Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Summary

Hier diskutieren wir eine Methode-Protokoll ermöglicht eine einfache Analyse der Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem als eine schnelle Auslesung in Einstellungen des langfristigen vaskuläre Krankheiten Neoangiogenese und strukturelle Veränderungen verbunden.

Abstract

Die diabetische Retinopathie ist die häufigste Ursache für Erblindung bei Erwachsenen mittleren Alters. Die steigende Prävalenz des Diabetes weltweit machen die Verhinderung von diabetischen mikrovaskulärer Komplikationen eines der wichtigsten Forschungsfelder der nächsten Jahrzehnte. Spezielle, zielgerichtete Therapie und neuartige Medikamente werden benötigt, um die zunehmende Zahl von Patienten mit einem Risiko von Verlust der Sehkraft zu verwalten. Der Zebrabärbling ist ein etabliertes Tiermodell für Entwicklungsforschung Fragen mit zunehmender Bedeutung für die Modellierung von Prozessen der metabolischen multifaktorielle Erkrankung. Die Vorteile der Gattung ermöglichen optimale Visualisierung und Hochdurchsatz-Drogen-screening-Ansätze, kombiniert mit der starken Fähigkeit, knock out Gene von Interesse. Hier beschreiben wir ein Protokoll ermöglicht einfache Analyse der Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem als eine schnelle Auslesung in den Einstellungen der langfristigen vaskuläre Erkrankungen Neoangiogenese oder Schiff Schäden verbunden. Dies wird durch Dissektion der Zebrafisch Netzhaut und ganz-Montage des Gewebes erreicht. Visualisierung der exponierten Schiffe wird dann durch konfokale Mikroskopie des grünen EGFP Reporters in den Erwachsenen retinalen Gefäßsystem ausgedrückt erreicht. Korrekte Handhabung des Gewebes führt zu besseren Ergebnissen und weniger interne Schiff Bruch um die Visualisierung der unveränderten vaskuläre Struktur zu gewährleisten. Die Methode kann im Zebrafisch-Modelle der Netzhaut Vaskulopathie verbunden mit Veränderungen in der Schiff-Architektur sowie die Neoangiogenese genutzt werden.

Introduction

Diabetes Mellitus ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch Hyperglykämie infolge gestörten Insulinsekretion oder unzureichende Gewebe Reaktion auf sekretierten Insulin definiert. Die WHO schätzt, dass 422 Millionen Erwachsene mit Diabetes Mellitus in 2014¹ lebten und die Prävalenz von Diabetes weltweit um ca. 8-10 % der Bevölkerung bis zum Jahr 2035^{2 voraussichtlich}, Diabetes und ist einer der wichtigsten Forschungsgebiete in der nächsten Jahrzehnten. Leben mit chronischen hohen Blutzucker führt zu langfristigen mikrovaskulärer Komplikationen, einschließlich diabetischer Retinopathie, Nephropathie und Polyneuropathie. Das Management und die Vorbeugung dieser Komplikationen sind schwer; in der Tat, Diabetes ist die häufigste Ursache von terminaler Niereninsuffizienz (ESRD), die zur Dialyse²führt, immer und Diabetes ist die häufigste Ursache für Erblindung bei Erwachsenen mittleren Alters³.

Die ersten Ursachen für mikrovaskuläre Schäden im diabetischen Auge sind chronische Hyperglykämie sowie Stoffwechselveränderungen und bestimmte Risikofaktoren (z.B.Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörungen), führt zu vaskulären endothelialen Dysfunktion, Pericyte Dropout, und Kapillare Regression, die azellulären vaskulären Ärmel führt. Die daraus resultierende retinale Ischämie ist die Ursache der Neovaskularisation und erhöhten vaskulären Permeabilität, die Förderung der Entwicklung der proliferative diabetische Retinopathie (PDR)⁴. Diabetischer Retinopathie war in der Regel bei 37 % der Diabetes-Patienten entdeckt, während Anblick-bedrohlichen diabetischer Retinopathie bei 12 % der abgeschirmten weißen europäischen Kohorte in der UKADS Studie⁵festgestellt wurde. Die Behandlung kann nur verhindern, dass weitere Komplikationen und ist nicht in der Lage, die bereits verursachte Schäden vollständig wiederherstellen. Panretinale Photokoagulation, neben der glykämischen Kontrolle, ist die Standardtherapie für proliferative diabetische Retinopathie (PDR) wirkt sich auf das benachbarte gesunde Gewebe sowie Anti-VEGF Interventionen zeigen vielversprechende Ergebnisse als Alternative zu Laser Behandlung^6,7, aber letztlich, spezielle, zielgerichtete Therapie und neue Medikamente sind erforderlich, um die wachsende Zahl von Patienten mit einem Risiko von Verlust der Sehkraft zu verwalten.

