Summary
여기 살 모 넬 라 typhimurium의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 설명-비타민 b 복합체와 streptavidin 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하.
Abstract
살 모 넬 라 typhimurium 인간에서 위장염을 일으키는 facultative 세포내 박테리아 이다. Lamina propria S. 의 침공 후 typhimurium 박테리아 및 감지 신속 하 게는 대 식 세포에 의해 phagocytized 그리고 소포 저하 될 하기 위해 phagosomes로 알려진에 포함 된. 미 의 격리 typhimurium-포함 phagosomes 널리 사용 되었습니다 공부 어떻게 미 typhimurium 감염 세균 저하를 방지 하기 위해 phagosome 성숙의 과정을 변경 합니다. 고아 하 게, 포함 하는 박테리아의 격리 phagosomes 자당 기온 변화도 원심 분리에 의해 수행 되었습니다. 그러나,이 과정은 시간이 많이 걸리는, 이며 전문된 장비와 어느 정도의 손 재주. 여기에 설명 된은 미 의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 typhimurium-자석 구슬 biotin streptavidin 활용 된 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하. Phagosomes이이 방법으로 얻은 분석 실험, 단백질, 대사 산물, 및 지질 분석 등의 광범위 한 범위에 대 한 격리 된 phagosomes의 사용을 허용 하는 선택의 어떤 버퍼에 중단 될 수 있습니다. 요약 하자면, 미 의 격리에 대 한이 방법은 typhimurium-phagosomes 포함 된 특정, 효율, 빠른, 최소 장비를 요구 이며 자당 기온 변화도-ultracentrifugation 격리의 고전적인 방법 보다 더 다양 한.
Introduction
대 식 세포는 검색 하 고, 아마, 어떤 이물질 침입 박테리아 등 미생물까지 apoptotic 세포에서 주변 조직에 저하 전문된 phagocytic 세포 순환 하 고 있다. 병원 체 특정 마커 미생물 (병원 체 관련 된 분자 패턴 또는 PAMPs 라고도 함)의 표면에 일반적으로 존재의 표면 수용 체-중재 인식, 시 세포에서 세포 막의 복잡 한 개편 시작 서라운드 및 병원 체1phagocytize 순서입니다.
몸부림치 병원 체 라고 phagosome 세포내 소포에서 대 식 세포에 의해 다음 포함 되어 있습니다. 일련의 융해 및 분열 이벤트 endosomes 리소좀 등 다른 소포를 통해 병원 체 포함 phagosome phagosomal 콘텐츠 제거에 필요한 단백질의 집합을 가져옵니다. 따라서,는 phagosome의 효소 구성 phagosome 성숙2로 알려진이 프로세스 과정에서 매우 변수입니다.
식 균 작용, 복잡 한 vacuolar ATPase (v-ATPase) phagosome 막 endosomes3융합에 의해 통합 됩니다 multimeric 직후 이 복잡 한 phagosome4의 루멘에 cytosol에서 펌프 양성자에 ATP를 사용합니다. 산성화는 phagosome의 다른 소포5 퓨전 이벤트와 pH-종속 degradative 효소6의 큰 숫자의 활성화를 위해 필수적 이다. 또 다른 multimeric 효소 복잡 한 phagosome 멤브레인에 신속 하 게 조립 하는 NADPH 산화 효소 (NOX) 복잡 한이입니다. NOX 복잡 한 반응성 산소 종 (선생님)을 phagosome 루멘으로 은닉 되 고 몸부림치 미생물7의 살인에 크게 기여를 생성 하기 위하여 NADPH 산화 한다.
성숙의 초기 단계 동안 phagosomes Rab5 등 각각8v ATPase V0 소 단위와 함께 초기 및 늦은 endosomes의 Rab7 일반적으로 마커를 제시. Phagosomes 늦은 endosomes와 리소좀의 융합 결과 cathepsin 프로 테아 제, lipases, β-galactosidase9등 가수분해 효소의 다양 한 phagocytized 병원 체의 노출. 루멘의 산성화는 또한이 효소의 활성화를 위해 필요 합니다. 예를 들어 활성 약식 생산 cathepsin D의 분열 pH 의존10입니다. 이 효소는 병원 체를 저하 하 고 병원 체 파생 짧은 펩 티 드의 macrophage 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 클래스 II 분자 T 세포는 적합 한 면역 반응11하에서 제공 하는 생산을 중재.
