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Methodenartikel

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

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DOI:

10.3791/56688

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14. Dezember 2017

 , 
1Laboratory of Brain and Neurological Disorders, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Laboratory of Neuropathology and Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie beschreibt eine einfache Methode zur Erkennung von endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung von Leucin-reiche wiederholen Kinase 2.

Zusammenfassung

Mutationen im Leucin-reiche wiederholen Kinase 2 (LRRK2) haben gezeigt, mit familiären Parkinson-Erkrankung (FPD) verknüpft werden. Da abnormale Aktivierung der Kinase-Aktivität von LRRK2 in der Pathogenese von Morbus Parkinson in Verbindung gebracht hat, ist es wichtig, eine Methode zur Evaluierung der physiologischen Ebenen die Kinase-Aktivität von LRRK2 zu etablieren. Neuere Studien gezeigt, dass LRRK2 Rab GTPase Familienmitglieder, einschließlich Rab10, unter physiologischen Bedingungen phosphorylates. Obwohl die Phosphorylierung des endogenen Rab10 von LRRK2 in kultivierten Zellen durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden konnte, ist es schwierig zu erkennen durch Immunoblotting aufgrund der schlechten Empfindlichkeit der derzeit verfügbaren Phosphorylierung-spezifische Antikörper für gewesen. Rab10. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zum Nachweis der endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung von LRRK2 basierend auf Immunoblotting Verwendung von Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) kombiniert mit einem Phosphat-Bindung-Tag (P-Tag), die ist N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- Tris (Pyridin-2-Yl-Methyl) - 1,3 - Diaminopropan-2-Ol. Dieses Protokoll nicht nur liefert ein Beispiel für die Methode, die Nutzung im P-Tags, sondern ermöglicht auch die Bewertung von Mutationen sowie Inhibitor Behandlung/Verwaltung oder andere Faktoren, wie alter der nachgeschalteten Signalisierung von LRRK2 in Zellen und Geweben .

Einleitung

PD gehört zu den häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, überwiegend dopaminergen Neuronen im Mittelhirn, beeinflussen, was zu Funktionsstörungen des motorischen Systems in Senioren1. Während die meisten Patienten PD auf sporadische Weise entwickeln, gibt es Familien, die Krankheit zu erben. Mutationen in verschiedenen Genen wurden gefunden, mit FPD2verknüpft werden. Die verursachenden Gene für FPD gehört LRRK2, in denen acht Missense-Mutationen (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S und I2020T) verbunden mit einer dominant vererbten FPD genannt PARK8 bisher gemeldeten3,4,5gewesen sein. Mehreren genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) sporadische PD-Patienten haben auch genomische Variationen bei den LRRK2-Locus als Risikofaktor für PD, darauf hindeutet, dass die Anomalie in der Funktion von LRRK2 ist eine häufige Ursache für Neurodegeneration in beiden sporadisch identifiziert und PARK8 FPD6,7,8.

LRRK2 ist ein großes Protein (2.527 Aminosäuren) bestehend aus einer Leucin-reiche wiederholen Sie Domäne, ein GTP-Bindung Ras komplexe Proteine (ROC) Domäne, eine C-terminale ROC (ADR) Domäne, eine Serin/Threonin Protein Kinase-Domäne und einer WD40 wiederholen Domäne9. Die acht FPD-Mutationen finden in diesen funktionellen Domänen; N1437H und R1441C/G/H/S in der ROC-Domäne, Y1699C im Bereich ADR, G2019S und I2020T in der Kinase-Domäne. Da G2019S Mutation, die am häufigsten in PD Patienten10,11,12Mutation gefunden wird, die Kinase-Aktivität von LRRK2 2-3 Fach in-vitro-13erhöht, wird es vermutet. dass die abnorme Zunahme der Phosphorylierung von LRRK2 Substrate giftig für Neuronen. Es war jedoch unmöglich zu prüfen, ob die Phosphorylierung von physiologisch relevanten LRRK2 Substraten in familiären/sporadische PD-Patienten aufgrund der fehlenden Methoden in abgeleiteten Patientenstichproben Bewertung geändert wird.