Die etablierten Tierforschung Modelle der diabetischen Retinopathie teilen nicht jeden Aspekt der menschlichen Pathophysiologie. Korrekte Verwendung an die spezifischen Anforderungen der wissenschaftlichen Fragestellung ist eines der wesentlichsten Teile des experimentellen Aufbaus. Der Zebrafischembryo (Danio Rerio) ist bereits weit verbreitet in Entwicklungsforschung und bietet einen optimale praktische Hintergrund zu Niederschlag oder Knockout spezifischer Gene über Morpholinos oder der CRISPR/Cas9-Technik-⁸. Diese Methoden können problemlos genutzt werden, im Zebrafisch, Gene, die durch groß angelegte genomweiten Assoziationsstudien (GWAS), Erzeugung von Einblicke in bestimmte Mechanismen der Progression der Erkrankung und Anfälligkeit⁹identifiziert wurden, zu untersuchen. Generationsübergreifende kurz, große Mengen an Nachkommen, einfach und kostengünstige Handhabung und wachsende Assay Unterstützung haben die Relevanz des Modells Zebrafisch, zumal ihr große Potenzial für die Modellierung von Stoffwechselerkrankung erhöht. Erhaltung der biologischen Mechanismen im Zebrafisch wurde als Grundlage für die pharmakologische Therapie Entwicklung gezeigt. Beispielsweise haben die antidiabetischen Medikament Metformin und Cholesterin-senkende Simvastatin nachweislich "Krankheiten" in den Modellen der cAMP/Dexamethason-induzierten hohen PEPCK Ausdruck und cholesterinreiche Diät-induzierten Hypercholesterinämie^{10 , 11 , 12}. diese fortschreitende Einsicht in übergreifende konservierte metabolische Mechanismen wird weiter unterstützt durch die wachsende Zahl von Zebrafisch-Diabetes-Modelle durch Experimente wie z. B.: abwechselnd Inkubation in Glukose-Lösungen, Streptozotocin-induzierte Ablation von Beta-Zellen, Nitroreductase-vermittelten Beta-Zellen Ablation mit Prodrug Metronidazol, Monogene Diabetes vermittelt über pdx1 gen-Knockdown oder Ko, sowie Modelle der erhöhte Insulin-Resistenz in der Skelettmuskulatur ¹². bereits etabliert diese Protokolle, die oben genannten Besonderheiten der Gattung, und die Fähigkeit, effizient zu manipulieren, das Genom in einer großen Anzahl von Proben alle zeigen die Vorteile der Zebrafisch für die Untersuchung der Mechanismen fahren komplexe Erkrankung Prozesse sowie die Fähigkeit zum Bildschirm für pharmakologische Interventionen.

Ein allgemeines Verständnis der grundlegenden Zebrafisch Auge Anatomie (Abbildung 1) ist notwendig für die Sezierer, um Zebrafisch als Modell für die Netzhaut Angiopathie nutzen. Der Zebrafisch-Auge hat sechs extraokularen Muskeln, vier Rectus und zwei schrägen Muskeln, die einfügen auf der Außenseite der Kugel auf der Sklera¹³. Die Hornhaut ist das transparente Gewebe für das Objektiv und geht direkt in die Lederhaut, bildet die äußere Hülle des Auges. Die Lederhaut ist undurchsichtig, hat eine teilweise Licht reflektierende Oberfläche und ist stark pigmentiert. Das Objektiv selbst ist mehr als das menschliche Gegenstück kugelförmige. Die Netzhaut besteht aus drei nukleare Schichten von neuronalen Zellen während der Sauerstoff anbietende retinale Gefäßsystem eng verbunden mit der inneren Ganglion Zellschicht ist aber keinen subretinalen Netzwerk bildet. Aderhautgefäße, im Gegensatz dazu liegen zwischen Lederhaut und Netzhaut und die Netzhaut pigmentiert Pigmentepithels (RPE) zugeordnet sind. Diese Kapillarnetzes liefert Sauerstoff auf die äußeren Teile der Netzhaut¹⁴.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Auges Erwachsenen Zebrafisch. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Einfache Visualisierung der retinalen Gefäße kann durch Nutzung der transgenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Linie¹⁵erreicht werden. Das grüne fluoreszierende Protein unter Kontrolle der Fli-Promotor in Endothelzellen des Gefäßsystems ausgedrückt ist die Grundlage für die Visualisierung über einen Laser-scanning-Mikroskop in den späteren Schritten. Dies wird durch Dissektion der Zebrafisch Netzhaut und ganz-Montage des Gewebes erreicht. Diese transgenen Modell bietet eine schnelle vaskuläre Auslesen ohne jede Anwendung des intravaskulären Kennzeichnung oder ganze-Mount Immunohistochemistry. Diabetischen Retinopathie im Zebrafisch zu analysieren, sollte eine Schritt für Schritt und standardisierte Vorbereitung Routine durch jeden Sezierer verwendet werden.Das folgende Protokoll der Vorbereitung bietet anderer Forschungsgruppen die Möglichkeit, ganz einfach bewerten Gefäßveränderungen in den freiliegenden Gefäßen des Auges Erwachsenen Zebrafisch und Hilfestellung um eine optimierte Dissektion-Routine für die Netzhaut Zebrafisch zu etablieren.

Protocol

Alle Verfahren, einschließlich der Schritte im Zusammenhang mit tierischen Themen, von der Ethikkommission der Tiere (Regierungspräsidium Karlsruhe) genehmigt worden und die Tierpflege Richtlinien der Universität Heidelberg.

1. Vorbereitung des Fixiermittels (4 % PFA/PBS)

1. Bereiten Sie jeden Tag Fixativ frisch zu, um optimale Konservierung der histologischen Gewebe Integrität zu gewährleisten.
2. Lösen Sie 0,2 g Natriumhydroxid (NaOH auf) unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur in 90 mL doppelt destilliertes Wasser (DdH₂O).
3. Fügen Sie 4 g Paraformaldehyd (PFA hinzu) und rühren Sie, bis die Lösung ganz klar für mindestens 5-10 min Depolymerisation von Makromolekülen zu versichern soll.
   Achtung: PFA ist giftig, pfleglich zu behandeln.
4. 0,84 g Natrium Dihydrogen Phosphat (NaH₂PO₄) in die Lösung auflösen und pH-Wert auf 7,2 durch Messung zu kontrollieren.
5. Stellen Sie Lautstärke auf 100 mL mit DdH₂O und Filtern Sie die Lösung durch Filterpapier Klasse 3.
6. Speichern von 4 % PFA/PBS auf Eis.

2. Vorbereitung der Euthanasie-Lösung

Hinweis: Die folgenden Schritte erfolgten mit ABTL Zebrafisch Wildtyp Stamm in einem allgemeinen Alter von 6 bis 8 Mon.