따라서 phagosome 성숙은 타고 난 면역 반응에 대 한 중요 하 고 링크 타고 난 및 적응형 면역 시스템의 팔. 그것은 전혀 놀라운 병원 체 phagosome 성숙의 위 설명 된 과정을 통해 세포에 의해 제거 극복 하는 전략을 진화 했다. 예를 들어 결핵균 , 레지오 넬 라 pneumophila 세포내 박테리아 방지 억제 v ATPase 어셈블리 및 필연적인 루멘 산성화12,13 phagosome 성숙 . 다른 박테리아, Listeria monocytogenes 등 Shigella flexneri cytosol14,15로 탈출 phagosome 막에서 기 공 형성 유도. 다른 한편, 살 모 넬 라 enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) 16의 복제 대 한 적당 한 위치에 그것을 변환 하는 공포에서 phagosome의 속성을 수정할 수 있다. 이 능력은 미 typhimurium phagosome 성숙의 병원 체 중재 간섭 공부에 매우 흥미로운 모델.
S. typhimurium 인간에서 위장염을 일으키는 facultative 세포내 박테리아 이다. Lamina propria, 미 의 침공 후 Typhimurium 박테리아 및 감지 신속 하 게는 대 식 세포에 의해 phagocytized 그리고 phagosomes17내 포함. 일부 보고서는 그 미 를 앞에서 설명한 typhimurium-포함 phagosomes 제시 endosomes와 리소좀18, 제조 업체 및 다른 연구 phagosome 리소좀 퓨전 S. 시 방해 발견 Typhimurium 감염19.
처음, phagosome 성숙 미 시 typhimurium 감염 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 조사 했다. 포함 하는 박테리아의 고립에 대 한 기술의 개발 phagosomes endosome와 리소좀 마커 점에서 phagosome 내용의 더 정확한 연구를 활성화. 날짜, 포함 하는 박테리아의 절연에 사용 되는 주요 방법 phagosomes 자당 단계 그라디언트18,20subcellular 분류입니다. 그러나,이 방법은 여러 원심 분리 단계를 phagosomes 기계적 손상 될 수 있습니다, phagosomal 구성 요소 (단백질, 지질)의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 시간이 소요 됩니다 필요 합니다. 또한, 그것 요구는 ultracentrifuge의 사용: 모든 실험실에 대 한 액세스할 수 있는 특수 장비의 한 조각.
최근, 새로운 접근 포함 하는 박테리아의 고립에 적용 된 phagosomes, biotinylated lipopetide (Lipobiotin)와 나중 세균성 병원 체는 분류는 streptavidin 활용 자석 구슬21 사용 하 여 추출 . 우리는 streptavidin 활용 자석 구슬 이어서 세균성 표면 아민 함유 고분자 NHS-비오 틴의 라벨 다른 보완적인 방법을 제안 합니다. Phagosomes이 메서드에서 얻은 endosome와 리소좀 표식에 풍성 하 게 높은 고 분석 실험, omics 분석 단백질 분석에서의 광범위 한 범위에 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 ultracentrifuges 같은 전문된 장비를 필요 하지 않습니다. 또한, 원심 분리 단계를 제거 함으로써 phagosomes에 기계적 손상 및 고용 시간을 상당히 줄일 수 있습니다. 이 메서드는 phagosomes 포함 하는 다른 박테리아는 그람 양성 포도 상 구 균,이 원고에 포함 등의 절연에 대 한 쉽게 적응 될 수 있다. 요약 하자면, 미 의 격리에 대 한이 방법은 typhimurium-phagosomes를 포함 하는 단순 하 고, 비용 효율적인, 그리고 자당에 의해 클래식 격리 보다 소비 하는 시간이 적은 그라데이션-ultracentrifugation, 높은 렌더링 농축 박테리아 포함 된 phagosomes.
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Protocol
병원 성 미의 사용을 포함 하는 모든 단계 typhimurium BSL-2 또는 더 높은 생물 학적 보안 수준의 시설에서 실시 해야 합니다. 문화와 미의 코팅 골 수 유래 세포 (BMDMs)의 감염 뿐 아니라 Typhimurium, 오염을 방지 하기 위해 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다. 미의 격리 typhimurium-phagosomes를 포함 하는 어떤 BSL-2 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다.
대 식 세포로의 분화에 대 한 쥐에서 골의 추출에 동물 복지 기관 지침에 따라 수행 되었고 자연, 북쪽 라인 강 Westphalian 국가 기관에 의해 승인 환경 및 소비자 보호 [Landesamt 위한 Natur, Umwelt 및 Verbraucherschutz (LANUV) 노르 트 베스트 팔 렌; 파일 번호: 84-02.05.40.14.082와 84-02.04.2015.A443]와 쾰른 대학.
1. Culturing S. typhimurium
- typhimurium (SL1344 스트레인) 세균성 루프를 사용 하 여 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 국물의 5 mL로 단일 세균성 식민지에서.
