Methodenartikel

Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen

DOI:

10.3791/56676

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9. Januar 2018

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1Department of Psychiatry, Chang Gung Memorial Hospital-Linkou, 2Department and Graduate Institute of Biomedical Sciences, Chang Gung University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir drückten ectopically NR1 Untereinheit der NMDA-Rezeptor mit dem Stichwort grünen fluoreszierenden Proteins in den menschlichen embryonalen Zellen (HEK293) als Antigen Autoantikörper gegen NMDA-Rezeptor im Blut von Patienten mit Verdacht mit autoimmune Enzephalitis zu erkennen. Diese einfache Methode möglicherweise zu screening-Zwecken in klinischen Umgebungen geeignet.

Zusammenfassung

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Das Vorhandensein von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper kann dazu führen, dass verschiedene neuropsychiatrische Symptome bei den betroffenen Patienten, Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis bezeichnet. Nachweis von spezifischen Autoantikörper gegen den NMDA-Rezeptor im Blut oder Liquor cerebrospinalis (CSF) ist wichtig für die genaue Diagnose dieser Erkrankung. Der NMDA-Rezeptor ist ein Ionen-Kanal Proteinkomplex, der vier Untereinheiten, einschließlich zwei obligatorische NMDA-Rezeptor Untereinheit 1 (NR1) und ein oder zwei NMDA-Rezeptor enthält Untereinheit 2A (NR2A), NMDA-Rezeptor-Untereinheit 2 b (NR2B), NMDA-Rezeptor-Untereinheit 2C (NR2C) oder NMDA-Rezeptor Untereinheit 2D (NR2D). Das Epitop des Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper wurde berichtet, dass in den extrazellulären N-terminale Domäne des NR1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors anwesend sein. Das Ziel dieser Studie ist es, einen einfachen zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay zu entwickeln, der als Screening-Test zum Nachweis von Autoantikörpern gegen NR1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors im Blut, die klinische und Forschung zu erleichtern verwendet werden kann Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis.

Einleitung

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Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis ist eine neu erkannten Krankheit-Einheit, die bei Patienten aller Altersgruppen auftreten kann, und betrifft überwiegend weiblichen Patienten1,2. Es ist eines der am häufigsten diagnostizierten Enzephalitis bei Patienten mit initial unbekannter Ätiologie der Enzephalitis3. Patienten, die mit Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis in der Regel haben prodromale Symptome von Kopfschmerzen oder Fieber, gefolgt durch die schnelle Entwicklung des Bewusstseins Ebene ändern und eine Vielzahl von akuten neuropsychiatrischen Symptome, wie Unruhe, Reizbarkeit , ....

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Protokoll

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Die Studie wurde von der institutionellen Review Board der Chang Gung Memorial Hospital in Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3) genehmigt.

1. Vorbereitung des Plasmids NR1-GFP Expression

  1. Mix 10 ng NR1-GFP Plasmids mit 100 µL Escherichia coli kompetente Zellen Stamm DH5α in eine sterile 1,5 mL Röhrchen pipettieren die Mischung sanft bis Zentrifugieren und ab 4 bis 6 Mal, und das Rohr auf dem Eis für 20 min inkubieren.
  2. Inkubieren Sie das Rohr bei 42 ° C für 1 min in einem Wasserbad, nehmen Sie das Rohr aus dem Wasserbad, fügen Sie 1 mL Lysogeny Brühe (LB) Medium in das Rohr und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 °....

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Ergebnisse

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Im Durchschnitt konnten wir 200-300 µg Endotoxin-freie Meinungsäußerung Plasmid NR1-GFP und GFP 250 mL Bakterienkultur, die wie folgt beschrieben in Abschnitt 1 des Protokolls erhalten. Ein Betrag von 100 ng/Well des Plasmids Ausdruck war für die Transfektion der HEK293 Zellen kultiviert in der 48-Well-Platte, wie beschrieben in Abschnitt 2 des Protokolls verwendet. 24-30 h nach Transfektion, die Zellen ausgedrückt NR1-GFP und rekombinante Proteinen GFP unter Fluoreszenz-Mikroskop nachgew.......

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Diskussion

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Es gibt mehrere zellbasierte immunologische Tests auf das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen NMDA-Rezeptor beschrieben, darunter live zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay11, zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay9 behoben , und Flow Cytometry-basierte assay14. Der live zellbasierte Immunfluoreszenz-Test sollte durchgeführt werden, kurz nach der Herstellung der Zellen das NR1-Protein, ectopically auszudrücken, während Flow Cytometry basierende Assays.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der Chang Gung Medical Foundation (Grant-Nummer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 und CMRPG3E0633) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GRIN1 (GFP-markiert) - Humaner Glutamatrezeptor, ionotrop, N-Methyl-D-Aspartat 1 (GRIN1), Transkriptvariante NR1-1Origene (Rockville, MD, USA)RG219368NR1-cDNA-Klon, markiert mit C-terminalen tGFP-Sequenzen
pCMV6-AC-GFPOrigene (Rockville, MD, USA)PS100010Säugetiervektor mit C-terminalem tGFP-Tag
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen (Hilden, Deutschland)12362
Lipofectamine 2000 TransfektionsreagenzInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)11668-019
Opti-MEM I Reduziertes Serum MediumThermo Fisher31985-070
DMEM, hoher Glukosegehalt, PyruvatThermo Fisher11995-065
Charakterisiertes fötales Rinderserum, US-HerkunftGE Healthcare Life SciencesSH30071.01
Ziegen-Anti-Human-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594-KonjugatThermo FisherA-11014
Positivkontrolle: Anti-Glutamat-Rezeptor (Typ NMDA)Euroimmun AG, Lü beck, DeutschlandCA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit

Referenzen

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  1. Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
  2. Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
  3. Pruss, H., ....

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Schlagwörter

Autoantik rper NachweisHEK293 ZellenNR1 GFP PlasmidFluoreszenzmikroskopiePlasma ScreeningPBST WaschungGlycerol DAPIKolokalisationsanalyse

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