1. Verwenden Sie Ethyl-3-Aminobenzoate Methan Sulfonate, auch genannt "Tricaine" oder MS-222, in einer Konzentration von 0,31 mg/mL für Zebrafisch Euthanasie¹⁶. 1 X Ei Wassereinsatz Zebrafisch-Embryonen, als Lösungsmittel für die Euthanasie-Lösung zu nutzen. In der Regel steuern Sie die richtige Narkose Tiefe, vor der Arbeit mit sediert Fisch durch den Nachweis der Verlust des Gleichgewichts und berühren Sie Reaktion Verlust.
   1. Um 1.000 mL 10 x Ei Wasser zu erreichen, fügen Sie diese Salze 1.000 mL doppelt destilliertes Wasser (DdH₂O) unter ständigem Rühren in der folgenden Reihenfolge: 10 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,4 g CaCl_{2 *}6 H₂O, 1,32 g MgSO_{4 *}6 H₂O.

(3) Fixierung der Zebrafisch-Gewebe

1. Überweisen Sie 6 mL 4 % PFA/PBS-Lösung pro Probe in die Vertiefungen des sechs-Well Platten vorab.
2. Einschläfern der Erwachsenen Zebrabärbling (zuvor gepflegt auf einem standard Licht-Tage-Zyklus, z.B.12 h: 12 h) 2 h nach Lichter am Morgen, einschalten indem man sie in die Tricaine Lösung und warten Sie, bis sie Euthanasie erreicht haben. Im Anschluss an die Beendigung der Kiemendeckel Bewegung kann das bis zu 10 Minuten dauern.
3. Den Fisch aus der Tricaine-Euthanasie-Lösung nehmen und legte sie auf frisches Papierhandtücher. Trocknen der Fische und ein Skalpell benutzen, um die Köpfe hinter dem Kiemendeckel zu schneiden (siehe Abb. 2A). Übertragen Sie die Köpfe direkt in die vorbereitet well-Platten, die das frisch zubereitete Fixiermittel enthalten.
4. Shop der well-Platten mit Fisch-Köpfe bei 4 ° C für mindestens 24 h das Fixiermittel versichern über Nacht dringt in die tieferen Schichten der Netzhaut.
   Hinweis: Zebrafisch Köpfe können für maximal 48 h in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C vor der Zubereitung ohne einen entsprechenden Verlust der Fluoreszenz Signalstärke gespeichert werden. Erhöhte Latenz führt zum Verlust von Gewebe Integrität und reduzierte Bildqualität und sollte daher vermieden werden.

4. Vorbereitung der Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

1. Füllen Sie einer Petrischale mit beheizten 2 % Agarose bis zu einem Drittel und warten Sie, bis der Agar fest ist. Decken Sie die Agarplatte mit 1 X PBS, erstellen Sie einen Arbeitsbereich, um die Augen zu sezieren.
   Hinweis: Beide Erhaltung der Vorbereitung Pinzette und niedrigem Druck auf das Gewebe beim sezieren, dadurch Verringerung der Wahrscheinlichkeit von Bauschäden. Alle weiteren Vorbereitungsschritte sollte in diesem Arbeitsbereich nutzen #5 geraden Zange mit feinen Spitzen unter dem sezierenden Mikroskop mit zusätzlicher Epi-Beleuchtung durchgeführt werden.
   1. Verwenden Sie beim sezieren Vergrößerung zwischen 4,0 x und 6.0 X, um Übersicht und Detail-orientierte Beurteilung des Gewebes ermöglichen.
2. Übertragen Sie die feste Probe in der Petrischale zu, und halten Sie den Kopf auf die Schnittfläche mit einer Pinzette, legen Sie ein anderes angeheftet zusammen-Pinzette unterhalb des Augapfels in die Augenhöhle. Langsam öffnen Sie die Pinzette unterhalb des Auges und greifen Sie den Sehnerv, dann sorgfältig reißen Sie und lösen Sie die Augen (Abb. 2 b).

Abbildung 2: Entfernen des Auges Erwachsenen Zebrafisch. Hornhaut Seitenansicht mit dem Auge noch in der Augenhöhle und intakter Sehnerv (A). Hornhaut Seitenansicht mit freistehenden Auge (B). Schematische Darstellung des Auges Zebrafisch bei diesem Schritt (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Entfernen Sie die vier Rectus und zwei schrägen extraokularen Muskeln, die Auge und die restliche extraokulären Gewebe der Augenhöhle das Auge herstellen noch verbunden sind (Vergleiche Abbildung 3 und Abbildung 4).
   1. Erreichen dies durch zurückhalten des Auges durch eine Pinzette halb geschlossen und die Struktur mit den anderen Pinzette greifen, sanft Abzocke es mit einer diametralen Bewegung. Da greifen den Augapfel direkt zum internen Schiff Bruch führt, ist diese Technik entsprechend schonend für das Gefäßsystem zu bewahren.

Abbildung 3: Erwachsene Zebrafisch Auge mit extraokularen Muskeln im Fokus. Seitenansicht mit Bindung eine extraokularen Muskeln an den linken äußeren Rand der okulären weltweit im Fokus (A). Sehnerv Seitenansicht mit extraokularen Muskeln symmetrisch flankieren den Sehnerv (B). Schematische Darstellung des Auges Zebrafisch bei diesem Schritt (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

4. Verwenden Sie eine Einwegnadel 27G (0,4 x 19 mm), um die Hornhaut (Abbildung 4, roter Pfeil) an den äußeren Bereich zu durchbohren. Durch diese Öffnung die Hornhaut mit beiden Pinzette halten und leicht aufreißen. Danach sorgfältig Bemühungen um einen zentrierten reißen Sie ungefähr die Größe des jeweiligen Schülers.

