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3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

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DOI:

10.3791/56615

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8. Dezember 2017

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1Department of Psychiatry, University of Alberta, 2Alberta Innovates-Health Solutions Interdisciplinary Team in Smart Neural Prostheses (Project SMART), University of Alberta, 3Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 4Division of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alberta, 5Centre for Neuroscience, University of Alberta

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die 3D Kultur der Ratte Gehirn abgeleitet Glia-Zellen, einschließlich der Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Wir zeigen Primärzelle Kultur, methacrylated Hyaluronsäure (HAMA) Hydrogel Synthese, HAMAphoto-Polymerisation und Zelle Kapselung und Probe Verarbeitung für die konfokale und scanning Electron mikroskopische Bildgebung.

Zusammenfassung

In das zentrale Nervensystem, zahlreichen akuten Verletzungen und Neurodegenerative Erkrankungen, sowie implantierten Geräten oder Biomaterialien entwickelt zur Verbesserung der Funktion führen zu dem gleichen Ergebnis: überschüssige Entzündung führt zu Gliosis, Zytotoxizität, und/oder Bildung einer glial Narbe, die kollektiv Verletzung verschlimmern oder gesunde Erholung verhindern. Wir haben mit dem Ziel der Schaffung eines Systems zum Modell glial Narbe Bildung und Studium Entzündungsprozesse leski 3D Zelle in der Lage, Gehäuse primäre kultivierte Gliazellen erzeugt: Mikroglia, die Fremdkörper-Reaktion zu regulieren und die entzündlichen Ereignis, Astrozyten, die Beantwortung um eine faserige Narbe zu bilden und Oligodendrozyten, die in der Regel zu entzündlichen Verletzungen anfällig sind. Das vorliegende Werk bietet eine detaillierte Schritt für Schritt Methode für die Herstellung, die Kultur und die mikroskopische Charakterisierung leski Hyaluronsäure-basierten 3D Hydrogel mit gekapselten Ratte Gehirn abgeleitet Gliazellen. Darüber hinaus werden Protokolle zur Charakterisierung der Zelle Kapselung und das Hydrogel Gerüst durch konfokale Immunofluoreszenz und Rasterelektronenmikroskopie demonstriert, sowie die Fähigkeit, das Gerüst mit bioaktiven Substraten mit ändern Gründung einer gewerblichen Basallamina Mischung zur verbesserten Zelle Integration.

Einleitung

Entzündung des zentralen Nervensystems (ZNS) ist seit langem als ein Markenzeichen von akuten (z.B., ischämischen Schlaganfall, Schädel-Hirn und Rückenmarksverletzungen) und chronische (z.B. Alzheimer, Parkinson und Huntington Krankheiten) CNS Verletzung, aber zunehmend als eine kausale Neurodegenerative und neuropsychiatrische Störungen erkannt wird. Aufrechterhalten oder unangemessen Entzündung kann dazu führen, dass neuronale Schädigung und Demyelinisierung (z.B. Multiple Sklerose) und negativ beeinflussen die Entwicklung des Gehirns(z. B.Schizophrenie, Autismus) und Stimmung Staaten(z. B.Depression, Angst Bipolare Störung). Weitere, neue therapeutische Strategien mit implantierbaren Geräten (zB., Gehirn-Computer-Schnittstellen1,2,3, deep Brain Stimulation4,5, intraspinal Microstimulation6,7,8,9,10) erzeugen eine vorhersehbare Entzündungsreaktion an der Schnittstelle zwischen dem Gerät und der CNS, wodurch eine schützende Gewebe Reaktion, die über die gesamte Lebensdauer des Implantats11Verlust der Wirksamkeit oder Gerät Fehler verursachen können. Entzündung im ZNS ist in der Regel von Mikroglia, initiiert die als Residenten Immunzellen des ZNS verantwortlich für Gewebe Überwachung und Montage der Fremdkörper-Reaktion (bewertete12) fungieren. Abhängig von der Schwere der Beleidigung, Zelltypen die Mikroglia Signal und Rekrut zusätzliche zu einer Verletzung Aufstellungsort. Insbesondere die Mikroglia aktivieren die Astrozyten, die wiederum als sekundäre Entzündungszellen und bilden einen dichten Schutzbarriere zu einer Verletzung Seite13,14enthalten fungieren. Mikroglia kann auch eine Aktivität Kaskade in den Zellen des peripheren Immunsystems initiieren, was in der Aufschlüsselung der BBB erlauben immun Infiltration (rezensiert in Referenz15) führen kann.