Protein-Phosphorylierung wird in der Regel durch Immunoblotting oder Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) mit Antikörpern, die spezifisch erkennen des phosphorylierten Zustands Proteine oder durch massenspektrometrische Analyse erkannt. Die ehemalige Strategie kann jedoch manchmal wegen der Schwierigkeiten bei der Schaffung von Phosphorylierung-spezifische Antikörper angewendet werden. Metabolische Kennzeichnung von Zellen mit radioaktivem Phosphat ist eine weitere Option, physiologische Ebenen der Phosphorylierung zu untersuchen, wenn Phosphorylierung-spezifischen Antikörper nicht leicht verfügbar sind. Aber es erfordert eine große Menge radioaktiver Stoffe und daher beinhaltet einige spezielle Ausrüstung für Strahlenschutz14. Massenspektrometrische Analyse ist empfindlicher gegenüber diesen immunchemische Methoden und populär bei der Analyse von Protein-Phosphorylierung. Jedoch die Probenvorbereitung ist zeitaufwändig und teuer Instrumente sind für die Analyse erforderlich.

Eine Teilmenge der Rab GTPase Familie einschließlich Rab10 und Rab8 wurde kürzlich berichtet, wie das Ergebnis eines umfangreichen Phosphoproteomic Analyse15direkte physiologische Substrate für LRRK2 zugrunde. Wir zeigten dann, dass Rab10 Phosphorylierung von FPD Mutationen im embryonalen Fibroblasten der Maus und in den Lungen von Profi Mäuse16erhöht wurde. In diesem Bericht, wir entschieden uns für eine Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) beschäftigen-basierte Methode, bei der ein P-Tag-Molekül Co polymerisierten in SDS-PAGE Gelen (P-Tag SDS-PAGE) zur Erfassung der endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung denn ein hochempfindlicher Antikörper spezifisch für phosphorylierten Rab10 noch fehlte. Wir haben versäumt, die Phosphorylierung des endogenen Rab8 aufgrund der schlechten Selektivität der derzeit verfügbaren Antikörper für insgesamt Rab8 erkennen. Daher entschieden wir uns konzentrieren auf die Rab10 Phosphorylierung. LRRK2 phosphorylates Rab10 bei Thr73 Ortung in der Mitte der Region hoch konservierte "Schalter II". Hohe Erhaltung der Phosphorylierung Websites unter Rab-Proteine möglicherweise einer der Gründe, warum Phosphospecific Antikörper erkennen unterschiedliche Rab-Proteine schwer sind zu machen.

Die Phosphorylierung des Rab8A von LRRK2 hemmt die Bindung von Rabin8, ein Guanin-Nukleotid Austausch Faktor (GEF) die Rab8A aktiviert, durch den Austausch der gebundenen BIP mit GTP15. Phosphorylierung von Rab10 und Rab8A von LRRK2 hemmt auch die Bindung von BIP-Dissoziation-Inhibitoren (GDIs), die wesentlich für die Aktivierung des Rab-Proteine durch die Gewinnung von BIP-gebundenen Rab-Proteine von Membranen15. Gemeinsam wird es vermutet, dass die Phosphorylierung des Rab-Proteine von LRRK2 sie Aktivierung daran hindert, obwohl die genauen molekularen Mechanismus und physiologischen Folgen der Phosphorylierung unklar bleiben.

P-Tag SDS-PAGE wurde erfunden von Kinoshita Et Al. 2006: bei dieser Methode wurde Acrylamid kovalent verbunden mit P-Tag, ein Molekül Erfassung Phosphate mit hoher Affinität, die in SDS-PAGE copolymerisiert Gele17. Da die P-Tag-Moleküle in einem SDS-PAGE Gel selektiv elektrophoretische Mobilität der phosphorylierten Proteine verzögern, kann P-Tag SDS-PAGE phosphorylierten Proteine von nicht phosphoryliert zu trennen (Abbildung 1). Wenn das Protein des Interesses auf mehrere Reste phosphoryliert wird, wird eine Leiter Bands differentiell phosphorylierten Formen entsprechend beobachtet werden. Im Falle von Rab10 beobachten wir nur eine verschobene Band darauf hinweist, dass Rab10 nur bei Thr73 phosphoryliert wird. Der große Vorteil der P-Tag SDS-PAGE über Immunoblotting mit Phosphorylierung-spezifischen Antikörpern ist, dass phosphorylierten Rab10 durch Immunoblotting mit Phosphorylierung-unspezifische Antikörper (d.h.erkennen total Rab10) nachgewiesen werden können nach auf Membranen übertragen wird, ist die in der Regel bestimmten, sensiblen und verfügbar aus kommerziellen/akademische Quellen. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von P-Tag SDS-PAGE ist eine ungefähre Schätzung der Stöchiometrie der Phosphorylierung, erhalten kann, das ist unmöglich, durch Immunoblotting mit Phosphorylierung-spezifische Antikörper oder durch metabolische Kennzeichnung von Zellen mit radioaktiven Phosphate.