Abbildung 4: Erwachsene Zebrafisch Auge nach Entfernung aller extraokularen Muskeln. Seitenansicht mit ausgeglichenen Rand des Okulars globe sichtbar (A).Sehnerv Seitenansicht mit Sehnerv in der Mitte. Der lichtreflektierende Sklera deckt nicht das gesamte Gebiet um den Nerv (rote gestrichelte Linie) (B). Schematische Darstellung des Auges Zebrafisch bei diesem Schritt (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

5. Druck auf die Hornhaut Seite des okulären Globus (Bulbus Oculi) an der Außenkante der Hornhaut oberhalb der Iris. Dies schafft eine kleine Delle und schieben Sie das Objektiv auf die Höhe der Hornhaut Riss. Führen Sie die Pinzette unter dem Objektiv und herausnehmen Sie (Abb. 5A).

Abbildung 5: Erwachsene Zebrafisch Auge in den Prozess der Linse entfernen. Hornhaut Seitenansicht mit dem Objektiv durch die Hornhaut Träne (A)geschoben. Hornhaut Seitenansicht mit dem Objektiv neben der okulären Globus (B). Schematische Darstellung des Auges Zebrafisch bei diesem Schritt (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

6. Drehen Sie das Auge auf den Kopf des Sehnervs vor der Forscher. Beachten Sie, dass der Sklera und der Hornhaut miteinander verbunden sind und die faserige Tunika der Auge-Lampe bilden um die becherförmige Netzhaut zu schützen. (Abbildung 6).
   1. Diese Schale, bestehend aus Hornhaut und Lederhaut, nennt man auch "Corneosclera" und Ersatzteile aus der Gegend um den Sehnerv (Abbildung 4 b, rote gestrichelte Linie). Nadel bei dieser Einstellung einmal erstelle ich eine Öffnung zwischen der Lederhaut und der Netzhaut.

Abbildung 6: Corneosclera bestehend aus Lederhaut und Hornhaut, die aus dem restlichen intraokulare Gewebe getrennt ist. Hornhaut Seitenansicht zeigt die Fortsetzung der lichtdurchlässige Hornhaut in der pigmentierten Sklera (A). Seitenansicht im Mittelpunkt des skleralen Teil des Corneosclera (B). Schematische Darstellung des entfernten Corneosclera (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

7. Rippen Sie mit Hilfe dieser Access mit beiden Pinzette sorgfältig der Sklera axial in Streifen um die Öffnung um den Sehnerv zu erhöhen. Achten Sie darauf, die Corneosclera am Übergang zur Hornhaut Seite Umfang intakt zu halten (siehe Abbildung 6A).
8. Halten Sie die Lederhaut mit einer Pinzette und packte den Sehnerv mit der anderen und Anfahren, ganz der Corneosclera aus dem Auge zu entfernen und entsorgen (Abbildung 6). Versuchen Sie alle Verbindungen durchtrennen vor Trennung der Corneosclera und das restliche intraokulare Gewebe als Anhang zu anderen Strukturen einen kritischen Punkt werden; Dieser Schritt wird eine schalenförmige Struktur bestehend aus der Uvea und Netzhaut enthält die Netzhaut Gefäßsystem (Abbildung 7) bieten.
9. Erstellen Sie einen Bruch in der Aderhaut/RPE-Schicht, indem Sie eine 27G Nadel seitlich an die restlichen Tasse beim Kratzen der Außenfläche mit dem Rand der Nadelspitze halten. Verwenden Sie den Bruch als Access-Point, um auf der Aderhaut/RPE-Ebene in den Griff bekommen und reiß es mit beiden Pinzetten in Streifen, aber die Verbindung zu den Iris intakt zu halten.
   1. Anschließend führen Sie eine Pinzette unter der Iris und gehen um in einem Kreislauf von außen während der Erstellung Spannung durch ziehen auf der Ebene der aufgegebenen choroidale/RPE, Ablösung der kombinierten Struktur zu erreichen.
      Hinweis: Die Iris ist abzuklemmen um die Fluoreszenz bei der Visualisierung der Schiffe (Abbildung 8 b) nicht zu behindern. Greifen die Iris direkt um ihn zu entfernen kann zu umfangreichen Schiff Schaden, vor allem bei optischen Innenkreis (IOC), führen, da Iris noch mit dem umgebenden Gewebe verbunden ist. Die Aderhaut Schicht und die Netzhaut pigmentiert Pigmentepithels (RPE) getrennt werden können und oft behalten eine Verbindung mit der Iris, die für eine einfache sekundäre Entfernung ermöglicht.
   2. Wenn Teile der Iris nicht entfernt werden können, nutzen Sie eine natürliche Sollbruchstelle der Erwachsenen Zebrafisch Auge innerhalb der Photorezeptor-Schicht (PL), Exponate in ähnlicher Weise mit Schritt 4,9, um die Iris zu entfernen.
   3. Reiben Sie über die Außenseite der verbleibenden becherförmigen Netzhaut induzieren Abbrüche in der PL oben die Sollbruchstelle (Abbildung 11, schwarzer Pfeil). Nutzen Sie den erstellten Zugang um zu den oberen Teil der Schicht zu entfernen, während die Verbindung zu den Iris intakt zu halten. Danach führen Sie die Pinzette unter der Iris und gehen um in einem Kreislauf, wie bereits erwähnt, um die kombinierte Struktur zu lösen.
      Hinweis: Man sollte Geduld auszuüben, wie der ganze Schritt 4,9 kann schwierig sein, aber diese Pflege wird ein besser vaskulären Ergebnis als unkompliziert greifen die Iris am Rand der Pupille oder zwingt eine Öffnung durch die Anbindung an die Aderhaut/RPE Zerstörung erreichen oder Photorezeptor Schicht ohne ihre jeweiligen Entfernung. Nach diesem Schritt wird so retinalen vaskulären Integrität bewahren, sondern die äußeren Schichten der Netzhaut beschädigen.

