Method Article

Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

DOI:

10.3791/56523

⸱

January 1st, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Ziel dieses Protokolls ist eine effektive Methode, um decellularize und Entkalken Maus Cochleae zur Nutzung als Gerüste für Tissue-engineering-Anwendungen zu demonstrieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei Säugetieren, Mechanosensory Haarzellen, die Anhörung fehlt die Fähigkeit zu regenerieren, zu erleichtern hat die Behandlungen für Hörverlust beschränkt. Aktuelle Strategien der regenerativen Medizin konzentrierten sich auf die Transplantation von Stammzellen oder genetische Manipulation der umliegenden Stützzellen im Innenohr zu ermutigen, Ersatz der beschädigten Zellen, Verlust der Hörfähigkeit zu korrigieren. Doch die extrazelluläre Matrix (ECM) kann spielen eine entscheidende Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der Funktion der Haarzellen und nicht gut untersucht. Mit dem Cochlea-können ECM als Gerüst zu adulten Stammzellen wachsen einzigartige Einblicke in wie die Zusammensetzung und die Architektur der extrazellulären Umgebung aids Zellen bei der Aufrechterhaltung des Gehörs. Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und einem Cochleae von Mäusen, als Gerüste akzeptieren perfundierten adulten Stammzellen zu verwenden. In dem aktuellen Protokoll sind Cochleae isoliert euthanasierten Mäuse, decellularized und entkalkt. Danach wurden menschliche Wharton Gelee Zellen (hWJCs), die aus der Nabelschnur isoliert wurden sorgfältig in jedem Cochlea durchblutet. Die Cochleae dienten als Bioreaktoren, und Zellen waren für 30 Tage vor einer Bearbeitung für die Analyse kultiviert. Decellularized Cochleae identifizierbare extrazelluläre Strukturen beibehalten, aber das Vorhandensein von Zellen oder spürbare Fragmente von DNA nicht offenbart. Zellen in die Cochlea durchblutet erobert die meisten von Interieur und Exterieur der Cochlea und wuchs ohne Zwischenfall über eine Dauer von 30 Tagen. So kann die aktuelle Methode verwendet werden, wie Cochlea-ECM Affekte Zellentwicklung und Verhalten zu studieren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Cochlea ist eine komplizierte Spiralstruktur in das Felsenbein gefunden. Es besteht aus einem äußeren knöchernen Labyrinth und eine konzentrische, innere Membranous Labyrinth1. Die Membranous Labyrinth besteht aus drei fließende Räume: Scala Vestibuli, Scala Media und Scala Pauke1. Die Scala Media beherbergt das sensorische Epithel, die aus einer Vielzahl von Zelltypen besteht, aber die sensorischen Haarzellen (HC), die mechanischen Energie in Schallwellen in Nervenimpulse2transduzieren, von besonderem Interesse sind. Belastung durch Knalltrauma3,4,5, Medikamente6, Krankheit7,8und Altern9 kann alle Beeinträchtigung der auditiven Funktion über HC Tod führen. Haarzelle Verlust bei Säugetieren ist dauerhaft, im Gegensatz zu Vogelgrippe HCs, die nach Verletzungen10regenerieren können.

Eine Vielzahl von zeitgenössischen Forschungsbemühungen haben versucht, Wiederherstellen von verlorenen HCs, obwohl die spezifische experimentelle Ansätze variieren. Manipulation der gen-Expression in den sensorischen Epithel und Implantation von Stammzellen differenzierte außerhalb des Körpers sind dominante Ansätze im Bereich, obwohl Induktion Methoden, die darauf abzielen, Stammzellen in Cochlea Organellen zu unterscheiden gewesen 11,12,13versucht. Jeder dieser Ansätze ist entweder direkt auf Stammzellen oder die Entwicklungsstörungen Cues verwendet durch Stammzellen; jedoch eine zweite geteilt und potenziell kritische Element ist das ECM der Cochlea selbst14,15.