Abgesehen von der Verwendung von preiswerten P-Tag Acrylamid und einige geringfügigen Änderungen mit sich bringen folgt das vorliegende Verfahren zur Erkennung von Rab10 Phosphorylierung von LRRK2 ein allgemeines Protokolls Immunoblotting.Daher sollte es unkompliziert und leicht ausführbare in jedem Labor sein, wo Immunoblotting eine übliche Praxis, mit allen Arten von Proben ist, einschließlich der gereinigten Proteine, Zelle Lysates und Gewebe Homogenates.

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Protokoll

(1) Probenvorbereitung für die P-Tag SDS-PAGE

  1. Entfernen Sie und entsorgen Sie die Medien aus 10 cm Gerichte, in denen Zellen angebaut werden mit einer Absaugung, waschen Sie Zellen mit 5 mL Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) durch die erste Zugabe DPBS auf die Seite der Gerichte um nicht zu stören die Zellschicht und manuell rocken Sie die Gerichte zurück und her mehrere Male.
  2. Entfernen Sie und entsorgen Sie des DPBS mit einer Absaugung fügen Sie 2 mL von 0,25 % (w/V) Trypsin in DPBS verdünnt hinzu und schütteln Sie die Gerichte zur Deckung der Zellschicht. Genommen Sie die Gerichte in eine CO2 -Inkubator (37 ° C, feuchte Luft, 5 % CO2) für 5 min.
  3. Nach Pipettierung nach oben und unten mit einer Einweg-Pipette freistehende Zellen aufzubrechen, sammeln Sie die Zellsuspension in ein 15 mL Röhrchen und Messen Sie die Zelldichte mit einem Hematocytometer unter einem Mikroskop18.
  4. Verdünnen Sie die Zellen bis 2,5 × 105 Zellen/mL mit Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % (V/V) fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt. Geben Sie 2 mL (5 × 105 Zellen) von verdünnter Zellsuspension in jedem 6-Well Platten.
  5. Wachsen Sie die Zellen über Nacht in eine CO2 -Inkubator (37 ° C, feuchte Luft, 5 % CO2).
  6. Transfektion in HEK293 Zellen
    Hinweis: Wenn Phosphorylierung des endogenen Rab10 werden untersucht soll, fahren Sie mit Schritt 1,7. In diesem Protokoll verwendeten Plasmide erhalten Sie von den Autoren auf Anfrage. Siehe Tabelle der Materialien für kurze Informationen und Abbildung S1 für ihre DNA-Sequenzen.
    1. Aliquoten 200 µL DMEM in 1,5 mL Röhrchen.
    2. Jedes Rohr fügen Sie beide 0,266 µg (Endkonzentration von 1,33 µg/mL) von einem Plasmid Codierung HA-Rab10 und 1.066 µg (Endkonzentration von 5,33 µg/mL) von einem Plasmid Codierung 3 × Flagge LRRK2 von 500 µg/mL Plasmid Aktien hinzu. Dann fügen Sie 4 µL 1 mg/mL Lösung von Polyethyleneimine (gelöst in 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0) und mischen Sie sofort die Lösung durch Vortexen für 5 s.
    3. Lassen Sie die Rohre für 10 min bei Raumtemperatur stehen und fügen Sie den Inhalt der eine Röhre tropfenweise zu einem gut mit einer Mikropipette. Rocken Sie sanft und manuell die Kultur Platten mehrere Male hin und her, um die Transfektion Mischung gleichmäßig in den Brunnen diffundieren zu lassen.
  7. Lassen Sie die Zellen, die für ein weiteres 24-36 h in einem CO-2 -Inkubator (37 ° C, feuchte Luft, 5 % CO2) wachsen.
  8. Wenn Phosphorylierung des endogenen Rab10 werden untersucht soll, behandeln Sie Zellen mit und ohne LRRK2-Inhibitoren für 1 h vor der Lyse der Zellen.
    1. Bereiten Sie Stammlösungen von LRRK2-Inhibitoren durch Auflösen der Inhibitoren in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) bei 10 mM. Wir empfehlen die Verwendung von MLi-2 und GSK2578215A, die sehr spezifisch und potente LRRK2-Inhibitoren sind. Speichern Sie auf lagerlösungen bei-80 ° C.
    2. Arbeiten Bestände der Inhibitoren durch Verdünnung der Stammlösungen mit DMSO vorzubereiten: für MLi-2, 10 µM und 30 µM für endogene und überexprimieren LRRK2 bzw. vorzubereiten. GSK2578215A Vorbereitung 1 mM und 3 mM für endogene und überexprimieren LRRK2, beziehungsweise.
    3. Fügen Sie 2 µL der Arbeiten Bestände von MLi-2 oder GSK2578215A in die Mitte eines nun mit einer Mikropipette und schütteln Sie die Platte manuell hin und her mehrere Male, um die Inhibitoren gleichmäßig im ganzen gut diffundieren zu lassen.