Abbildung 7: Erwachsene Zebrafisch Auge nach der Entfernung von der Corneosclera. Seitliche Ansicht zeigt die verbleibende intraokulare Gewebe mit intakten Iris und Sehnerv (A). Hornhaut Seitenansicht mit Iris im Fokus (B). Schematische Darstellung des Auges Zebrafisch bei diesem Schritt (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

10. Verwenden Sie eine Mikrodissektion-Feder-Schere mit einer Schneide gerade 2,5 mm, um den Sehnerv so nah wie möglich an der Netzhaut schneiden; Dies ermöglicht eine bessere Wohnung-Montage des Gewebes.

Abbildung 8: Erwachsene Zebrafisch Auge nach der Entfernung des RPE/Aderhaut und abgeschnittene Sehnerv. Sehnerv Seitenansicht zeigt die Netzhaut mit einer abgeschnittenen Sehnerv (A). Hornhaut Seitenansicht mit einem direkten Blick auf die innerste Schicht der Netzhaut (B). Schematische Darstellung des Auges Zebrafisch bei diesem Schritt (C).Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

5. Montage des retinalen Gefäßsystems

1. Waschen Sie sezierte Netzhaut zwei Mal für 5 Minuten in 1 X PBS. Um die Netzhaut nach Abschneiden des Sehnervs zu übertragen, nutzen Sie einen Lab-Spatel mit einem Mikro Löffel Ende zum direkten Bearbeiten des exponierten Gewebes zu vermeiden.
2. Geben Sie einen Tropfen des PBS auf einen Glasobjektträger und übertragen Sie die Netzhaut in das Tröpfchen. Eine Pinzette verwenden, um das Gewebe in Position zu halten, während des Schneidens der becherförmigen Struktur mit einem Skalpell eine flache vierblättrige oder fünfblättrigen Form abhängig von der Netzhaut Größe erstellen (siehe Abbildung 9).
3. Saugen Sie die übrig gebliebenen PBS mit einem feinen Stück Papier. Achten Sie darauf, nicht die Netzhaut zu berühren.
4. Bestreichen Sie die Wohnung montiert Netzhaut in Montage Medien und mit einem Deckgläschen. Achten Sie darauf, nicht zu Schaum, schaffen wie Luftblasen Visualisierung der Netzhautgefäße verfälschen können.
5. Minimieren Sie die Bewegung von dem Deckglas und verschließen Sie die Abdeckung mit klaren Nagellack.

(6) Visualisierung des retinalen Gefäßsystems

1. Halten Sie den Zeitabstand zwischen Vorbereitung und Visualisierung so kurz wie möglich, Bild-Detail-Verlust durch Fluoreszenz Signalverlust zu reduzieren. Speichern Sie die vorbereiteten retinalen Gefäßsystem Halterungen bei 4 ° C Signalverlust, reduzieren, wenn direkter Visualisierung erreicht werden kann, wie Verschlechterung der Bildqualität langsam sichtbar 48 h nach der Zubereitung wird.
2. Die Netzhaut Gefäßsystem Halterungen über Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren oder laser-Scan konfokalen Mikroskopie.
   Hinweis: Behälter Visualisierung durch Fluoreszenzmikroskopie wurde erreicht bei 2,5 X Vergrößerung mit einer Belichtungszeit von 2,0 s, Plus von 6,0 x und Gamma Einstellungen von 1,67. Für die konfokale Mikroskopie, wurde ein Ar-Laser (488 nm/20 mW) bei 20 % Leistung in Kombination mit einem TD 488/543/633 Erregung Filter, ein 20 x / 0,7 eingesetzt NA Multi-Immersion Ziel mit DdH₂O Immersion Media und Emission Filter-Einstellungen der 505-560 nm. Konfokale Bilder bestehen aus 4 x 4, 4 x 5 oder 5 x 5 einzigartige Bilder, die durch ein Kachel-Scan abhängig von der Netzhaut Größe kombiniert.

7. HE Abschnitte der Zebrafisch Netzhaut

Hinweis: HE Abschnitte der Zebrafisch Netzhaut, Vorbereitung des Gewebes in das Protokoll erst Schritt 4.5 beschrieben und danach fahren Sie direkt mit Schritt 7.1.

1. Waschen Sie die entkernte Augen (nach Schritt 4.5) zwei Mal für 5 Minuten in 1 X PBS. Danach das Gewebe in 70 % igem Ethanol (EtOH) übertragen. An dieser Stelle bereite Augen bei 4 ° C bis Paraffin einbetten speicherbar.
2. Waschen Sie das Gewebe der folgenden Weg, um es vor dem Paraffin einbetten entwässern: 2 x 15 min in 80 % Ethanol, 2 x 15 min in 90 % Ethanol, 3 x 15 min in 96 % Ethanol, 3 x 15 min in 99 % Ethanol, 2 x 15 min in acetone/99% Ethanol (1:2), 3 x 15 min in Aceton. Halten des Gewebes in Paraffin auf 62 ° C über Nacht.
3. Frischem Paraffin auf 62 ° C erhitzen Sie und gießen Sie sie in Formen einbetten. Übertragen Sie das Gewebe in die Formen direkt und in schnellem Tempo, Kontrolle korrekte Ausrichtung der Augen für den gewünschten Bereich. Danach gelten Sie eine Einbettung Kassette für die Form und den Deckel mit zusätzlichen beheizten Paraffin.
4. Entfernen Sie die einbettenden Formen, nachdem Paraffin-Blöcke abgekühlt sind. 10 µm Abschnitte geschnitten Sie der Paraffin-Blöcke auf ein Mikrotom und schweben sie auf 45 ° C Wasserbad auf der Wasseroberfläche lang genug, damit sie vollständig abwickeln.
5. Fangen Sie die Abschnitte auf einen Objektträger zu und abtropfen Sie vertikal, um überschüssiges Wasser zu entfernen, bevor die Trocknung über Nacht in einem Ofen bei 45 ° C.
6. Prozess in den Abschnitten mit den folgenden Zeitplan weiter zu deparaffinize und HE Fleck: 4 x 1 min in Xylol, 1 x 1 min in 99 % Ethanol, 1 x 1 min in 96 % Ethanol, 1 x 1 min in 80 % Ethanol, 1 x 1 min in 70 % Ethanol, 1 x 1 min in DdH₂O, 1 x 4 min in Mayers Hämatoxylin , 1 x 10 min DdH₂O, 1x2min in 0,5 % Eosin, 1 x 30 s DdH₂O, 1 x 30 s in 80 % Ethanol, 2 x 30 s in 96 % igem Ethanol, 3 x 1 min in 99 % Ethanol, und 1 x 1 min in Xylol.
7. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Xylol und bedecken Sie schnell das Gewebe mit Montage Medien. Vermeiden Sie, lassen Sie das Gewebe vollständig austrocknen, dann legen Sie ein Deckglas auf und versiegeln die gefärbte Gewebe.