Bei Geräte implantiert in das ZNS kann Gewebeschäden infolge Gerät einsetzen sowie die anhaltende Präsenz von ausländischen Gerät einen Prozess bezeichnet glialen Narbenbildung einzuleiten. In diesem Prozess der Mikroglia zu migrieren und vermehren sich an der Stelle der Verletzung. Sie initiieren auch die Freisetzung von Entzündungsfaktoren, potenzielle Bedrohungen zu neutralisieren und zusätzliche Gliazellen zu rekrutieren. Danach aktivierte Astrozyten werden hypertrophe und Verkapselung der implantierten Geräts um eine kontinuierliche faserige Barriere16zu bilden beginnen. Entzündliche Signalgebung dient auch zur Rücknahme der neuronalen Prozessen aus der Umgebung des Implantats zu fördern und schließlich Rekruten Fibroblasten um die entwickelnden glial Narbe17zu verstärken. Die Oligodendrozyten, verantwortlich für die Ummantelung von Nervenzellen im Myelin zur Verbesserung der Leitfähigkeit, diesen Prozess nicht überleben und entfernten Zellen sind vom Implantat nach der Narbe18partitioniert. Glialen Narbenbildung erheblich reduziert, die Funktion und Lebensdauer von Implantaten, insbesondere für Aufnahme Elektroden und letztlich dient dazu, die Funktionalität der neuronale Schnittstellen19zu begrenzen.

Verschiedene Ansätze wurden genutzt, um die Biokompatibilität und Schnittstelle Aktivität von Implantaten in der CNS20,21,22,23. Eine umfassende Überprüfung ist auf das biokompatible Design dieser neuronale Schnittstellen24erhältlich. Die prominentesten Strategien umfassen rund um die Elektrode mit kompatibel Beschichtungen wie Polyelthyleneglycol (PEG), Polymilchsäure-co-Glykol Säuren (PLGA)25, oder die Verbesserung der Elektrode mit leitfähigen Polymeren wie Poly (Ethylen Dioxythiophene) (PEDOT) und Polypyrrol (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioaktive Beschichtungen haben auch eingesetzt worden, um Hinweise für Nervengewebe Wachstum mit Liganden abgeleiteten extrazellulären Matrizen einschließlich Kollagene, Fibronectins und Hyaluronsäure32,33,34 bieten ,35,36,37. Die Bioaktivität dieser Beschichtungen ist weiter erforscht worden mit Wachstumsfaktor Freisetzung Systeme emulieren natürliche Zelle Sekrete30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. gleichzeitig einige Forschungsgruppen haben sich entschieden, die Elektroden-Geometrie, die Flexibilität und die Zusammensetzung der mechanische Konflikt zwischen Gerät und Gewebe51,52,53 verringern umgestalten ,54,55,56,57. Insgesamt haben diese Strategien zu viele vielversprechende Verbesserungen im nächsten Generation neuronale Grenzflächen Geräte, aber die langfristige Kompatibilität geht es laufend und Fortschritt kann durch komplexe und zeitaufwendige in Vivo Modellen behindert .

Tierische modellbasierte Ansätze können experimentelle Durchsatz zu begrenzen und erhöhen die Kosten der Prüfung Elektrode Biokompatibilität. In-vitro- nähert sich mit konventionellen Zellkultur Techniken bieten eine kostengünstige Alternative, aber nicht zu viel von der Komplexität der Interaktion zwischen Gerät und Gewebe58rekapitulieren. Insbesondere Prüfung von Oberflächenbeschichtungen mit 2D Zelle Kultur Grenzen die Modellierung von Elektroden-Geometrie und der Einfluss der mechanischen Konflikt und Micromotion dachte dazu beitragen, eine Wirtsantwort Gerät Fehler59 zur Erzeugung , 60.