ECM bietet nicht nur physische Unterstützung für Zellen und Gewebe, die eine Oberfläche für die Zelladhäsion, Proliferation, überleben und Migration, aber auch spielt entscheidende Rolle bei der Entwicklung der HCs und die Spirale Ganglion15,16 ,17. Natürlich bietet vorkommende ECM induktive Signale, die Zelle Phänotyp Entschlossenheit und/oder Zelle Adhäsion, Vermehrung und überleben18führen können. Daher die Verwendung von decellularized Cochlea in Kombination mit kultivierten hWJCs bieten eine einmalige Gelegenheit, die Rolle der ECM und HC Regeneration zu erforschen. HWJCs sind eine schnell verfügbare, unumstrittenen Zelltyp abseits der menschlichen Nabelschnur, die Verhalten sich wie mesenchymalen Stammzellen19. HWJCs haben die Fähigkeit zu differenzieren, neurosensorische Zelle Linien20,21gezeigt. So beschreibt das aktuelle Protokoll der Isolation, Decellularization und Durchblutung des Cochleae von C57BL Maus Kadaver mit hWJCs für das Innenohr Tissue Engineering.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren, einschließlich tierischen Euthanasie wurden entsprechend dem genehmigten institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Protokoll (ACUP #2014-2234) an der University of Kansas Medical Center (KUMC) durchgeführt.

Hinweis: HWJCs wurden isoliert von menschlichen Nabelschnur, die von den Patienten gespendet wurden, die Einwilligung zur Verfügung gestellt und Proben dienten im Einklang mit den Protokollen von der University of Kansas menschlichen Themen Ausschuss (KU-IRB #15402) genehmigt.