2. S. typhimurium NHS-비오 틴/Streptavidin-활용 자석 구슬의 코팅
- 10 mg/mL의 추가 100 µ L biotin 연결 솔루션 (NHS-비오 틴 디 메 틸 sulfoxide, DMSO에에서 용 해) 갓 준비, 세균 현 탁 액 이전 단계에서 준비. 예를 들어 메 마른 DMSO의 0.5 mL에 NHS-비오 틴의 5 mg을 희석. 제대로 몇 번 위아래로 pipetting으로 믹스.
- 5 1.5 mL 튜브에 믹스를 분할.
- 350 rpm에서 일정 한 동요와 함께 실 온 (RT)는 thermoblock에에서 2 h에 대 한 품.
- 튜브 RT에서 10 분 동안 15000 x g에서 원심 및 삭제는 상쾌한.
- 살 균 PBS, RT에서 10 분 동안 15000 x g에서 원심 분리기의 1 mL에 resuspend 및 삭제는 상쾌한.
- 솔루션 연결 초과 biotin을 완전히 제거 하려면 단계 2.5 두 번 더 반복.
- 마지막 세척 후 살 균 PBS의 1 mL에 펠 릿 resuspend.
- 1.5 mL 튜브에 10 mg/mL streptavidin 활용 자석 구슬 솔루션의 100 µ L를 전송 하 고 5 분에 대 한 자석 선반에 두고
- 는 피 펫과 용 매를 제거, 자기 선반에서 streptavidin-활용 자석 구슬 솔루션 고 biotin 코팅 세균 현 탁 액 단계 2.7에서에서 준비의 1 mL와 함께 그것을 resuspend.
- 350 rpm에서 일정 한 동요와 thermoblock에 RT에 1 시간에 대 한 품.
- 솔루션에 자석 랙; 5 분 기다려 놓고 다음 벽에 고착 하지 않았다 박테리아는 피 펫으로 제거 (튜브로 계속 " 비 코팅 박테리아 "). 자석 접촉 튜브의 벽에 준수 하는 분수는 비오 틴/streptavidin 입히는 박테리아.
- 자석 선반에서 레이블이 박테리아를 포함 하는 튜브를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL에 resuspend.
- 자석 선반에 그것을 다시 배치, 5 분 대기 고는 피 펫을 사용 하 여 PBS를 제거.
- 는 streptavidin 활용 자석 구슬에 입힌 모든 박테리아를 제거 하 2.13, 2.14 단계 두 번 더 반복.
- 마지막 세척 후 코팅-박테리아 살 균 PBS의 500 µ L에 resuspend 하 고로 튜브 라벨 " 박테리아 코팅 ".
- 계산 콜로 니 형성 단위 (cfu) 둘 다의 " 비 코팅 박테리아 " 및 " 박테리아 코팅 " BHI 한 천 배지에서 직렬 희석 도금 솔루션. 대략 2 x 10 8 cfu/mL 코팅-박테리아의 1.0의 OD 600와 초기 세균 현 탁 액의 20 mL에서 얻을 수 있습니다. 코팅-박테리아 정지 대 식 세포를 감염 하는 다음 날에 사용 될 4 ° C에서 유지.
3. BDMDs의 감염
- 완전히 접시 때 박테리아 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 코팅은 같은 날 6 cm 요리 접시 당 5 x 10 6 세포의 밀도에서 차별화 된 BMDMs 22.
- 다음 날, 4에 5 분 동안 15000 x g 코팅-박테리아 정지 원심 ° c.
- 는 상쾌한을 제거 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에서 10 x 10 6 cfu/mL의 농도에서 resuspend.
- 10, 감염 (MOI)의 다양성에 대 식 세포를 감염 하는 BMDMs에서 매체를 제거 하 고 코팅-박테리아 정지 준비의 5 mL을 추가. 최적의 나 모든 셀 또는 격리 된 phagosomes의 실험 목적에 대 한 평가 수 있습니다.
- 먹어서 동기화 10 분 RT에서 품.
- 품 먹어서 시작 30 분 5% CO 2 배양 기에서 37 ° C에서. 다른 세포 유형 다른 보육 시간 박테리아의 국제화를 위해 필요할 수 있습니다.
- 요리에서 박테리아를 포함 하는 매체를 제거 하 고 비 내 면 박테리아를 제거 하 RPMI 셀 세 번 세척.
- 마지막으로 어떤 비 phagocytized 박테리아를 죽 일 10 %FBS 및 50 µ g/mL gentamycin 포함 된 RPMI의 10 mL을 추가.
