Methodenartikel

Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

DOI:

10.3791/56605

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8. Dezember 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Rekombinante Prototyp schaumig Virus Integrase Protein ist oft mit einer bakteriellen Nuklease während Reinigung kontaminiert. Diese Methode Nuklease Kontamination identifiziert und entfernt die letzten Vorbereitungen des Enzyms.

Zusammenfassung

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Das Protein Integrase (IN) des Retrovirus Prototyp schaumig Virus (PFV) ist ein Modell-Enzym für die Untersuchung des Mechanismus der retroviralen Integration. Im Vergleich zu IN aus anderen Retroviren, ist PFV IN besser löslich und besser geeignet, um experimentelle Manipulation. Darüber hinaus ist es empfindlich auf klinisch relevante humanen Immundefizienz-Virus (HIV-1) IN Inhibitoren, darauf hindeutet, dass der katalytische Mechanismus der PFV IN ähnlich ist, dass der HIV-1 Zoll IN katalysiert die kovalente Verbindung von viralen komplementäre DNA (cDNA) zum Ziel DNA in einem Prozess namens Strang Transfer. Dieser Transfer Strangreaktion stellt die Ziel DNA Nicks. Analyse der Reaktion Integrationsprodukte kann durch die Anwesenheit von Nukleasen, die DNA ähnlich nick verwechselt werden. Eine bakterielle Nuklease hat sich gezeigt, zusammen mit rekombinanten PFV IN ausgedrückt in Escherichia coli (E. Coli) zu reinigen. Hier beschreiben wir eine Methode um PFV IN von kontaminierenden Nuklease durch Heparin Affinitätschromatographie isolieren. Brüche werden leicht auf Nuklease Kontamination mit supercoiled Plasmid und Agarose-Gelelektrophorese überprüft. PFV IN und die kontaminierenden Nuklease anzeigen alternative Affinitäten für Heparin-Sepharose ermöglicht eine Nuklease-freie Herstellung von rekombinanten PFV IN für biochemische oder einzelne Molekül Massenanalyse Integration geeignet.

Einleitung

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Biochemische und einzelne Molekül Studien von Protein-Interaktionen mit DNA erfordern außergewöhnlich reinen rekombinanter Proteine. Kontaminierende Nukleasen von Bakterien kann die Ergebnisse dieser Tests verdecken. Kontaminierende Nuklease befindet sich in Vorbereitung der rekombinante Proteine Sauerstoff Fänger Protocatechuate-3,4-Dioxygenase (PCD) und Prototyp schaumig Virus (PFV) Integrase (IN) von Escherichia coli (E. Coli)1 isoliert , 2 , 3.

Retroviren Integration Tests verlassen sich auf die Umwandlung von supercoiled DNA,....

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Protokoll

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(1) induzieren PFV im Ausdruck in E. Coli

  1. 20 μL der E. Coli BL21(DE3) pLysS 1 μL des PFV IN Expressionsplasmid (10 ng/μl) hinzufügen (20 μl aliquoten von kommerziell verfügbaren Zellen hat > 2 x 106 KBE/µg Plasmid) in einer 1,5 mL Tube. Mit dem Finger tippen oder streichen das Rohr mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie 5 min auf Eis.
    1. Hitze-Schock für genau 30 s in einem 42 ° c Wasserbad und dann sofort um zu Eis für 2 min zurück.
    2. Fügen Sie 80 μl Raumtemperatur super optimale Brühe mit Catabolite Repression (SOC) Medien. Inkubation für 1 h bei 37 ° c mit 225 Umdrehungen pro....

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Ergebnisse

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Rekombinante PFV IN ist oft mit einer bakteriellen Nuklease1kontaminiert. Biochemische Integration Tests hängen die Quantifizierung der Umwandlung von supercoiled Plasmid DNA zu entspannten Kreisen und lineare Produkte. Das Vorhandensein von kontaminierenden Nuklease könnten falsche Quantifizierung dieser Assays. Ausdruck von PFV IN mit einem Hexahistidine Tag in E. Coli (Abbildung 1) induziert und zuerst gereinigt durch Nickel-Affinitätschromatographie (

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Diskussion

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Rekombinante Proteine, die DNA, interagieren, wie z. B. DNA-Reparatur Proteine, Sauerstofffänger Einzelmolekül-Mikroskopie-Anwendungen oder retroviral Integrases sollte frei von kontaminierenden Bakterien Nukleasen2,3sein. Diese Verunreinigungen können die Interpretation der Ergebnisse in loser Schüttung biochemische oder einzelne Molekül Assays verwechseln.

Wir haben festgestellt, dass eine bakterielle Nuklease Co häufig mit PFV Zoll .......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von NIH AI099854 und AI126742 auf Schlüssel unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BL21/DE3 Rosetta E. coliEMD Millipore70956-4
LB BouillonEMD biosciences1.10285.0500
AmpicillinAmresco0339
ChloramphenicolAmresco0230
PBSSigma-AldrichD8537
IPTG Denville ScientificCI8280
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
Tris Ultra PureGojira FeinchemikalienUTS1003
NaClP212121RP-S23020
PMSF Amresco0754
Imidazol Sigma-AldrichI0250
DTT P212121SV-DTT
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
MgSO4Amresco0662
Agarose Denville ScientificCA3510
EthidiumbromidThermo Fisher ScientificBP1302
GlycerinFisher ScientificG37-20
Ni-NTA SuperflowQiagen30430
Heparin Sepharose 6 Fast FlowGE Healthcare Life Sciences17-0998-01
HRV14 3C Protease EMD-Chemikalien71493-3

Referenzen

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  1. Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
  2. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease....

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Schlagwörter

ProtetreinigungHeparin Affinit tschromatographierekombinantes ProteinSDS PAGENuklease AssayAgarose GelelektrophoresePlasmid DNAE coli Expression

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