1. Felsenbein Ernte und Cochlea-Isolation

  1. Enthaupten Sie eine entsprechend euthanasierten, 15 Wochen alten Maus durch Schneiden zwischen dem Schädel und dem ersten Halswirbel mit einem scharfen chirurgische Schere zu, dann sprühen Sie den Kopf mit 70 % Ethanol (Abbildung 1A) zu desinfizieren.
  2. Halbieren Sie den Schädel in einer Mitte-sagittale Ebene mit den gleichen scharfen chirurgische Schere (Abbildung 1 b-C, gestrichelte Linien).
  3. Entfernen Sie das Hirngewebe aus dem Schädel mit einer Zange (Abb. 1, Pfeil).
  4. Identifizieren des Schläfenbeins durch die Anwesenheit des auditorischen und Vestibular Nervenwurzeln (Abb. 1E-F, Pfeilspitzen) auf der Innenseite des Schädels und der Gehörgang von außen (Abb. 1F, Pfeil). Schneiden Sie vorsichtig durch den Schädel des Schläfenbeins vom Rest des Schädels (Abbildung 1) zu isolieren.
    Hinweis: In einigen Fällen kann es zart hebeln die umliegenden Knochen des Schädels vom Temporal Knochen ohne Schneiden möglich.
  5. Einfügen der feinen Zange in die Öffnung des Gehörgangs ca. 5 mm (Abbildung 1 H), so dass die Spitzen nicht riskieren Durchbohrung der Cochlea. Sanft aufbrechen die Knochen von Pufels (Abbildung 1 H, Top rot schraffierte Fläche) so dass es Frakturen (Abbildung 1I, rote gepunktete Linie).
    Hinweis: Bei Bedarf kann eine Dissektion Mikroskop dabei Hilfe für präzise Positionierung und Handhabung der Instrumente zu gewährleisten.
  6. Mit feinen Pinzette, Hebeln Sie entfernt den Rest der Bulla aus dem Felsenbein, Freilegung der knöchernen Labyrinths der Cochlea (Abbildung 1J, roten Klammern).
  7. Legen Sie eine Petrischale groß genug für das Felsenbein (z.B., 30 mm oder größer) unter dem sezieren Umfang Sichtfeld und füllen es mit genügend Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zur Deckung des Schläfenbeins (z.B. 0,5 bis 1 mL).
  8. Tauchen Sie das Felsenbein mit der Bulla in PBS mit ovalen und runden Fenster der Cochlea nach oben entfernt.
    Hinweis: Entfernen des vestibulären Systems aus der Cochlea ist nicht notwendig, da das vestibuläre System auch als Griff dient für Manipulation und Funktionen der Cochlea (Abbildung 1I und Abbildung 2 b) orientieren.
  9. Mit einer ultra-feine Pinzette, entfernen Sie die stapedial Arterie, die durch den Steigbügel führt.
  10. Legen Sie eine Spitze der ultrafeinen Zange durch den Bogen von den Steigbügel, wo die Arterie durchlaufen, und zart heben Sie die Steigbügel nach oben. Die Sauropoden Steigbügel sollten deaktivieren des ovalen Fensters aufheben.
  11. Mit einer Spitze der ultra-feine Zange, Punktion des Ovals und Runde Fenster.
  12. Gefüllt mit einer 1 X PBS 28,5-Gauge-Spritze mit Schlauch (Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm) befestigt, positionieren Sie den Schlauch über das ovale Fenster (Abbildung 2A -B).
    Hinweis: Die Öffnung des Röhrchens manipuliert werden kann mit ultra-feinen Pinzette helfen, die um genaue Platzierung zu gewährleisten.
    1. Verwenden Sie frische Spritze und Schläuche für jede Cochlea.
  13. Perfundieren Sie 2 mL 10 % Antibiotikum Antimykotikums (Anti-Anti) und 10 % Penicillin-Streptomycin (Stift-Strep) mit PBS-Puffer durch die Cochlea über 5 min die Perilymphe zu entfernen. Zu schnell mit zu viel Druck Vorrichtung beschädigen die feinen Strukturen in der Cochlea.
    Hinweis: Manuell fahren die Spritze von hand um die Flüssigkeit durch die Cochlea durchspülen ist wirksam, obwohl eine Perfusion Pumpe als Alternative verwendet werden könnte.
    1. Verwenden Sie manuelle Vorrichtung, ein paar feine, selbstschließende Pinzette zur Stabilisierung der Cochlea (Abbildung 2A) während der Perfusion durch das Greifen des vestibulären Teils des Schläfenbeins.
      Hinweis: Obwohl nicht erforderlich, dies lässt beide Hände frei, Instrumente zu behandeln; Einerseits kann die Spritze (Abbildung 2A) fahren, während die andere den Schlauch positionieren kann entsprechend (Abb. 2 b).
    2. Von diesem Schritt vorwärts, kümmern uns um die Cochlea unnötig an der Luft auszusetzen zu vermeiden. Einführung von Luftblasen in die fließende Räume Flüssigkeitszirkulation blockiert, und weitere Austrocknen die feinen Strukturen in der Cochlea beschädigt.
  14. Entfernen Sie und entsorgen Sie alle restlichen Muskel und Knochen Fragmente mit feinen Pinzette.
  15. Gegebenenfalls speichern Sie isolierten Cochleae bei 4 ° C in Anti-Anti 10 % und 10 % Stift-Strep Lösung mit PBS-Puffer für bis zu sieben Tage mit regelmäßigen Änderungen antibiotische Lösung alle 48 h.