Um Probleme im Zusammenhang mit 2D Zellkultur zu überwinden, wurden Hydrogel Kulturen von neuronalen Zellen für eine Vielzahl von Anwendungen, pharmakologische Studien61, entwickelt, um direkte neuronale Zelle Differenzierung62, um Krankheit zu verstehen Wege63,64, oder geschichtete in Kokultur mit anderen Zelltypen Modell Zellwanderung, Neuroprotektion, oder Modell Gewebe Mikroumgebungen61. Hydrogele bilden sich leicht in verschiedenen Größen und Geometrien können zahlreiche Arten von primären oder verewigt Zellkulturen integrieren und Analyse von häufig verwendeten Techniken wie konfokale Fluoreszenzmikroskopie höchst zugänglicher sind. Um ein Modell der Glia Vernarbung zu erstellen, haben wir vor kurzem entwickelt und charakterisiert eine Hyaluronsäure basierte 3D Hydrogel-System für Hochdurchsatz-Prüfung der Glia Reaktion auf implantierten Elektroden (Abbildung 1)65. Dieses System hat einige deutliche Vorteile: 1) primären Gliazellen (Oligodendrozyten, Mikroglia und Astrozyten) sind gekapselt in einer 3D Matrix bestehend aus Polymeren von Hyaluronsäure, welche eine endogene extrazelluläre Matrix Komponente; (2) die Matrix Steifigkeit kann "abgestimmt" werden, um die mechanischen Eigenschaften des Gehirns oder Rückenmarks Gewebe neu zu erstellen; und 3) Zellen können in der Matrix in einem schnellen Benchtop-Ansatz grünes Licht, Begrenzung der Toxizität während Kapselung Photopolymerisation mit gekapselt werden. Dieses System ermöglicht der wichtigsten Features von in Vivo Biokompatibilität: Geräte werden eingefügt in das Hydrogel in vergleichbarer Weise auf Gewebe, und die zelluläre Antwort auf Implantaten sind für eine Vielzahl von Parametern65überwacht. Dazu gehören mechanische Missverhältnis zwischen den Geräten und die Hydrogel-Beschichtungen von verschiedenen Strukturen und Reizstrom-Impulse. Dieses System beinhaltet auch Oligodendrozyt und verwandte Vorläufer, die häufig anwesend und rekrutierten glial Narben sind. Ihre Schäden, Tod und Phagozytose von Mikroglia sind höchst bezeichnend für entzündliche Verletzungen und wie ein Modell Narbenbildung oder Recovery reduziert, sie haben die Fähigkeit, Re-Myelinisierung der Nervenzellen66demonstrieren.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Synthese und Bildung von hybriden Hyaluronsäure Hydrogele in Kombination mit handelsüblichen Basalmembran Formulierungen Zelle Aufnahme zu verbessern. Darüber hinaus demonstrieren wir Ihnen die Übernahme der primären kultivierten glial Zellen (Oligodendrozyten, Mikroglia und Astrozyten) und Analyse der Kultur Wachstum mit Immunocytochemistry und konfokalen Mikroskopie.

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Protokoll

Das Protokoll für die Gehirn-Gewebe-Extraktion von Tag 1 Sprague-Dawley Ratten Welpen, durch Enthauptung, eingeschläfert wurde von der Animal Care und Nutzung hat an der University of Alberta genehmigt.

(1) Mikroglia und Astrozyten Isolationen67,68