    4. Geben Sie 2 µL von DMSO in ein anders als Negativkontrolle in einer ähnlichen Weise zu den Inhibitor im Schritt 1.8.3.
    5. Setzen Sie die Platten wieder in den Inkubator und Kultur die Zellen 1 h.
  9. Lyse der Zellen.
    1. Die Kultur-Platten auf Eis gelegt. Entfernen und entsorgen der Medien. Waschen Sie die Zellen mit ersten Hinzufügen von 2 mL DPBS auf die Seite der Gerichte zu vermeiden, stören die Zelle Schicht und manuell die Gerichte mehrere Male hin und her schaukeln.
    2. Entfernen und entsorgen des DPBS und fügen Sie die Zellen 100 µL des Puffers lyse (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 % (V/V) polyoxyethylene(10) Octylphenyl Äther, 1 mM EGTA (Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure), 1 mM Natrium Orthovanadate, 50 mM Natriumfluorid, β-Glycerophosphat 10 mM, 5 mM Natrium Pyrophosphat, 0,1 µg/mL Microcystin-LR, 270 mM Saccharose, Protease-Inhibitor cocktail).
    3. Kippen Sie die Platten auf dem Eis und kratzen Sie die Zellen mit einem Zelle Schaber, um soviel Zelle lysate wie möglich zu sammeln. Sammeln Sie die Lysates mit einer Mikropipette in 1,5 mL Röhrchen (vorab gekühlt auf Eis).
      Achtung: Microcystin-LR kann tödlich wenn verschlucken oder Berührung mit der Haut sein.
  10. Lassen Sie die Rohre auf Eis für 10 min für komplette Lyse stehen. Klären Sie der Zelle Lysates durch Zentrifugieren (20.000 × g, 10 min bei 4 ° C) und übertragen Sie die Überstände auf neue 1,5 mL Röhrchen vorab auf Eis gekühlt.
  11. Proteinkonzentration (µg/µL) von den gerodeten Lysates von Bradford-Test zu messen.
    1. Bereiten Sie Rinderserumalbumin (BSA) Normen (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1 mg/mL) durch eine Verdünnung der Stammlösung mit destilliertem Wasser. 20-fache der geräumten Zelle Lysates durch Verdünnen mit destilliertem Wasser.
    2. 5 µL/Well der BSA Standards setzen, verdünnt Blank (destilliertes Wasser), und jede Zelle lysate in eine 96-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung.
    3. 150 µL/Well des Bradford-Assay Reagenz mit 12-Kanal Mikropipette und lassen Sie die Platte für 5 min bei Raumtemperatur stehen.
    4. Messung der Extinktion bei 595 nm auf einer Platte Leser und im Vergleich zu BSA Standards.
  12. SDS-PAGE 100 µL der Proben vorbereiten. Die Konzentration des Proteins der Proben ist 1 µg/µL für überexprimieren HA-Rab10 und 2 µg/µL für endogene Rab10.
    1. Mit der quantifizierten Konzentrationen von Schritt 1.11.4, berechnen Sie das Volumen (µL) der Zelle Lysates entspricht 100 µg (überexprimieren HA-Rab10) oder 200 µg (endogene Rab10) durch Division der Protein-Menge (100 µg oder 200 µg) durch die Proteinkonzentration von Lysaten (µ g/µL).
    2. Fügen Sie 25 µL 4 × Laemmli SDS-PAGE Probenpuffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8 % (w/V) SDS, 40 % (V/V) Glycerin, 0,02 % (w/V) Bromophenol Blue, 4 % (V/V) β-Mercaptoethanol hinzu), neue 1,5 mL Röhrchen bei Raumtemperatur aufbewahrt.
    3. Fügen Sie das berechnete Volumen der Zelle Lysates zu jedem Rohr und Mischen von vortexen für 5 s bei Raumtemperatur.
    4. Das Gesamtvolumen zu 100 µL mit Lyse Puffer und Mischung zu bringen, durch Vortexen für 5 s bei Raumtemperatur.
  13. Ergänzen Sie mit 10 mM MnCl2 der Chelatbildner zu stillen. Fügen Sie 1 µL von 500 mM MnCl2. Mix von vortexen für 5 s bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Proben mit MnCl2 sind möglicherweise nicht für normale SDS-PAGE geeignet.
Dieser Schritt ist erforderlich aufgrund der Anwesenheit von der Chelatbildner (wie Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), EGTA, etc.) in der Lyse-Puffer. Andernfalls Mn2 + -Ionen gekoppelt an P-Tag Acrylamid werden durch den Komplexbildnern getrennt werden, und P-Tag SDS-PAGE wird nicht richtig funktionieren.
  • Alle Proben bei 100 ° C für 5 min kochen und die Proben unter-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern. Die gekochten Proben können bis zu 6 Monate gelagert werden.