(2) Cochlea-Verarbeitung

  1. Decellularization
    1. Für jede Cochlea füllen ein 20-mL-Glas funkeln Fläschchen mit einer 1 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Lösung in deionisiertes (DI) Wasser, das verwendet wird, um decellularize die Cochlea.
    2. Schneiden Sie die Spitze weg von einem Kunststoff 7 mL Transferpipette mit einer Rasierklinge, so dass die Öffnung groß genug für ein Cochlea ist passieren.
    3. Mit der Transferpipette, sanft Aufstellen der Cochlea in die Pipette also es nur die Cut-off Rand um wenige Millimeter geht.
    4. Die Cochlea in 1 % SDS-Lösung gefüllt funkeln Fläschchen zu vertreiben.
    5. Zirkulieren Sie 2 mL 1 % SDS deionisiertes (DI) Wasser durch die Cochlea im Funkeln Fläschchen mit einer Transferpipette.
    6. Legen Sie das Funkeln-Fläschchen in ein Rotator und ermöglichen Sie das Funkeln Fläschchen mit 10 u/min für 72 h bei Raumtemperatur rotieren.
      1. 1 % SDS-Lösung alle 24 h über einen Zeitraum von 72 Stunden zu ändern. Vorsicht beim SDS um der Cochlea an die Luft setzen Sie niemals ändern.
    7. Die Cochlea dreimal für jeweils 30 min. mit VE-Wasser zu waschen.
Führen Sie Waschungen in dem gleichen funkeln Vial verwendet für die SDS-Gebühren; in diesem Stadium ist die Cochlea decellularized.
  • Entkalkung
    1. Entfernen des Restwassers DI aus der Durchstechflasche funkeln, verlassen gerade genug, um die Cochlea eingetaucht.
    2. Fügen Sie Entkalkung zunächst 5 mL 10 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (0,02 M) in VE-Wasser, das Funkeln-Fläschchen mit der Cochlea.
    3. Zirkulieren Sie 2 mL 10 % EDTA DI Wasser durch die Cochlea im Funkeln Fläschchen mit einer Transferpipette.
    4. Das Funkeln Fläschchen zurück in den Rotator, und ermöglichen Sie das Funkeln Fläschchen mit 10 u/min für 72 h bei Raumtemperatur rotieren. Wechseln Sie die 10 % EDTA Lösung alle 24 h über einen Zeitraum von 72 h. Vorsicht beim Lösungen zu ändern, so dass die Schnecke nicht Luft ausgesetzt ist.
    5. Spülen Sie die Cochlea 3 Mal für jeweils 2 h mit 1 X PBS; in diesem Stadium ist die Cochlea entkalkt.
  • Lagerung
    1. Speichern der Cochleae für bis zu 72 h in einer 10 % Anti-Anti, 10 % Feder-Strep Lösung mit PBS-Puffer bei 4 ° c
      Hinweis: Längere Lagerung können mit regelmäßigen Änderungen antibiotische Lösung möglich sein; längere Lagerung von verarbeiteten Cochleae wurde jedoch nicht in diesem Protokoll validiert.

    • 3. Beschaffung und den Ausbau der hWJCs

    1. HWJCs nach zuvor veröffentlichten Protokolle22zu isolieren. Kurz, Segment Nabelschnüre in 3-cm-Abschnitte.
    2. Machen Sie sorgfältig einen flachen Schnitt mit einem Skalpell auf jedem Segment der Nabelschnur zu entrollen und setzen die Wharton Gelee von der Nabelschnur in Längsrichtung. Verwenden Sie Zange um die Blutgefäße zu entfernen.
    3. Waschen Sie Segmente der Nabelschnur zweimal mit genügend PBS (z.B. 40 mL in einem 60 mm Petrischale), um das Gewebe zu tauchen. Hacken Sie fein Gewebe Segmente mit einem Skalpell. Gewebe in einem 100 mm Petrischale mit 50 mL Verdauung Medium zu verdauen (0,2 % Typ 2 Kollagenase, 1 % Penicillin-Streptomycin, in niedrig-Glukose Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM)).
    4. Legen Sie Gewebe bei der Verdauung von Medium auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min über Nacht in einer 5 % CO2, 37 ° C Inkubator. Am nächsten Tag Verdauung Medium in einem Verhältnis von 01:16 in 2 % Antibiotikum Antimykotikums in PBS verdünnen und pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g bei Raumtemperatur (~ 27 ° C) für 10 min. verwerfen überstand.
    5. Aufschwemmen Sie Pellets in mesenchymale Stammzellen Wachstum Medium (MSCGM) und rekombinieren Sie Zellen. Platte Zellen bei einer Dichte von 7 x 103 Zellen/cm2 in Gewebekultur behandelt T-75 Flaschen. Kultur HWJCs in MSCGM, und erweitern Sie auf Abschnitt 5 für Experimente.
      Hinweis: HWJCs können Sub kultiviert werden in größeren T-Fläschchen (z.B.t-150, T-300) beim Passagierung zur Erhöhung der Ausbeute an hWJCs für Experimente.