Hinweis: Alle Medien für Isolation und Zellkultur wird auf 37 ° C in einem Wasserbad vorgewärmt. Hank es ausgeglichene Salzlösung (HBSS) hat 1 % Penicillin-Streptomycin (PS). Alle Dulbecco geändert Adlers Medien mit Hams F12 Nährstoff-Mischung (DMEM/F12) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (PS) ergänzt wird. Nur Mischungen mit Trypsin fehlt FBS. Alle Materialien in diesem Protokoll sind (Sterilfilter, Alkohol, gekauften und autoklaviert) und jeder Schritt nach Schrittnummer 1.8 erfolgt in einem Schrank mit aseptischen Biosafety.

  1. Pro Gehirn Heizen Sie 15 mL HBSS und 12,5 mL DMEM/F12 auf 37 ° C in 50 mL konische Zentrifuge Röhren und ca. 2 mL von 0,25 % Trypsin mit 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) in einem konischen Zentrifugenröhrchen 15 mL vor. Erhitzen Sie eine zusätzliche 25 mL DMEM/F12. Warmen Trypsin ca. 10 min vor verwenden, um Verlust der Enzymaktivität zu verhindern.
  2. Gießen Sie genügend warme HBSS in sterilen, 6 und 10 cm Kultur Gerichte an die Oberfläche zu decken. Bereiten Sie eine 10 cm Teller für jeden zwei Gehirnen plus einer zusätzlichen 6 cm Schüssel.
  3. Legen Sie bis zu 2 Gehirne in jede 10 cm2 Teller (Abbildung 2A).
  4. Verwenden Sie unter dem Mikroskop Dissektion geschwungener und gerader Zange um den Cortex entlang der Mittellinie und dem Kleinhirn mit Hirnstamm trennen. Daraus ergeben sich drei Abschnitte des Gewebes pro Gehirn (Abb. 2 b).
  5. Schälen Sie die dünne, semi-transparente, Schicht (Meningen) des Gewebes enthält Blutgefäße aus jedem Abschnitt Gewebe und verwerfen, das restliche Gewebe in einer separaten Kulturschale zu übertragen. Fassen Sie die dünnen Schichten mit der Zange durch das Gewebe Kürzungen ausgesetzt und ziehen Sie vorsichtig bis große Teile "das Hirngewebe hängen aus". Schließlich sanft zerrte, um dieses Teil zu entfernen. Siehe Abbildung 2-2E für repräsentative Bilder vor, während und nach diesem Schritt.
  6. Entfernen Sie in ein Kabinett Biosafety die restlichen HBSS aus der Kulturschale, sorgfältig halten das Gewebe. Das Gewebe mit einem Skalpell mazeriert und Gewebe auf der vorgewärmten 15 mL Tube mit Trypsin übertragen.
  7. Inkubieren Sie diese Röhre für 25 min. in einem 37 ° C-Bad, das Gewebe zu verdauen, enzymatisch.
  8. Zentrifugieren Sie das Rohr nach unten bei 500 X g für 2 min bei Raumtemperatur, und gießen Sie den überstand.
  9. Fügen Sie mithilfe einer serologischen 10 mL-Pipette 10 mL warmen DMEM/F12 zu inaktivieren die Trypsin und genannte Lösung 5 Mal, bis das Gewebe zu brechen.
  10. Zentrifugieren Sie das Rohr nach unten bei 500 X g für 2 min bei Raumtemperatur, und gießen Sie den überstand.
  11. Mit einer serologischen 10 mL-Pipette, erneut suspendieren Sie Pellet in 10 mL warmen DMEM/F12 und übertragen Sie die Lösung auf eine 50 mL konische Zentrifugenröhrchen.
  12. Die Lösung mit einer 10 mL Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel, genannte 3 Mal.
  13. Verteilen Sie diese Lösung in Schritten von 12,5 mL warmen DMEM/F12 pro Gehirn.
  14. Pipette 1 mL Schritten die triturierten Lösung in einem 12-well-Platte (1 pro Gehirn).
  15. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2in einem Inkubator befeuchtete Zelle Kultur. Ersetzen Sie Medien nach drei Tagen zu, und aktualisieren Sie Medien alle nachfolgenden drei Tage. Nach 2 Wochen können die Zellen für Experimente gesammelt werden.