    • 2. Casting Gele für P-Tag SDS-PAGE

    Hinweis: Gele sollten am selben Tag wie die Ausführung der Gele erfolgen. Gele können unter Lichtverhältnissen gemacht werden.

    1. 5 mM P-Tag Acrylamid-Stammlösung durch erste auflösen die 10 mg Pulver/Solid P-Tag Acrylamid komplett mit 100 µL des Methanols vorbereiten und dann bis 3,3 mL indem doppelt destilliertes Wasser bringen.
      Hinweis: P-Tag Acrylamid ist lichtempfindlich. Die fertige Lösung ist bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 ° C aufzubewahren.
    2. Saubere schlicht und gekerbte Platten durch 70 % igem Ethanol Spritzen und mit einem Papiertuch abwischen. Montieren Sie die Gel-Platten. Die Abmessungen der in diesem bestimmten Protokoll verwendeten Gel-Platten sind 80 oder 100 mm lang 100 mm breit. Sauberen Silizium Abstandhalter werden zwischen Ebene und gekerbte und montierten Platten mit Binder Clips eingespannt sind.
      Hinweis: Jede Art von Gel-Platten, die Arbeiten für den normalen SDS-PAGE verwendet werden kann.
    3. Setzen Sie einen Kamm früher (17-Brunnen Binderücken) in die montierten Gel-Platten und Mark auf die Gelplatte die Position des unteren Rands der Brunnen mit einem wasserfesten Filzstift.
    4. 10 mL 10 % Acrylamid Gel Mischung vorbereiten (10 % (w/V) Acrylamid (Acrylamide:bis-Acrylamid = 29,1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 % (w/V) SDS) in der 15 mL Tube.
      Hinweis: Die optimale Konzentration des Acrylamids variieren je nach verwendeten Reagenzien. Tetramethylethylenediamine (TEMED) und Ammonium Bleichen (APS) sollten nicht an dieser Stelle hinzugefügt werden.
    5. Fügen Sie 100 µL 5 mM P-Tag Acrylamid und 10 µL 1 M MnCl2 Lösungen bei Endkonzentrationen von 50 µM und 100 µM bzw..
      Hinweis: Die optimalen Konzentrationen der P-Tag Acrylamid und MnCl2 variieren auch je nach verwendeten Reagenzien.
    6. Fügen Sie 15 µL TEMED, die Gel-Mischung auf eine Endkonzentration von 0,15 % (V/V) und dann 50 µL 10 % (w/V) APS auf eine Endkonzentration von 0,05 % (w/V). Mischen Sie gut durch sanft schütteln das Rohr für 5 s und gießen in den montierten Platten sofort bis zu einer Höhe d. h. 2 mm unterhalb der Position im Schritt 2.3 markiert.
    7. Sanft layer-2-Propanol auf die Gel-Lösung zu der Spitze der Trennung Gele zu glätten.
    8. Lassen Sie die Gele für 30 min bei Raumtemperatur stehen. Es ist nicht notwendig, die Gele vor Licht zu schützen.
      Hinweis: Es möglicherweise für Gele, legen Sie unter Zellentemperatur länger dauern. Die Gel-Mischung vor dem Hinzufügen von TEMED und APS Entgasung hilft, diesen Schritt zu beschleunigen. Zu diesem Zweck kann die Gel-Mischung in ein 100-200 mL-Erlenmeyerkolben an eine Absaugung angeschlossen vorbereitet werden. Entgasen Sie die Lösung für 10 min.
    9. Entfernen Sie die geschichteten 2-Propanol durch die Aufnahme mit einem Papiertuch.
    10. Waschen Sie den obersten Raum der Gele durch den Raum auffüllen mit destilliertem Wasser aus einer Waschflasche und entsorgen Sie das Wasser durch das Gießen ab ins Becken. Wiederholen Sie 3-Mal waschen.
    11. Entfernen Sie Restwasser verbleiben im oberen Bereich der Gele durch die Aufnahme mit einem Papiertuch.
    12. 3 mL 4 % Acrylamid Gel Mischung vorbereiten (4 % (w/V) Acrylamid (a: Crylamide:bis-Acrylamid = 29,1), 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1 % (w/V) SDS) in der 15 mL Tube.
      Hinweis: Keine hinzu P-Tag Acrylamid oder MnCl2 Lösung Stapeln Gel-Mischung.
    13. Fügen Sie 7,5 µL TEMED und 24 µL 10 % (w/V) APS bei endgültigen Konzentrationen von 0,25 % (V/V) und 0,08 % (w/V), beziehungsweise. Mischen Sie gut durch sanft schütteln das Rohr für 5 s und gießen Sie das Gemisch auf die Trennung Gel. Sofort setzen Sie geeignete Kämme (17-Brunnen Plastikbinderücken die bis zu 25 µL der Proben, z. B. beherbergen).
    14. Lassen Sie die Gele für 30 min bei Raumtemperatur stehen. Es ist nicht notwendig, die Gele vor Licht zu schützen. Nachdem die Stapeln Gele eingerichtet haben, führen Sie sie ohne weitere Lagerung.