Results

Hier zeigen wir zwei typische morphologische Beispiele für die Netzhaut Gefäßsystem im Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch: einmal visualisiert mit dem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 9A) und einmal mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (Abbildung 9). Die aufgedeckte retinale Struktur zeigt ein Muster sehr organisiert. Starke Autofluoreszenz ist in der Netzhaut Zebrafisch gesehen, wenn mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. So empfiehlt sich eine Visualisierung der nur vaskuläre Schicht über einem konfokalen Scan zu reduzieren Hintergrundfluoreszenz und Kontrast erhöhen. Für schnellere Bild Erwerb oder Situationen wo qualitative Daten ausreichen, ist das Fluoreszenzmikroskop eine attraktive Alternative.

Abbildung 9: repräsentative Bilder von Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem. Zwei typische morphologische der retinalen Gefäße sind Beispiele für: die zentrale optische Arterie breitet sich in 5-7 wichtigsten Schiffe, die dann in eine Abfolge von Arkaden verzweigen. Alle weiteren Schiffe entwässern in die umlaufende Vene (CV) Begrenzung den äußeren Teil jedes Blütenblatt. Visualisierung über Fluoreszenz-Mikroskopie bei 2,5 x Vergrößerung (A). Visualisierung der retinalen Gefäße durch konfokale Laser-scanning-Mikroskopie durch einen kombinierten 5 x 5 Einzelbild Fliese Scan (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die optische Arterie dringt die Netzhaut am Sehnerv Kopf und breitet sich in den meisten Proben in 5-7 wichtigsten Gefäße (Abb. 10A). Die wichtigsten Schiffe dann verzweigen in eine Abfolge von Arkaden und verbinden Sie mit optischen Innenkreis (IOC), auch genannt die umlaufende Vene (CV), rings um die Papille in der Peripherie der flach montierten Retina (siehe Abbildung 10). Das IOC ist das venöse Gefäß, das das arterielle Blut am inneren Rand des okulären Globus (Bulbus Oculi) entwässert. Der Zebrafisch retinalen Gefäßsystem zeigt auch hohe vaskuläre Tätigkeitsbereichen mit Verzweigung der Kapillaren und angiogenen sprießen (Abbildung 10). Dieser Kreislauf Aktivität befindet sich meist in Nähe des IOC. Es ist wichtig zu bemerken, dass das gleiche Auge sowohl Ebbe und vaskulären Aktivitäten in den verschiedenen Regionen der Netzhaut nachweisen kann (Vergleiche Abbildung 10 und Abbildung 10). Im Allgemeinen zeigt das retinale Gefäßsystem der Zebrafisch avaskulären geräumiger und weniger Kapillaren zwischen die Hauptäste im Vergleich zu beispielsweise die Netzhaut des Mäuse-¹⁷. Beide Augen jeder Probe sollte analysiert werden, weil das Gefäßsystem zwischen variieren und singulären Inspektion kann zu Verzerrungen führen.

Abbildung 10: Bereiche der Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem Visualisierung vergrößert. Die optische Arterie Verzweigung in die wichtigsten Schiffe (A). Retinalen Kapillaren in einem Gebiet mit geringer vaskuläre Aktivität verbinden mit optischen Innenkreis (IOC) am unteren Rand der Abbildung (B). Retinalen Kapillaren auf einer Fläche von vaskulären hochaktiver Anschluss an das IOC (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Eine hoch konserviert Architektur neuronale Schichten ist bereits im Zebrafisch von ca. 72 h post Düngung (hpf) ab¹⁸. Die Erwachsenen Zebrafisch Netzhaut zeigt die folgenden Schichten von innen nach außen (Abb. 11): Ganglion Zellschicht (GCL), inneren plexiformen Schicht (IPL), nukleare Innenschicht (INL), äußeren plexiformen Schicht (OPL), nukleare Außenschicht (ONL) Photorezeptor Schicht (PL), und des retinalen Pigmentepithels (RPE) pigmentiert. Die Schätzung der vaskulären Parameter von retinalen Gefäßsystem Visualisierung ist in Abbildung 12dargestellt. Das innere Netzhaut Gefäßsystem befindet sich auf der Ganglion Zellschicht (GCL) (Abbildung 13 b, white-Box) und die Aderhaut Kapillaren würde die Netzhaut pigmentiert Pigmentepithels (RPE) zugeordnet werden.