- 원하는 시간 까지는 5% CO 2와 37 ° C에서 감염 된 BMDMs를 품 어. 원하는 시간 포인트 박테리아 및 셀 형식 사용 및 분석의 목적에 따라 실험적으로 결정 되어야 합니다. 미에서 초기 phagosome endosome 퓨전 이벤트의 연구에 대 한 Typhimurium 감염 BMDMs 30 분 부 화는 것이 좋습니다. 나중에 이벤트의 분석을 위한 phagosomes 2 h 또는 외피의 4 h 후 추출할 수 있습니다. 미와 대 식 세포의 장기 배양 24 시간 넘어 Typhimurium 대 식 세포의 죽음에서 발생합니다. 확장 세포내 감염 전에 phagosome 추출 아마 비오 틴 분자의 저하로 이어질 수 있습니다. 그러나, 우리가 않았다 관찰 하지 코팅-박테리아에 biotin의 손실까지 24 h.
4. 미의 격리 typhimurium-Phagosomes 포함 된
- 준비 필요한 phagosome 볼륨 절연 버퍼는 (50 m m 파이프, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5mm EGTA) 1 m m, Cytochalasin B는 최종의 최종 농도를 dithiothreitol (DTT)을 추가 하 여 제조업체에서 권장 하는 대로 10 µ M, 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 농도.
참고: DTT와 Cytochalasin B에 추가 되어야 합니다 phagosome 절연 버퍼는 사용 전에 항상 즉시. Cytochalasin B 방해 세포 골격, 세포 막의 파열을 촉진. - 원하는 시간에 포인트, 감염 된 세포에서 매체를 제거 하 고 실시간에 따뜻하게 살 균 PBS로 세척
- Phagosom의 추가 750 µ Le 절연 접시 당 A를 버퍼링 하 고 얼음에 20 분을 품 어. 다른 휴대폰 번호를 사용할 경우 절연 버퍼 A의 볼륨 비례적으로 조정 되어야 합니다.
- 추가 250 µ L phagosome 절연 버퍼 B (50 m m 파이프, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5mm EGTA, 220 mM 마 니 톨, 및 68 mM 자당). 버퍼는 접시의 전체 표면에 도달 되도록 접시 바위. 다른 휴대폰 번호를 사용할 경우 절연 버퍼 B 양의 비례적으로 조정 되어야 합니다.
- 고무 경찰관을 사용 하 여 부드럽게 된다고 하 여 접시에서 셀을 제거 하 고 미리 냉장된 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.
- 세포 현 탁 액 26 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 적어도 15 번 (한 포부와 한 번으로는 셀 서 스 펜 션의 한 방출) 통과. 이것은 BMDMs의 cytosolic 콘텐츠 공개 충분 하다. 바늘을 통해 전달 수 모든 세포 유형에 대 한 최적화 해야 합니다.
- 자석 선반에 세포 현 탁 액을 배치 하 고 5 분을 기다립니다. 자석에 부착 된 입자는 포함 하는 코팅-미 phagosomes Typhimurium입니다. 세포 구성 성분의 나머지를 포함 하는 정지.
- 정지로 1.5 mL 튜브에 전송 " cytosol ".
- 자석 선반에서 분리 된 phagosomes와 튜브를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL에 그들을 resuspend.
- Phagosome 정지 자석 선반에, 5 분 대기 장소와 PBS를 제거.
- 4.9-4.10 격리 미를 씻어 반복 단계 typhimurium-포함 하는 phagosomes.
- 는 마지막으로 PBS를 제거 하 고 필요한 버퍼; 예를 들어 단백질 분석에 대 한 radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼는 phagosomes resuspend. 단백질의 약 50-200 µ g 샘플 셀의 초기 금액 및 감염의 나에 따라,이 프로토콜에 따라 당 얻은 것입니다.
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Representative Results
포함 하는 박테리아의 고립이이 프로토콜에 의해 phagosomes 필요한 첫 번째 단계는 박테리아의 biotinylation. 우리는 그러므로 미 의 효과 평가 BMDMs biotinylated 감염의 confocal 현미경 분석에 의해 typhimurium biotinylation mCherry-S. typhimurium Cy5 Streptavidin 표시입니다. 간단히, BMDMs mCherry-S와 함께이 프로토콜에서 설명 된 대로 감염 되었다. typhimurium 이전 biotinylated 하지 streptavidin 활용 자석 구슬 알을 품 지만. 37 ° C에서 30 분 부 화, 후 셀 따뜻한 PBS로 세척 되었고 실시간 고정 20 분 PBS 가진 광범위 한 세척에 의해 중단 됐다에 대 한 4% 포름알데히드로 고정. 셀은 다음 실시간 감염 BMDMs에서 5 분에 대 한 PBS에 트리톤 했다 다음 인 큐베이 팅 Cy5 Streptavidin와 4 ° c.에 20 분 동안 3% permeabilized 광범위 한 세척 후 샘플 confocal 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 분석에 대 한 준비가 되어 있었다. Biotinylated 하지 mCherry-S. Typhimurium 부정적인 제어로 사용 되었다. Cy5 Streptavidin에서 형광 신호 biotinylated에서 독점적으로 관찰 되었다 mCherry-S. typhimurium, 그 biotinylation 박테리아의 확인은 성공적 이었다. 현미경 분석에 confocal 현미경 "60 X O2 나: 1.40"를 사용 하 여 실행 되었다 목표. 형광에 대 한 흥분 파장은 405 nm (DAPI) 559 (mCherry), 그리고 635 nm (Cy5), 및 PMT 전압 574v, 565v, 그리고 443v, 각각 설정 했다.