2. Macromer Synthese69

  1. 375 mg Hyaluronsäure (HA) Salz in ein 50 mL konische Zentrifugenröhrchen wiegen und 37,5 mL destilliertem Wasser hinzufügen.
  2. Spülen Sie die Lösung mit einem Vortexer für 1 min und beschallen Sie die Mischung, bis es homogen erscheint und seine gelartige Viskosität verliert. Dieser Vorgang dauert 6 Stunden.
  3. Transferlösung für eine 100 mL-Becherglas mit einem magnetischen rühren (38 mm) und kräftig rühren bei Raumtemperatur.
  4. Titrieren Sie 5,0 M NaOH sorgfältig in die Rührschüssel HA und Messen mit pH-Papier, bis der pH-Wert zwischen 8 und 12 stabilisiert.
  5. Sammeln Sie 3 mL frische Methacrylat-Anhydrid (MA, 94 %), bedeckt von Stickstoff während der Lagerung.
    Hinweis: MA ausgesetzt ist die Atmosphäre für lange Dauer (Tage), verliert seine Reaktivität.
    Achtung: Jegliche Nutzung von MA sollte in einem Abzug erfolgen.
  6. Fügen Sie 200 µL der MA in der Rührschüssel HA-Lösung. Die Reaktion senkt den pH-Wert der Lösung unter 8.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 2,4 bis 2,6 bis 3 mL MA wurden hinzugefügt, um die Lösung. Dieser Vorgang kann bis zu 1-2 h dauern.
  8. Lassen Sie die Reaktion weiterhin über Nacht bei 4 ° C, ohne sich zu vermischen.
  9. Lösung, 400 mL kaltem Ethanol (EtOH) in einen 500-mL-Becherglas und Niederschlag für 24-72 h bei 4 ° C. 56
  10. Sorgfältig Dekantieren des größten Teils der Lösung in einen separaten Becher zur Verfügung, und den Niederschlag in einer konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL sammeln. Dies kann in 2-4 Rohre, gegebenenfalls verteilt werden.
  11. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 200 X g in einer Zentrifuge für 2 min bei Raumtemperatur und entsorgen des Überstands.
  12. Füllen Sie den Schlauch mit kalten EtOH, mischen Sie die Lösung mit einem Vortexer für 1 min, und wiederholen Sie die Schritt 2.10-2.11.
  13. 25 mL steriles deionisiertes Wasser hinzugeben, mischen Sie die Lösung mit einem Vortexer für 1 min, beschallen (> 20 kHz) für 1 h und über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
  14. Legen Sie die Lösung in einer Gefriertruhe-80 ° C für 15 Minuten oder bis gefroren oder Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
    Achtung: Bei der Verwendung von flüssigen Stickstoffs verwenden Sie Schutzhandschuhe, einen Gesichtsschutz und eine Schürze.
  15. Frieren Sie trocken das Rohr (unter 0,1 mBar und-30 ° C) für 24-48 h bis eine Schnee-wie Pulver entsteht ein.
  16. An dieser Stelle testen Sie die Probe für die Reinheit über 1H NMR, wo die Menge des Methacrylat Protonen (Peaks bei 6,1 und 5,6 ppm), im Vergleich zu Methyl-Protonen (1,9 ppm), auf das Rückgrat HA bestätigt werden kann. Eine Mindestquote von 95 % Methacrylat, Methyl-Protonen ist akzeptabel. 69

