PDMS
Dumont Nr. 5 PinzettenFine Science Tools11252-10Zum Dechorionieren von Embryonen und Brechen von Mikroinjektionsnadelspitzen
Marzhauser MikromanipulatorASIMM33-RZum Manipulieren von Mikroinjektionsnadeln
Magnetisches StativMSCSPI - 87242624Zur Montage von Mikromanipulatoren
MPPI-3 Picopump ControllerASIMPPI-3Zur Steuerung des Mikroinjektionsvolumens und -timings
EVOS Inverses FluoreszenzmikroskopThermoFisherEVOS FLZur Abbildung von injizierten Embryonen
PräpariermikroskopNikonSMZ745Zur Visualisierung von Mikroinjektionen
AutoCAD SoftwareAutodeskLaden Sie AutoCAD-Dateien herunter von: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 und auf der Wiki-Seite der ZFIN-Community-Protokolle: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protokoll+Wiki  

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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