    (3) SDS-PAGE und Immunoblotting

    1. Entfernen Sie die Kämme aus der Gele. Dann entfernen Sie das Silizium Abstandhalter und dann Clips die Gele.
    2. Die gegossenen Gele in Gel-Tanks und befestigen Sie das Gel in den Tank durch Klemmung mit Bindemittel-Clips.
    3. Gießen Sie den laufenden Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % (w/V) SDS) an der Unterseite und Oberseite der Gele. Sauberen Brunnen durch Spülen des laufenden Puffers mit einer 5 mL Spritze und Nadel 21G um Gel Stücke zu entfernen.
    4. Entfernen Sie Luftblasen aus dem unteren Raum der Gele mit einer gebogenen Nadel befestigt, eine Spritze. Um eine verbogene Nadel machen, manuell beugen einer 21G-Nadel in der Mitte der Nadel, so dass der Winkel zwischen der Spitze und der Basis der Nadel 30-45 wird °.
    5. Spin-down Ausscheidungen verursacht durch die Zugabe von MnCl2 bei 20.000 × g für 1 min bei Raumtemperatur klare Proben erhalten.
    6. Laden Sie 10 µg Proteine für die Erkennung der Phosphorylierung von überexprimieren Rab10 und 30 µg Proteinen für endogene Rab10.
      Hinweis: Es ist wichtig, gleiches Volumen der Proben in alle Wells zu laden. Leere Gassen sollten mit 1 × Laemmli SDS-PAGE Probenpuffer eingelegt werden. Den Dummy-Proben Proben MnCl2enthalten, die gleiche Konzentration an MnCl2 hinzugefügt.
    7. Die gut geladen mit einem Molekulargewicht Marker (MWM) sollte auch mit 1 × Laemmli SDS-PAGE Probenpuffer ergänzt werden so dass das Volumen der Proben geladen in alle Wells ist.
      Hinweis: Auch wenn die Proben MnCl2enthalten, fügen Sie die gleiche Konzentration an MnCl2 der MWM hinzu. Alternativ kann eine EDTA-freie MWM verwendet werden.
    8. Führen Sie Gele bei 50 V zum Stapeln (ca. 30 min.), bis die Farbstoff-Front in der Trennung Gel kreuzt.
    9. Nachdem die Proben zu stapeln, ändern die Spannung auf 120 V für die Trennung bis Farbstoff vorne den Boden der Gele erreicht (ca. 50 bis 80 min für 80-100 mm lange Gele, beziehungsweise).
      Hinweis: Die Migration Muster von der MWM wird voraussichtlich auf normalen SDS-PAGE Gelen anders sein. Es sollte nicht verwendet werden, für die Schätzung des Molekulargewichts der Proteine auf P-Tag SDS-PAGE Gelen aber zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der P-Tag Gele eingesetzt werden. Informationen finden Sie unter Diskussion .
    10. Waschen Sie die Gele um MnCl2 aus der Gele zu entfernen.
      1. Gießen Sie die Übertragung mit 10 mM EDTA Puffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20 % (V/V) Methanol) und 0,05 % (w/V) SDS in einen Behälter (z.B.große Boote wiegen).
    Das Volumen des Puffers sollte ausreichen, um ein Gel zu decken.
  • Entfernen Sie die Trennung Gele von den Gel-Platten und ein Gel in einem Container. Entsorgen Sie das stapelnde Gel.
  • Lassen Sie die Gele auf einen rockigen Shaker (~ 60 u/min) für 10 min bei Raumtemperatur.
  • Wiederholen Sie die Wäsche insgesamt 3 Mal.
    Hinweis: Verwenden Sie frische Puffer für jede Wäsche.
  • Waschen Sie die Gele einmal für 10 min. mit dem Transfer-Puffer mit 0,05 % (w/V) SDS, EDTA zu entfernen. Das Volumen des Puffers sollte ausreichen, um ein Gel zu decken.