(3) gel-Bildung und 3D Kapselung65

  1. Deckglas und Schimmel-Vorbereitung
    1. Machen Sie eine 50 mL destilliertem Wasserlösung 2 % 3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylat in einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL.
    2. Platz 18 mm Glasdeckgläser in Lösung und Rock für 1 h bei Raumtemperatur. Bis zu 50 Deckgläsern können auf einmal hinzugefügt werden.
    3. Spülen Sie Deckgläsern durch seriell eintauchen jeweils in 3 Bechergläser 100 mL entionisiertem Wasser.
    4. Trocknen Sie die Deckgläsern in einem Vakuum bei 40 ° C über Nacht mit einem Exsikkator und einem Backofen.
    5. Schnell Tauchen einzelne Deckgläsern in 70 % EtOH mit der Pinzette.
    6. Ohne Trocknung, fallen Sie jedem Deckglas in einen Brunnen von einem 12-well-Platte.
    7. Waschen Sie und aspirieren Sie jedes gut mit sterilem entionisiertem Wasser (1 mL pro Well).
    8. Fügen Sie 1 mL steril 2 µg /mL Poly-L-Lysin (PLL) in jede Vertiefung und inkubieren > 2 h.
    9. Aspirieren Sie PLL-Lösung und lassen Sie die Deckgläsern an der Luft trocknen.
    10. Polydimethyl Siloxan (PDMS) Formen (siehe Abbildung 1) in 70 % EtOH und Platz eins auf der Mitte der einzelnen Deckglas Tauchen und an der Luft trocknen und eine Abdichtung zwischen Schimmel und Glas zu schaffen.
      1. Bereiten Sie PDMS Formen durch Gießen PDMS Premix Reagenzien im Verhältnis 10:1 in einem flachen Polystyrol Teller vor. Die Menge des PDMS vorbereitet wird ausgewählt, um ein Blatt ca. 1 mm Dicke ergeben. In Form Vertiefungen in der PDMS, schneiden Sie die Blätter mit einem Kreis-Schlag mit einem Innendurchmesser von 10.
  2. Handy-Vorbereitung
    Hinweis: Alle Schritte in dem Protokoll werden mit steriler Technik in ein Kabinett Biosafety durchgeführt. PH 7.4 für alle Schritte wird Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) angepasst.
    1. 24 h vor der Zelle Kapselung in HAMA, aktualisieren Sie das Medium für die 2 Woche Primärkulturen (aus Schritt 1.15) in der 12-well-Platten. Fügen Sie 1 mL DMEM/F12 (10 % FBS und 1 % PS) mittlere pro Bohrloch.
    2. Für jede 12-Well-Platte von Zellen vorbereiten, 12,5 mL verdünnten Trypsin (0,25 % Trypsin-EDTA verdünnt 30 % mit DMEM/F12 Medien) und 25 mL DMEM/F12 (10 % FBS und 1 % PS) und bei 37 ° C in einem Wasserbad warm.
    3. Sammle konditionierten Medium von Platten mit einer serologischen 10 mL-Pipette (> 0,5 mL pro Well) gründlich restliche Flüssigkeit abzusaugen und ersetzen mit 1 mL pro Bohrloch von verdünnten Trypsin (0.075 % Trypsin-EDTA) für 20-30 min im Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) bis konfluierende Zellschicht löst sich von der Platte.
    4. Erholen Sie abgehängte Zellmaterial mit einer 1-mL-Pipette (erscheint als ein einziges schwimmendes Stück) zu und sammeln Sie in einem konischen Zentrifugenröhrchen 15 mL. Verdünnen mit gleichwertigem Umfang DMEM/F12 (10 % FBS und 1 % PS) und Zentrifuge bei 200 X g für 2 min bei Raumtemperatur, den Überstand verwerfen.
    5. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL DMEM/F12 warm (10 % FBS und 1 % PS) genannte Zellen 5 Mal mit einer 10 mL-Pipette, und 200 X g für 2 min zentrifugieren.
    6. Den Überstand abgießen, erneut aussetzen der Zellen in 5 mL DMEM/F12 zu wärmen, und übertragen Sie die Zellen auf einer konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL.
    7. Mit einer 10 mL Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel, genannte Zelle Lösung 3 Mal, und Filtern Sie die Aussetzung durch ein Sieb 40 µm Zelle in eine neue konische Zentrifugenröhrchen.
    8. Sammle 10 µL Zellsuspension, Verdünnung 1: 100 in warmen DMEM/F12 und Anzahl Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler
    9. Brüten Sie in einem 37 ° C Wasserbad bis Kapselung Schritt.
  3. Zelle Kapselung
    Hinweis: Alle Schritte in dem Protokoll werden mit steriler Technik in ein Kabinett Biosafety durchgeführt.
    1. Für jede 12-Well-Platte von 3D warm Hydrogele 12,5 mL DMEM/F12 und 12,5 mL der konditionierten DMEM/F12 Medien während Zelle Vorbereitung gesammelt wurden.
    2. Wiegen Sie die Menge der methacrylated Hyaluronsäure (HAMA) erforderlich für eine Endkonzentration von 0,5 % wt/Vol. Auflösen dieser HAMA in sterilen gefilterte PBS in einer Konzentration von (2 % wt/Vol); eine Konzentration 4 Mal höher als die Endkonzentration wird genutzt, um die Zugabe von Zellen und anderen Reagenzien unterzubringen. Ein 12-well-Platte der Hydrogele erfordert ~ 350 µL PBS mit 7 mg HAMA.
    3. Beschallen (> 20 kHz) Lösungen bis HAMA für 60 min vollständig aufgelöst ist.
    4. 10 % Individuallösungen Triethanolamin (TEA) und 1-Vinyl-2-Pyrrolidinone (NVP) und einer 1 mM Lösung von Eosin Y (EY) in 1 mL Aliquots von sterilen PBS pH 7.4 vorbereiten.
    5. Für eine 12 gut Platte, machen Sie eine endgültige 1,4 mL Mischung von 1 x 107 Zellen, 0,5 % wt/Vol HAMA (350 µL 2 % wt/Vol), 0,1 % Tee (14 µL 10 %), 0,1 % NVP (14 µL 10 %), und 0,01 mM EY (14 µL 1 mm) , und 20 % Basallamina Mischung (280 µL des Bestandes). Das restliche Volumen ist PBS.
    6. Vorsichtig mischen Sie die Lösung und pipette 100 µL in jeder PDMS-Form mit einer 1 mL-Spitze.
    7. Setzen Sie Proben für ein high-Intensity-grüne LED-Licht (~ 520 nm, 60 mW in einer geschlossenen 20 x 20 cm x 20 cm-Kiste) für 5 min bei Raumtemperatur.
    8. Ein 12-well-Platte 1 mL pro Bohrloch warm konditionierten DMEM/F12 hinzufügen.
    9. Jedes Deckglas zwischen Daumen und Zeigefinger fassen, langsam abziehen der PDMS-Form mit gebogenen Pinzette vorsichtig nicht zu verdrängen das Gel, und legen Sie sie in einen Brunnen mit konditionierten Medium.
    10. Fügen Sie eine zusätzliche 1 mL DMEM/F12 in jede Vertiefung zu wärmen.
    11. 2 Wochen, erfrischenden Zelle Medien jede Woche bei Pipettieren 1 mL der Medien aus jedem Brunnen und ersetzt mit 1 mL DMEM/F12 inkubieren Sie Platten bei 37 ° C mit 5 % CO2 .