이후 면역 반응에 의해세포에 발생. typhimurium 은 주로 세균성 ligands에 의해 대 식 세포 표면 수용 체 활성화에 의존, 우리 다음 경우 테스트 S의 코팅. biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 typhimurium 감염된 BMDMs에 타고 난 면역 응답을 변경할 수 있습니다. 우리는 먼저 S의 코팅 여부를 평가. typhimurium confocal 현미경 검사 법에 의해 BMDMs의 phagocytic 용량을 변경할 수 있습니다. BMDMs는 mCherry-S와 함께이 프로토콜에서 설명 된 대로 감염 되었다. Typhimurium biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 또는 코팅 mCherry-S와 코팅. typhimurium. 37 ° C에서 30 분 부 화, 후 셀 따뜻한 PBS로 세척 되었고 실시간에 20 분 동안 4% 포름알데히드와 고정 PBS 가진 광범위 한 세척 후 샘플 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석에 대 한 준비가 되어 있었다. 그림 2에서 같이, 세포 phagocytized 코팅 및 비 코팅 mCherry-S. typhimurium 동등 하 게.
다음, 우리는 S에 의해 발생 하는 염증 반응을 분석. typhimurium biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 (그림 3) 코팅. 코팅 및 비 코팅 미 감염 BMDMs에서 supernatants typhimurium 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 분 비 인터 루 킨-6 (일리노이-6)의 감염의 24 h 후 수집 했다. S의 코팅입니다. 비타민 b 복합체와 streptavidin 활용 자석 구슬 typhimurium 대 식 세포의 염증 반응을 크게 변경 되지 않았다.
이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 박테리아 포함 된 phagosomes의 순수성을 평가 하기 위해 우리는 고립 된 mCherry-S분석. typhimurium-immunoblotting 여 phagosomes를 포함 하. MCherry 태그에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여, 우리 mCherry 표현 S의 중대 한 풍부를 발견. typhimurium 동일한 샘플 (그림 4)에서 얻은 cytosolic 분수에 비해 절연된 phagosomes에. MCherry- S를 포함 하는 고립 된 phagosomes. biotin 이전 코팅 하지 했다 typhimurium 부정적인 제어로 사용 되었다. 이 결과 박테리아에서 풍성 하 게 높은 phagosomes의 정화에 대 한이 프로토콜을 사용 하는 방법을 보여 줍니다.
우리는 다음 수행에서 고립 된 phagosomes 포함 하는 Sendosome와 리소좀 마커의 immunoblot 분석. typhimurium (그림 5)입니다. Endosome와 리소좀 마커의 대부분 phagosomes 4 h 30 분에 비해 감염 된 후에 격리에서 명확 하 게 관찰 되었다. Rab5 endosomal 마커의 농축 Rab7,으로 리소좀 마커 v-ATPase (V0 와 V1 subunits) 및 cathepsin D, 관찰 되었다. 흥미롭게도, 4 h 감염 된 후에 격리 된 phagosomes에서 cathepsin D의 쪼개진된 양식만 관찰 되었다. 프로 cathepsin D의 분열 (48 kDa) 짧은 활성 폼 (33 kDa)를 생산 하는 phagosome 격리이 프로토콜의 특이성을 보여주는 cytosol에는 phagosomes만 발생 합니다.
이후 마커 바인딩과 그물 (응급실) 미토 콘 드리 아 등 세포에서 종종 박테리아 포함 된 격리 된 phagosomes, S의 준비에서 검색 됩니다. typhimurium-고립 된 phagosomes를 포함 하는 미토 콘 드리 아 Tomm20 전송과 ER 단백질 calnexin (그림 6)에 대 한 특정 항 체를 조사 했다. 우리는 또한 분해 효소 GAPDH 격리 된 phagosomes에 있는 cytosolic 오염 평가 대 한 항 체와 그들을 시험 했다. 우리 S에서 미토 콘 드리 아와 응급실 마커를 발견. typhimurium-cytosolic 오염 없이 하지만 phagosomes 절연.