Abbildung 11: er Färbung des Auges Erwachsenen Zebrafisch. Cross-sectional Überblick über das ganze Auge nach Entfernung der Linse (A). Netzhaut Schichten von den Erwachsenen Zebrafisch Auge¹⁹ (B). Hinweis (schwarzer Pfeil) auf die natürliche Bruchstelle in der PL (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Modelle der Hypoxie-induzierten retinalen Neoangiogenese zeigen erhöhten Anzahlen von Verzweigungspunkten, angiogenen Sprossen, vaskuläre Gesamtfläche und verringerte interkapilläre Abstand im Zebrafisch-²⁰. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass der Zebrabärbling anfällig für diabetische mikrovaskulärer Komplikationen²¹, wie wichtige Erkenntnisse der später diabetischen Retinopathie Hypoxie-vermittelten Neoangiogenese umfassen, die stark an VEGF Ausdruck gebunden ist. Hyperglykämie-induzierten Veränderungen in der Zebrafisch Netzhaut führen zu erhöhte Dicke der Schiffe aber pflegen die insgesamt²²Musterung. Eintauchen in Glukose-Lösungen für 30 Tage abwechselnd verringert auch die Dicke der IPL und INL²³. Der direkte Einfluss von Glukose-Metaboliten im Zebrafisch als metabolische Befürworter der Vaskulopathie wurde auch bereits gezeigt. Weitere vaskuläre Hyperbranching wurde in das Gefäßsystem Stamm von Zebrafisch-Embryonen nach Inkubation mit Methylglyoxal²⁴beobachtet. Im Moment gibt es kein Tiermodell bietet die wichtigsten Kriterien der diabetischen Retinopathie. Frühe Veränderungen finden sich oft, aber das Fortschreiten, proliferative diabetische Retinopathie fehlt²⁵. Der Zebrabärbling fällt ebenfalls in diese Definition, wie wir nur Hypoxie-vermittelten Neoangiogenese oder Hyperglykämie-induzierte Veränderungen bis jetzt gesehen haben. Die aktuellen Erkenntnisse unterstützen die Idee, dass der Zebrabärbling anfällig für Hyperglykämie-vermittelten Gefäßveränderungen ist und als Tiermodell kann potenziell eine Progression, proliferative diabetische Retinopathie zeigen. Abhängig von der Stärke und Exposition gegenüber der Hyperglykämie-vermittelten Effekt Recht experimentelle Modell zu Ischämie in bestimmten Bereichen der Zebrafisch Netzhaut führen und Neoangiogenese als die wichtigsten Kriterien der proliferativen diabetischen Retinopathie fördern. Jedoch wie der Zebrabärbling ein vergleichsweise neuer Spieler auf dem Gebiet ist der Modellierung langfristiger mikrovaskulärer Pathologien, bevorstehenden Diabetes Modelle im Zebrafisch erhalten Sie weitere Informationen und ihre Bedeutung in Bezug auf andere Modelle und deren Pathologien zu klären. Beispielsweise könnte ein Kreuz tg(gata1a:DsRed) Zebrafisch mit rot-markierten Erythrozyten in die tg(fli:EGFP) Linie verwendet werden, um gleichzeitig potenzielle intraokulare Blutungen in Zukunft Zebrafisch-Modelle zeigen Mikroaneurysmen als Prädiktor für visualisieren Progression zu PDR.

Da die Netzhaut Gefäßsystem zu einer Folge von Arkaden fortschreitet, Bewertung der intervascular Abstand, Anzahl der Verzweigungspunkten und vaskuläre Gesamtfläche beziehen sich auf die Entfernung von der zentralen optischen Arterie. Um Verzerrungen in den untersuchten vaskulären Parametern zu vermeiden, ist ein Punkt der Orientierung erforderlich. Das IOC ist eine solche Struktur und ist von großer Bedeutung, da vaskulären Tätigkeitsbereiche in unmittelbarer räumlicher Nähe liegen. Für die einheitliche Bewertung sollte mehrere rechteckige Bildausschnitte mit einem einheitlichen Abstand gegenüber dem IOC der Netzhaut Scan aufgeteilt werden. Die gesamte Netzhaut sollte analysiert werden und Bilder numerisch symmetrisch verteilt. Die Zebrafisch Netzhaut zeigt Bereiche mit hohen und niedrigen Kapillardichte und eine ungleiche Verteilung von Bildausschnitten für zusätzliche Verzerrungen führen kann.

Abbildung 12: Beispiel-Präsentation der vaskulären Parameter als Auslesen der Netzhaut Gefäßsystem Visualisierung. Intervascular Abstandsmessung (roter Doppelpfeil) in der Nähe der inneren Optik Kreise (IOC) (A). Drei Verzweigungspunkten (rote Kreise) in der Nähe des IOC (B). Visualisierung der Zebrafisch retinalen Gefäßsystem mit einer erweiterten Fläche (rot markiert) zeigt eine sprießende Schiff (C). Schiffs Durchmesser gemessen über eine gewisse Distanz (weiße Doppelpfeil) von der central Artery (weißes Kreuz) (D). Schiff-Dichte ist der Prozentsatz der Netzhaut Fläche durch die Überlagerung von Schiffen (diagonale rote Linien) (E). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Um die intervascular Entfernung zu messen, muss man eine gewisse Distanz gegenüber dem IOC als Standard (Abbildung 12A, weiße Doppelpfeil) und Zeichnen einer gedachten horizontalen Linie (Abb. 12A, horizontale weiße Linie) parallel zu den IOC. Der Abstand zwischen den Schiffen in dieser Zeile addiert und arithmetisch gemittelt entspricht der intervascular Entfernung. Verzweigungspunkten zählen innerhalb jedes Bild, wann immer ein Schiff teilt und mehr als eine vaskuläre Lumen weiter unter dem Gesichtspunkt der Herkunft. Hierzu gehören auch horizontale Verbindungen zwischen Kapillaren. Es ist wichtig, bleiben Sie konsequent mit Analyse und entscheiden, welche Verzweigungspunkten zu zählen und halten diese Regeln in das ganze Experiment, nicht mehr benötigte Variante zu reduzieren. Vaskuläre sprießen, ist wie in Abbildung 12gezeigt ein weiterer Parameter, der in jedem Bild, Einfluss auf die Netzhaut Gefäßsystem zu bewerten gezählt werden kann. Angiogenen Sprossen folgen nicht die arkadenartige Nachfolge zwischen zentralen Arterie und IOC und Fokus in der Nähe der äußeren Teile der Netzhaut. Um bestimmte Schiffs Durchmesser zu beurteilen, Orientierungspunkt ist immer erforderlich, aus denen eine festgelegte Strecke markiert die Messung vor Ort. Die zentrale Arterie Herkunft innerhalb der Netzhaut enthält solche Anleitungen für den Hauptstamm Schiffe (Abbildung 12D, weißes Kreuz). Die Fläche von Schiffen (Abbildung 12E, diagonale rote Linien), als Prozentsatz der gesamten Netzhaut Gegend ist die vaskuläre Dichte und indirekt zum Bereich avaskulären korreliert.