(4) Mikroskopie

  1. Immunocytochemistry
    Hinweis: Ein umgekehrtes confocal Mikroskop wurde verwendet, um diese Beispiele Bild und ImageJ diente, zu verarbeiten und Anzeigen der Bilder. Mikroglia, Astrozyten, Oligodendrozyten und Kerne, werden nach 3 Wochen in der HAMA-Kultur benannt.
    1. 10 % PBS-gepufferte Formalin (pH 7,0) in einem Bad von 37 ° C vorheizen.
      Achtung: Formalin außerhalb einer Dampfhaube kann zwar verwendet werden, dieses Material ist reaktiv mit Gewebe und sollte immer mit Sorgfalt und Handschuhe zu behandeln. Es sollte getrennt entsorgen.
    2. Aspirieren Sie vorsichtig Medien aus den Platten und Pipette 1 mL 10 % Formalin in jede Vertiefung.
    3. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in 5 % CO2 für 20 min.
    4. Aspirieren Sie Flüssigkeit aus jeder Platte, pipette 2 mL PBS (pH 7,4) in jede Vertiefung und 15 min inkubieren.
    5. Wiederholen Sie 4.1.4 Schritt zweimal.
    6. Aspirieren Flüssigkeit von den Platten, fügen Sie 1 mL pro Bohrloch von PBS mit 10 % normales Pferd Serum (NHS) und 0,5 % Triton x-100 und schütteln bei minimaler Geschwindigkeit) für 1 h.
    7. Wiederholen Sie Schritt 4.1.4 dreimal.
    8. Flüssigkeit abzusaugen und 1 mL pro Bohrloch der folgenden Mischung mit PBS-Puffer: Kaninchen ionisiertes Kalzium-bindende Adapter Molekül (Iba1) 1:1 000, Huhn glial fibrillary Protein (GFAP) 1:5 000, Maus 2', 3'-cyclic-Nucelotide 3'-Phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1 % NHS , und 0,1 % Zelle perforierende Tensid. Inkubation bei 4 ° C über Nacht rocken die Platte so schonend wie möglich.
    9. Wiederholen Sie Schritt 4.1.4 dreimal mit 1 h Inkubationen dazwischen.
    10. Flüssigkeit abzusaugen und 1 mL pro Bohrloch der folgenden Mischung mit PBS-Puffer: 647 nm aufgeregt Esel Anti-Kaninchen-Antikörper 1: 200, 546 nm aufgeregt Ziege Anti-Huhn Antikörper 1: 200, 488 nm aufgeregt Esel Anti-Maus-Antikörper 1: 200, 1 % NHS, 1:1,000 blau nuklearen Fleck. Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h, sanft schaukelnden der Plattenrandes.
    11. Wiederholen Sie Schritt 4 dreimal mit 1 h Inkubationen dazwischen.
    12. Um die Hydrogele zu bewahren, Aspirieren Puffer, und tauche sie in 0,5 mL Zelle Eindeckmedium für 1 min. Pipette heraus das Eindeckmittel und legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf das Gel, eine Schicht zwischen dem Glas zu schaffen. Fügen Sie eine kleine Menge Eindeckmedium aufgedeckt neben den Deckgläsern, zu verhindern, Trocknung von Hydrogel.
      Hinweis: Für die Problembehandlung, können Gele bei Schritt 4.1.11 abgebildet werden. ordnungsgemäße Kennzeichnung vor der Weiterverarbeitung zu sehen.
  2. Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
    Hinweis: Um das Hydrogel zu visualisieren, wurde ein Rasterelektronenmikroskop verwendet, um diese Beispiele Bild.
    1. Heizen Sie Fixativ Mischungaus 2,5 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd in PBS (0,1 M) im Wasserbad 37 ° C vor.
      Achtung: Diese Reagenzien sind hochreaktiv mit Gewebe und sollte mit Sorgfalt und Handschuhen behandelt werden. Sie sollten so viel wie möglich in einer Dampfhaube behandelt und gesondert entsorgt werden.
    2. Aspirieren Sie Medium von Kultur Zellplatten und 1 mL vorgewärmten Fixativ Mischung.
    3. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in 5 % CO2 für 20 min.
    4. Legen Sie die Platten über Nacht bei 4 ° C (Kühlschrank/Kühler).
    5. Aspirieren Sie Fixativ Lösung aus den Vertiefungen und 1 mL PBS.
    6. Aspirieren Sie Flüssigkeit aus jeder Platte, geben Sie 2 mL PBS in jede Vertiefung hinzu und 15 min inkubieren.
    7. Wiederholen Sie Schritt 4.2.6 zwei weitere Male.
    8. Aspirieren der PBS und 1 mL 1 % Osmium Tetraoxide gepuffert mit PBS-Puffer in jede Vertiefung.
      Hinweis: Bis Proben getrocknet sind, werden in diesem Schritt und alle weiteren Schritte in einem Abzug durchgeführt.
    9. Lassen Sie Fixierung auf auftreten, für 30 min. Osmium Dampf aus der Flüssigkeit zu anderen Proben in der gleichen Platte beheben; Daher Proben entsprechend partitionieren vor diesem Schritt.
      Achtung: Osmium Tetraoxide ist hoch reaktiv mit Gewebe und volatil. Es ist gefährlich und sollte in der Dunstabzugshaube mit Handschuhen behandelt werden. Es und eine sofortige gewaschen sollten separat entsorgt.
    10. Wiederholen Sie Schritt 4.2.6 dreimal.
    11. Abzusaugen Sie die Flüssigkeit und fügen Sie die austrocknenden Mischungen in der Liste in der Reihenfolge hinzu und inkubieren Sie (Raumtemperatur) für die angegebene Zeit. Zunächst nach Zugabe von Ethanol (EtOH), dann Hexamethyldisilazane (HMDS) gefolgt. Siehe Tabelle 2 für jedes Inkrement.
      Hinweis: Wenn Sie HMDS hinzufügen, die Deckgläsern können stark haften für die Kunststoff- und sehr schwer zu entfernen. Dies kann verhindert werden, indem man eine kleine Kunststoff-Plattform unter das Glas rutschen nach der ersten Anwendung des HMD. Nach der zweiten EtOH Inkubation kann die Probe herausgenommen und in flüssigem Stickstoff für einige Sekunden zum Bruch der Probe Einfrieren abgeschreckt.
    12. Sorgfältig entfernen Sie die getrockneten Proben und montieren Sie Proben auf Rasterelektronenmikroskop Stubs mit leitfähigen Doppelklebeband.
    13. Sputter beschichten die Proben mit einer minimalen Menge an Gold. Legen Sie die Proben in einer Halterung und betreiben Sie die Maschine für 2 min bei 15 mA.