    (4) Infusion von hWJCs in Decellularized Cochleae

    1. Bereiten Sie decellularized cochleae
      1. Mit aseptischen Technik gespeicherten Cochleae in 1 X PBS dreimal für jeweils 30 min. waschen.
      2. Cochleae in separaten Vertiefungen einer 24-Well-Platte übertragen, und fügen Sie 1 mL von 37 ° C vorgewärmt MSCGM.
      3. Inkubieren Sie Cochleae in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator für ein Minimum von 1 h vor der Infusion von Zellen.
    2. HWJCs distanzieren und Aufschwemmen
      1. Waschen hWJCs mit 37 ° C vorgewärmt es 1 X PBS zweimal.
      2. Fügen Sie genügend 37 ° C vorgewärmt Trypsin mit 0,5 % EDTA an die Zelloberfläche Schiff zu decken.
      3. Inkubieren Sie hWJCs für bis zu 5 min in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator.
        1. Vergewissern Sie sich, dass 90 % der Zellen von der Zelloberfläche Kultur getrennt haben, indem Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop ansehen.
          Hinweis: Zellen, die sich bewegen, wenn das Kulturgefäß sanft getippt wird, getrennt haben. Zellen, die stationär bleiben, nicht gelöst haben.
        2. Klopfen Sie leicht die Seiten des Kolbens, weiteren angeschlossene Zellen verdrängen.
      4. Aseptischen Technik verwendet, Transfer hWJCs aus dem Kulturgefäß für eine 50mL konische Röhrchen mit gleichwertigem Umfang des MSCGM auf das Volumen des Trypsin, die Zellen zu trennen.
      5. Pellet-die hWJCs durch Zentrifugieren bei 500 X g bei Raumtemperatur (~ 27 ° C) für 5 Minuten.
      6. Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie hWJCs in MSCGM in einer Konzentration von 500.000 Zellen/mL.
    3. Perfundieren cochleae
      1. Übertragen Sie Cochleae auf einen neuen 24-Well-Platte mit einer Transferpipette.
      2. Einen Tropfen des MSCGM auf jede Schnecke, Cochlea Austrocknen verhindert wird.
      3. Zart orientieren Sie die Cochlea mit ultra-feine Pinzette, so dass die ovalen und runden Fenster sind nach oben.
        Hinweis: Extreme Vorsicht im Umgang mit direkt jede Schnecke da die Cochlea leicht beschädigt ist.
      4. Mit einer sterilen 28,5-Gauge-Insulin-Spritze mit angeschlossenen Schläuchen, erarbeiten von 0,2 mL Nukleinsäuretablette hWJCs (100.000 Zellen).
      5. Positionieren Sie mit sterilisierten feine Pinzette, Schlauch über das ovale Fenster.
      6. Zart und langsam durchspülen die Cochlea mit 0,2 mL resuspendierte hWJCs mit einer 28,5-Gauge Insulin Spritze verbunden mit Polyethylen-Rohre (Außendurchmesser: 0,61 mm, Innendurchmesser: 0,28 mm) über ca. 5 min.
      7. Fügen Sie nach der Perfusion, 0,8 mL von 37 ° C vorgewärmt MSCGM, die gut mit der Cochlea, das Gesamtvolumen in den Brunnen zu 1 mL zu bringen.
      8. Wiederholen Sie Schritte 4.3.3-4.3.7 für jede Schnecke, mit einer frischen Spritze und Schlauch jedes Mal.
      9. Perfundierten Cochleae in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator und ändern Sie Medien dreimal pro Woche zu.

    (5) Cochlea Ernte und Konservierung

    Hinweis: Cochleae möglicherweise kultiviert und geerntet zu jedem Zeitpunkt bis zu 30 Tage nach dem Perfusion.