  • Elektro-Übertragung auf Nitrozellulose oder Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membranen mit nassen Tanks.
    1. Legen Sie ein Filterpapier (10 x 7 cm) auf einem Schwamm-Pad für die Übertragung. Platzieren Sie das Gel auf dem Filterpapier. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen zwischen dem Filterpapier und das Gel.
    2. Eine Membran (10 x 7 cm) auf das Gel und stellen sicher, dass keine Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran.
    3. Legen Sie ein weiteres Filterpapier (10 x 7 cm) auf der Membran und wieder, stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen zwischen der Membran und das Filterpapier.
    4. Setzen Sie ein anderes Schwamm-Pad auf dem Filterpapier. Legen Sie den Papierstapel Membranfilter/in eine Kassette für den Transfer.
    5. Legen Sie die Kassette in einen Transfer-Tank, um sicherzustellen, dass die Membran zwischen dem Gel und der positiv geladenen Anode befindet.
    6. Schließen Sie den Tank an ein Netzteil an und den Tank in ein Styrol Schaum Box mit eiskaltem Wasser gefüllt. Starten Sie Transfer bei 100 V für 180 min.
      Hinweis: Längere Transfer ist notwendig, da der Transfer von Proteinen aus P-Tag SDS-PAGE Gelen sind nicht so effizient wie die von normalen SDS-PAGE Gelen. Effiziente Kühlung ist unbedingt zu vermeiden, schmelzen Gele während der Übertragung.
  • Überprüfen Sie die Übertragung
    1. Entfernen Sie die Membranen aus die Gele mit einer Pinzette und genießen Sie die Membranen in einer Ponceau S-Lösung (0,1 % (w/V) Ponceau S, 5 % (V/V) Essigsäure), übertragenen Proteine auf den Membranen in einem Plastikbehälter zu beflecken. Das Volumen der Lösung sollte ausreichen, um eine Membran zu decken.
    2. Inkubieren Sie die Membranen für 1 min bei Raumtemperatur durch Schaukeln manuell.
      Hinweis: Eine Leiter der Bands sollten in jeder Bahn sichtbar.
    3. Holen Sie die Membran aus der Färbelösung mit Pinzette und sehen Sie, ob die Leiter der Bands einheitliche Muster und Intensität in jeder Gasse hat wo die Samples geladen wurden.
    4. Entfernen Sie nach der Überprüfung der Färbung die Färbelösung zu, und fügen Sie TBST Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,1 % (V/V) Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate). Das Volumen des Puffers sollte ausreichen, um eine Membran zu decken.
      Hinweis: Die Ponceau S-Lösung kann gesammelt werden und mehrmals wiederverwendet.
    5. Rocken Sie die Membranen in TBST auf einen rockigen Shaker (~ 60 u/min) bei Raumtemperatur, bis keine sichtbaren Bänder auf den Membranen bleiben.
    6. Wiederholen Sie die Waschschritt mit frischen TBST für 5 min.
  • Entfernen Sie und entsorgen Sie der TBST. Durch Hinzufügen von 5 % (w/V) Magermilch in TBST aufgelöst und Schaukeln auf einem Boston-Shaker (~ 60 u/min) für 1 h bei Raumtemperatur zu blockieren. Das Volumen der blockierenden Lösung sollte ausreichen, um eine Membran zu decken.
  • Bereiten Sie Primärantikörper Lösungen durch Verdünnung primären Antikörper (Anti-Rab10 Antikörper für endogene Rab10) und Anti-HA Antikörper für überexprimieren HA-Rab10 in 10 mL pro Membran der blockierenden Lösung (siehe Tabelle der Materialien für die Konzentrationen).