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Ergebnisse

Um das Nervengewebe Wirtsantwort und glial Narbe in einen hohen Durchsatz zu modellieren, erfordert in-vitro- System leski 3D Zelle mit einem Matrixmaterial, die biokompatibel, fallen nicht an einer zytotoxischen Ereignis während in Situ Bildung und kann geändert werden mit bioaktiven Komponenten um wohlwollende Reaktion führen. Wir haben zu diesem Zweck schuf ein 3D Zelle-Gerüst-System basierend auf Hyaluronsäure und gekapselt eine primäre gemischte Gliazelle Bevölkerun...

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Diskussion

Für das Ziel ein 3D Kultursystem zu Gliazellen Bioreactivity Modell und der Glia Vernarbung zu erzeugen haben wir ein System entwickelt, die primäre kultivierten Mikroglia, Astrozyten und Oligodendrozyten unterstützen können und robuste Charakterisierung der Zelle ermöglicht Morphologie und Zell-Zell-Interaktionen. Aus den Aufnahmen gezeigt war die Morphologie der jeden Zelltyp deutlich anders mit 2D, 3D-HAMA und 3D HAMA basalen Lamina Mischung Plattformen. Im 2D System Morphologie wurde entlang der Ebene der Oberfläche ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren sind dankbar für finanzielle Unterstützung von NSERC, CFI AIHS, Alberta Health Services und der Davey-Stiftung für Hirnforschung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1. Materialien für die HAMA-Synthese und Photopolymerisation
Hyaluronsäure (HA)Sigma-Aldrich53747-10GStreptococcus equi, MW: 1,5 - 1,8 x 10^6
Methacrylanhydrid (MA)Sigma-Aldrich275585-100ML
Natriumhydroxid (NaOH)Sigma-Aldrich221465-25G
Ethanol (EtOH)Handelsalkohole Inc.Wasserfreies
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4) TablettenFisher Scientific18912014
Triethanolamin (TEA)Sigma-Aldrich90279-100ML
1-Vinyl-2pyrrolidinon (NVP)Sigma-AldrichV3409-5G
EosinY (EY)Sigma-AldrichE6003-25G
Polydimethylsiloxan (PDMS) Sylgard 184 Silikon Elastomer KitDow Corning
3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylatSigma-Aldrich440159-100ML
Becher (100 mL)Corning1000-100
Becher (500 mL)Corning1000-600
pH Papier (Labstick)Sigma-Aldrich9580
Name< strong>CompanyKatalognummerComments
2. Materialien für die Isolierung von Gliazellen und die Zellkultur
P1-2 Sprague Dawley RattenwelpenCharles RiverCD Sprague Dawley Rattenstamm Code 001
Dissektorschere - schlanke Klingen (klein)Fine Science Tools14081-09
Chirurgische Schere - Toughcut (groß)Fine Science Tools14130-17
Feine Pinzette (Dumont #5)Fine Science Tools11521-10
Gebogene feine Pinzette (Dumont #7)Fine Science Tools11271-30
Hank's balanced salt solution (HBSS)Gibco14170-112
Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium und Ham's Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Penicillin-Streptomycin (PS)Gibco15140-122
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco12483-020
0,25 % Trypsin-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Gibco25200-072
Poly-L-Lysin (PLL)Sigma-AldrichP-6282
konisches Zentrifugenröhrchen mit 50 mLFisher Scientific05-539-13
konisches Zentrifugenröhrchen mit 15 mLFisher Scientific05-539-5
12-Well-Platten mit Gewebekulturen behandelt (Cellstar)Greiner Bio-One665 108
10 mL serologische PipetteFisher Scientific13-676-10F
25 mL serologische PipetteFisher Scientific12-676-10K
Petrischale (60 mm X 15 mm)Fisher ScientificFB0875713A
Petrischale ( 100 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712
Mikroskop Deckglas (18 mm)Fisher Scientific12-545-100 18CIR
NameUnternehmenKatalognummerComments
3. Materialien für die Mikroskopie (Konfokal- und Rasterelektronenmikroskopie)
Maus monoklonal anti-CNPaseabcamab6319
Kaninchen anti-Iba1Wako Laborchemikalien019-17741
Huhn anti-GFAPabcam ab4674
Hoechst 33342Fisher Scientific62249
Fluormount-GFisher Scientific00-4958-02
FormalinSigma AldrichHT501128-4Lgepuffert (10%)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
PferdeserumGibco16050-122
ParaformaldehydElecton Microscopy Sciences157-8gepuffert (8%)
GuteraldehydElecton Microscopy Sciences16019Gepuffert (8%)
OsmiumtetraoxidElecton Microscopy Sciences19152Gepuffert (2%)
Hexamethyldilazan (HMDS)Electon Microscopy Sciences16700
Ethanol (EtOH)Electon Microscopy Sciences15055
Wasserfreier Objektträger für das Mikroskop (25 x 75 x 1 mm)VWR International48311-703

Referenzen

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