박테리아를 포함 하는 phagosomes, biotin streptavidin 활용 자석 구슬의 격리에 대 한 프로토콜의 다양성 연구 코팅 절차는 그람 양성 박테리아 S. 구 균에 적용 되었습니다. 같은 고정을 사용 하 고 mCherry-S에 대 한 설명 된 대로 프로토콜을 얼룩이 지기. typhimurium (그림 1) 우리가 확인 녹색 형광 단백질 (GFP)의 성공적인 biotinylation 표현-S. 구 균 (그림 7). 또한, 우리 감지 endosome 마커 Rab7와 리소좀 마커 v-ATPase (V0 소 단위)의 농축 및 cathepsin D immunoblot 분석에 의해 절연 GFP-S. 구 균-포함 하는 phagosomes (그림 8). 그것의 성숙한 모양에 cathepsin D의 분열 후 격리 phagosome 샘플 cytosolic 분수에만 감염의 4 h 감지만 했다. S. 구 균격리-포함 phagosomes 무료로 cytosolic 오염의 GAPDH의 immunodetection에 의해 같이 했다.
요약 하자면, 우리는 우리의 phagosome 격리 프로토콜 고도로 농축된 박테리아 포함 된 phagosomes, cytosolic 오염 무료의 격리 수 증명 하고있다. 격리 phagosome 준비 pha 공부 endosome와 리소좀 마커 분석에 사용할 수 있습니다.gosome 성숙입니다. 또한, 그것은 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에이 프로토콜을 사용할 수 있습니다 및 라벨링 절차 대 식 세포의 면역 응답을 변경 하지 않습니다 표시 했다.
그림 1: 형광 현미경 분석 biotinylated S. typhimurium Cy5 Streptavidin를 사용 하 여. BMDMs는 mCherry-S와 함께 30 분 동안 감염 되었다. typhimurium 했다 biotinylated ("Biotinylated S. 토니"),이 프로토콜에 설명 된 대로. Biotinylated 하지 mCherry-S. typhimurium ("안 biotinylated S. 토니") 부정적인 통제로 사용 되었다. 고정 셀의 permeabilization 후에, 샘플 4 ° c.에 20 분와 Cy5 Streptavidin incubated 했다 핵 (DAPI), mCherry-미 에서 형광 신호 typhimurium와 Cy5 Streptavidin confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석 되었다. Cy5 Streptavidin에서 신호 이전 biotin, 효율적인 biotinylation 확인으로 표시 하는 박테리아에만 감지 수 있습니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: BMDMs mCherry-S와 감염의 현미경 분석. typhimurium biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 코팅. BMDMs는 mCherry-S.typhimurium 이 프로토콜에서 설명 된 대로 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 표시 감염 되었습니다. 허용한 후에 30 분 동안 박테리아 phagocytize 하 대 식 세포, 세포 실시간에 20 분 동안 4% 포름알데히드로 고정 했다 대 식 세포에 의해 phagocytized 코팅된 박테리아는 그 때 되었다 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석. 분석 코팅된 박테리아의 섭취 보여주었다 ("코팅 S. T.") 레이블이 없는 mCherry 박테리아의 섭취에 비해 (" S를 입히지 않는다. T."), biotin과 자석 구슬 streptavidin 활용 된 그 라벨을 보여주는 S의 식 균 작용을 변경 하지 않습니다. 대 식 세포에 의해 typhimurium . 핵은 현미경 시각화를 위한 DAPI와 얼룩이 있었다. 데이터는 ± S.E.M., 의미 그리고 통계적 의미 학생 t를 사용 하 여 계산-테스트로 표시 됩니다 * p = < 0.05; * * p = < 0.01; p = < 0.001. 눈금 막대 = 40 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: BMDMs에 의해 일리노이-6 분 비 감염 biotin 후 streptavidin 활용 자석 구슬, S표시. typhimurium 레이블 없는 S에 비해. typhimurium . BMDMs 미 감염 했다 typhimurium 이 프로토콜에서 설명 된 대로 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 코팅. 감염의 24 h 후 supernatants ELISA에 의해 일리노이-6 분 비의 추가 분석을 위해 수집 되었다. Supernatants BMDMs 코팅된 S감염 양식. typhimurium 컨트롤으로 사용 되었다. 일리노이-6 분 비 코팅 S의 감 응 작용. typhimurium이 했다 uncoated S에 비해 상당히 다른. typhimurium. 데이터 ± S.E.M., 의미 표시 됩니다 그리고 학생 t-검정을 사용 하 여 계산 하는 통계적 의미는로 표시 * p = < 0.05; * * p = < 0.01; p = < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 고립 된 phagosomes에 세균성 농축. MCherry 태그 미 의 농축 격리 된 phagosomes 30 분 후에 감염의 4 h 수집에 typhimurium cytosolic 분수와 비교 되었다. Β-말라 로드 제어로 사용 되었다. 