    1. Um Cochleae zu bewahren, in 4 % Paraformaldehyd in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C auf einem schaukelnden Plattform zu beheben.
    2. Waschen Sie nach der Fixierung Cochleae mit 1 X PBS drei Mal für 5 Minuten.
    3. Allmählich austrocknen Cochlea mit Ethanol und klar mit einem aliphatische Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel vor Einbettung in Paraffin.
    4. Abschnitt-Proben bis zu einer Dicke von 10 µm, die mit einem Mikrotom und Mount auf Glas-Objektträger.
      Hinweis: Die Proben sind nun bereit für histologische oder immunhistochemische Bearbeitung mit standard-Protokolle.

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    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Mithilfe der hier vorgestellten Methoden, erfolgreiche Decellularization Cochleae wurden abgeschätzt, indem untersucht das Vorhandensein oder Fehlen von DNA durch 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung. Cochleae galten als voll decellularized, wenn DNA in der decellularized Cochlea nicht erkannt wurde. Ein native Cochlea aus einer früheren Experiment, die nicht Decellularization oder Entkalkung unterzogen wurde als Positivkontrolle verwendet, um die Strukturen und Zellen, die tradi...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Wir haben erfolgreich gezeigt, dass native Cochlea-Zellen aus der Cochlea über einen Decellularization-Prozess entfernt werden können, ermöglicht die Verwendung der Cochlea als eine komplizierte, dreidimensionale Gewebe-Gerüst. Santi Et Al. 15 die erste Methode für einem Cochleae entwickelt und haben genau die Volumen der durch viele Cochlea-Strukturen mit Hilfe von leichten Merkblatt Mikroskopie23geschätzt. Diese frühen Arbeiten war eine starke Basis für die Geweb...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Das aktuelle Projekt wurde von der University of Kansas Beweis des Konzept-Fonds finanziert. Wir möchte das Pflegepersonal an KUMC (Kansas City, KS) unterstützen uns bei der Beschaffung von menschlichen Nabelschnur und David Jorgensen mit Cochleae Kulturen zu unterstützen.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Allegra X-14R ZentrifugeBeckman-CoulterB08861
    Intramedic Semi-Rigid SchläucheBecton Dickinson427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital ShalerEppendorfM1190-0002
    Chirurgische SchereFine Science Tools14060-10
    Feine PinzetteFine Science Tools11370-40
    Ultrafeine PinzetteFine Science Tools18155-13
    Konische 50-ml-RöhrchenFisherScientific 12565271
    PetrischaleFisher ScientificFB087579B
    U-100 InsulinspritzeFisher Scientific14-829-1B
    SzintillationsfläschchenFisher Scientific03-341-73
    RotatorFisher Scientific88-861-049
    TransferpipetteFisher Scientific22-170-404
    RasierklingeFisher Scientific12-640
    Antibiotikum-AntimykotikumFisher Scientific15-240-062
    Penicillin-StreptomycinFisher Scientific15-140-122
    24-Well-PlatteFisher Scientific07-200-84
    SuperFrost PLUS Objektträger aus GlasFisher Scientific12-550-15
    TransferpipetteFisher Scientific22-170-404
    ProLong Gold Eindeckmittel mit DapiFisher ScientificP36935
    Clear-Rite 3Fisher Scientific22-046341
    Thermo Scientific Forma Serie II 3110 Wasser-Jacekted CO2 InkubatorFisher Scientific13-998-078
    Mesenchymales StammzellwachstumsmediumLonzaPT-3001
    Trypsin-EDTALonzaCC-3232
    TPP T-75 KulturflascheMidSciTP90076
    TPP T-150 KulturflascheMidSciTP90151
    TPP T-300 KulturflascheMidSciTP90301
    SeziermikroskopNikon InstrumentsSMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverses MikroskopNikon InstrumentsMFA51010
    NuAire Klasse II, Typ A2 BiosicherheitswerkbankNuAireNU-425-600
    1X PBSSigma-AldrichP5368-10PAK
    1% SDS LösungSigma-Aldrich436143-100G
    10% EDTASigma-AldrichE9884-100G

    References

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