Ein kompletter konfokale Scan einer Probe sollte mehrere detailreiche Bilder zur Visualisierung der kleinen Kapillaren Hypersprouting zulassen zusammensetzen. Zur Optimierung von Zeit und Ressourcen aufgewendet dieser Schritt sollte ein automatisches Körper Verfahren für jede Fliese mit einer allgemeinen Scan-Tiefe verwendet werden. Ungleichmäßige Montage der Netzhaut beträchtlich die Zeit damit verbracht, um das Gefäßsystem mit einem konfokalen Mikroskop zu scannen. In ein optimaler Ansatz möchte man nur die vaskuläre Schicht (Abbildung 13 b, white-Box), aber teilweiser Einbeziehung der GCL scan ist oft notwendig.Verlassen einer Überlänge des Sehnervs nach abschneiden, als auch die Kürzungen, die flach-Mount als zu kurz, zu erreichen führen zu ungleichen Montage.

Abbildung 13: Vergleich der er Färbung und Autofluoreszenz in der Netzhaut Erwachsenen Zebrafisch. Netzhaut Gefäßsystem im Fokus über die GCL (A). Netzhaut Gefäßsystem (weißes Feld) zeigt grün ein EGFP Signal und Netzhaut Schichten ausstellenden starke Autofluoreszenz (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Wie die richtige Vorbereitung des Zebrafisch retinalen Gefäßsystems Vorbildung benötigt, eine kleinen Stichprobe mit ungeschulten Dissectors und stark variierende Vorbereitung Ergebnisse sind eine wesentliche Einschränkung der Technik. Während die Vorbereitung des tg(fli:EGFP) Zebrafisch Augen schnell Einblick in den Stand des Gefäßsystems gibt, nutzt die Technik immer noch rund 20 Minuten Arbeitszeit pro Retina für ein erfahrener Forscher. All diese Vorbereitungsschritte für die Netzhaut Gefäßsystem unter dem sezierenden Mikroskop durchgeführt werden müssen und Dissectors müssen bleiben konzentriert die ganze Zeit wie ein unvorsichtiger Schritt möglicherweise Schiff Bruch hervorrufen kann. Der Sezierer sollte regelmäßig üben, wie längerer Abwesenheit von der Vorbereitung einer Sezierer Verwechslungsgefahr Schiff Integrität reduziert.

Darüber hinaus ist zusätzliche Auslesen über immunhistochemische (IHC) noch begrenzt, da nur wenige Antikörper validiert auf menschliche und Nagetier Gewebe mit Zebrafisch arbeiten. Experimentatoren interessiert IHC geraten, suchen Zebrafisch-spezifische Antikörper, vor allem bei der Arbeit mit neuen Zielen. Alternativ empfiehlt es sich, zusätzliche Zebrafisch Reporter Linien verwenden die Zellen über das Gefäßsystem in das Auge zu studieren nützlich sind. Diese Strategie ist allerdings zeitaufwendig, da es ein paar Monate dauert zu Erwachsenen Zebrafisch Linien zu erzeugen, die mehrere transgene Reporter tragen.

Der Zebrafisch stellt dennoch eine einzigartige Palette von Vorteilen. Sie sind relativ klein und leicht zu reproduzieren. Sie können zu adulten Stadien schnell wachsen und ihre Embryonen sind optimal für Drogen-Screening. Das Feld wächst leicht und weitere Literatur ist immer zugänglich. Mit der Fähigkeit, gen Knockouts mit einer schnellen Geschwindigkeit und eine Fülle von Transgen Fluoreszenz Reporter Linien zu erzeugen ist die Wahl für Zebrafisch nur durch die gewählte Forschungsfrage zurückhaltend.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaOH	Roth	6771.3
KCl	Merck	1.04936
CaCl2*6H20	Roth	5239.2
MgSO4*7H20	Merck	1.05886.0500
Paraformaldehyd	Roth	0335.3
Natrium Dihydrogenphosphat	Roth	2370.1
Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat Salz (MS-222,Tricain)	Sigma	A5040
PBS	Roth	9143.1
Agarose	Roth	2267.3
Fluoromount-G	Thermo-Fischer	00-4958-02
Petrischale	Greiner Bio one	633180
Six-Well-Platte	StarLab	CC7682-7506
Nadel	MSG Praxisbedarf	BD 300900
Mikropinzette	World Precision Instruments	14095
Mikrodissektionsschere	World Precision Instruments	501778
Glasobjektträger	Carl	Roth H872.1
Deckglas 22mmx22mm	neoLab
Scalpel	MSG Praxisbedarf	FEA111
Epi-Illumination	Leica	10446389
Fluoreszenz-Stereomikroskop MZ10 F	Leica	NA
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop SP5 DS	Leica	NA
Stereomikroskop M80	Leica	NA
Zebrafisch-Linie: Tg(fli:EGFP), ABTL Wildtyp	NA	NA	siehe Referenz 15
Mayer' s Hämatoxylin	Dr. K. Hollborn & Sö hne	0088663
0,5% Eosin	Dr. K. Hollborn & Sö hne	NA
99,9% Ethanol	Roth	9065.2
Paraffin	Merck	1.071.501.000
Xylol	Roth	4436.2
Aceton	Emsure	606-001-00-8
Mikrotom RM 2165	Leica	NA