부정적인 통제 phagosomes 코팅된 S를 사용 하 여 격리를 말합니다. typhimurium 감염 된 30 분 후. Phagosome 격리 레이블 없는 미 를 사용 하 여의 예상된 최종 출력 typhimurium mCherry 또는 β-말라, 프로토콜의 특이성을 보여주는의 상당한 금액을 표시 하지 않습니다. 20 µ g 단백질의 샘플 당 로드 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 고립 된 Sendosome와 리소좀 마커 분석. typhimurium-포함 하는 phagosomes. Endosome 마커 Rab5 및 Rab7, 리소좀 마커 v-ATPase (V0 와 V1 subunits) 및 cathepsin D의 농축 분리 S분석 했다. typhimurium-30 분 및 감염의 4 h 후 추출 하는 phagosomes를 포함 하. Β-말라 로드 제어로 사용 되었다. 20 µ g 단백질의 샘플 당 로드 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 미토 콘 드리 아, 응급실, 및 고립 된 Scytosolic 마커 분석. typhimurium-포함 하는 phagosomes. Cytosolic 표식 GAPDH, 응급실 마커 calnexin 및 미 에 미토 콘 드리 아 마커 Tomm20 30 분 4 h 감염 된 후에 격리 typhimurium phagosomes immunoblotting 분석 되었고 해당 cytosolic 분수에 비해. 20 µ g 단백질의 샘플 당 로드 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: GFP-S. 구 균 의 현미경 분석 감염 세포. BMDMs S감염 되었습니다. 균 표현 하는 녹색 형광 단백질 (GFP) 표시와th biotin 미 라벨에 대 한 방법론에 설명 된 대로 typhimurium. 후 30 분에 대 한 박테리아 phagocytize 하 대 식 세포 수, 세포 고정 했다. Uncoated S. 구 균 ("하지 biotinylated S. A.") 부정적인 통제로 사용 되었다. 고정 셀의 permeabilization 후에, 샘플 4 ° c.에 20 분와 Cy5 Streptavidin incubated 했다 핵 (DAPI)에서 형광 신호 GFP-S. 균와 Cy5 Streptavidin confocal 현미경 검사 법에 의해 분석 되었다. Cy5 Streptavidin에서 신호는 이전 biotin, 효율적인 biotinylation을 확인으로 표시 하는 박테리아에만 볼 수 있었다. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 고립 된 Sendosome와 리소좀 마커 분석. 균-포함 하는 phagosomes. S. 균-immunoblotting phagosomal 마커 Rab5, Rab7, 및 해당 cytosolic 분수에 비해 v ATPase에 의해 분석 되었다 phagosomes 30 분, 2 시간, 그리고 감염 된 후 4 h에서 격리를 포함. 20 µ g 단백질의 샘플 당 로드 되었습니다. 샘플 또한 GAPDH, 그 절연 S시연에 대 한 특정 항 체로 테스트 했다. 균-포함 phagosomes cytosolic 오염 자유롭다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
미 의 격리에 대 한 새로운 방법 typhimurium-여기 설명 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 박테리아를 코팅 하 여 phagosomes를 포함 하. 부드러운 파괴 후 세포 막의, 포함 하는 박테리아 phagosomes 추출할 수 있습니다 쉽게 자기 선반을 사용 하 여. 우리는 박테리아의 라벨 염증을 유발 하는 병원 체의 용량을 유지 하 고 호스트 세포의 phagocytic 속성을 변경 하지 않습니다 보여줍니다. 중요 한 것은,이 방법에 의해 얻은 phagosomes 풍성 하 게 박테리아와 endosome/리소좀에 마커 및 cytosolic 오염 없는.
이 방법은 자당 그라데이션 분리를 고용 하 고 전통적인 phagosome 격리 방법에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 그것은 시간이 걸리는 연구원 적은 시간에 더 많은 샘플을 처리 하 고 쉽게 단계 세척의 수를 증가 시켜 순수한 phagosome 샘플을 얻을 수 있도록 여러 원심 분리 단계를 제거 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 ultracentrifugation 등 전문적이 고 민감한 장비에 대 한 필요가 없다. 고속 원심 vesicles의 특성을 변경 하 고 최종 수확량22이 프로토콜에 피해를 줄일 수 있습니다. 우리는 또한 증명 하고있다 그 미 의 코팅 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 typhimurium phagocytic 세포 용량을 변경 하지 않습니다. 또한, 감염 된 대 식 세포에 의해 일리노이-6의 유도 표시 S. typhimurium이 했다 레이블이 없는 박테리아로 감염 된 세포에 비해 변경. 따라서, 미 의 코팅 Typhimurium 그들의 pathogenicity에 상당한 변화를 유도 하지 않습니다. 우리의 지식, 미 의 코팅 typhimurium 일반적인 실험실 분석 기법에 대 한 격리 된 phagosomes의 사용에 대 한 장애를 나타내지 않습니다.
S. typhimurium-포함 phagosomes이이 방법에 의해 고립 된 박테리아와 현재 일반적인 endosomal 및 v ATPase subunits V0 와 V1 등 쪼개진된 성숙한 protease lysosomal 마커 풍성 하 게 cathepsin D는 격리 phagosome 분수에만 검출 될 수 있다. 또한, 우리 있는 미토 콘 드리 아 및 응급실 마커 고립 된 미 typhimurium-phagosomes를 포함 하. 응급실에와 phagosomes의 상호 작용 하지만 널리 공부 하고있다에 응급실에서 단백질의 양을 포함 하는 병원 체 phagosomes 공부 하는 병원 체와 셀 형식이 다를 수 있습니다. 예를 들어 phagosomes 세라 abortus 비 직업적인 식 세포에서 격리를 포함 하는 응급실 마커23 만 대24에서 격리 아닙니까 풍부 합니다. Calnexin 이전 미 에서 발견 되었습니다. Typhimurium 포함 된 phagosomes 자당 그라데이션18에 의해 분리 불활성 구슬 포함 된 phagosomes 및 미토 콘 드리 아의 가까운 상호 작용 이전에 보고 된25, 격리 된 phagosomes에서 Tomm20의 존재를 설명 했습니다. 미토 콘 드리 아 단백질 L. pneumophila26 또는27 진 균포함 하는 고립 된 phagosomes에서 발견 되었습니다. 그러나, 자당 기온 변화도 원심 분리 방법을 사용 하 여 격리 된 병원 체 포함 된 phagosomes의 준비 구성 요소 미토 콘 드리 아의 탐지 수시로 되었습니다 믿고 있다이 세포 기관이의 비슷한 밀도 때문에 고 phagosome 병원 체를 포함 하 고, 따라서 불특정28. 우리의 방법 같은 오염 문제를 방지 하 고 미토 콘 드리 아 막 phagosomal 멤브레인과 어울려 수 있습니다 제안 하는 더 신뢰할 수 있는 정보를 제공 합니다. 요약 하면, 그것은 어려운 것을 포함 하는 병원 체에 응급실과 미토 콘 드리 아를 피하기 위해 절연 호스트 세포 유형 및 병원 체에 따라 phagosomes 준비. 서쪽 오 점 하 여 박테리아의 탐지에 대 한 태그 박테리아와 항 체 특정 태그를 사용 하 여 격리 된 phagosomes의 순수성의 확인에 대 한 권장 되는 방법이입니다. 우리는 또한이 격리 메서드 biotinylated를 될 수 있는 사용 가능한 표면 아민 그룹과 다른 미생물에 대 한 적용할 수 있습니다 보여줍니다. 예를 들어, 우리가 성공적으로 우리의 프로토콜 S. 구 균분리 적용-phagosomes를 포함 하. S. 구 균 이 프로토콜을 사용 하 여 격리를 포함 하는 phagosomes v ATPase (V0 소 단위)와 Rab7, 리소좀과 endosome 표식에 각각, 농축은 하지만 GAPDH 같은 cytosolic 마커를 표시 하지 않습니다.
Endosomal/phagosomal 소포 병원 체의 저하에 대 한 독특한 환경을 제공 하지만 신호 적응 면역 시스템에 대 한 항 원 유지. 비록, phagosomes 및 성숙 과정 광범위 하 게 조사 되어, 다양 한 병원 균을 호스팅 시 phagosome에 microenvironment 애매 남아 있습니다. 그것은 또한 분명 셀 신진 대사 변화 phagosome 성숙 및 내용을 변경 하는 방법. 따라서, 여기서 설명 하는 프로토콜 phagosome 속 다양 한 병 리의 맥락에서 그것의 기능을 공부 하 고 더 많은 기회를 제공 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
로빈슨의 실험실에서 연구 Aging-Associated 질병, 쾰른 대학, 독일에서에서 세포질 긴장 응답에 쾰른 우수 클러스터에서 자금에 의해 지원 됩니다 (CECAD; 독일 연방의 우수 이니셔티브에서 DFG, 투자 및 정부 국가)와 도이치 가운데 (SFB 670), 쾰른 재산, 그리고 쾰른, 독일의 대학의 마리아 Pesch 재단에서 교부 금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
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