  • Entfernen Sie und entsorgen Sie die blockierende Lösung und den primären Antikörper. Inkubieren Sie die Membranen auf einen rockigen Shaker (~ 60 u/min) über Nacht bei 4 ° c
  • Entfernen Sie die Primärantikörper Lösung und fügen Sie TBST um die Membranen zu waschen hinzu. Das Volumen des Puffers sollte ausreichen, um eine Membran zu decken.
  • Inkubieren Sie die Membranen für 5 min auf einen rockigen Shaker (~ 60 u/min) bei Raumtemperatur. Die Wäsche (Schritt 3.16) insgesamt 3 Mal wiederholen mit frischen TBST jedes Mal.
  • Bereiten Sie Sekundärantikörper Lösungen durch Verdünnung Sekundärantikörper beschriftet mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) in 10 mL pro Membran der blockierenden Lösung. Verwenden Sie Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper beschriftet mit HRP für Membranen sondiert mit dem Anti-Rab10-Antikörper und Anti-Maus IgG Antikörper beschriftet mit HRP für diejenigen sondiert mit Anti-HA Antikörper (siehe Tabelle der Materialien für die Konzentration).
  • Entfernen Sie und entsorgen Sie die TBST nach der dritten Wäsche und fügen Sie die sekundäre Antikörper-Lösung. Inkubieren Sie die Membranen auf einen rockigen Shaker (~ 60 u/min) für 1 h bei Raumtemperatur.
  • Waschen Sie die Membranen für 10 min. Wiederholen Sie die Wäsche Schritt insgesamt 3 Mal, ähnlich wie bei Schritt 3.17 in TBST.
  • Die Membranen mit verstärkte Chemilumineszenz (ECL) zu entwickeln.
    Hinweis: Die Belichtungszeit variieren je nach der ECL-Lösung und das System zur Erkennung von Chemolumineszenz verwendet.
    1. Schalten Sie ein Imager ausgerüstet mit einer – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera und einem Computer an die Kamera angeschlossen. Starten Sie die Steuerungs-Software für den Imager. Warten Sie, bis die Temperatur der CCD Kamera-25 ° c erreicht hat
    2. Setzen Sie 1 mL der ECL-Lösung für eine Membran auf einer Plastikfolie ausgebreitet auf einer Bank.
    3. Die ECL-Lösung setzen Sie eine Membran Gel-Seite nach oben auf und dann umdrehen Sie schnell, dass beiden Seiten der Membran mit der Lösung beschichtet sind.
    4. Die Membran holen und abtropfen lassen indem man eine Seite der Membran Touch ein Papiertuch für 5 s.
    5. Setzen Sie die Membran zwischen klaren Folien (z.B. klare Papier Taschen).
      Hinweis: Plastikfolie wird nicht empfohlen für die Umwicklung der Membranen. Klaren zum Einwickeln der Membran verwendeten Folien müssen so flach wie möglich ohne sichtbare Falten, unebenem Hintergrund zu vermeiden.
    6. Legen Sie die Membran auf einem schwarzen Tablett. Stellte das Tablett in den Imager und schließen Sie die Tür.
    7. Klicken Sie auf "Focusing", in das Fenster der Steuerungssoftware. Überprüfen Sie, dass die Membran richtig positioniert ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Zurück".
    8. Wählen Sie "Präzision" für"Belichtung". Wählen Sie "Manuell" für "Belichtungszeit" und legen Sie die Belichtungszeit auf 1 s.
    9. Wählen Sie "Hoch" für "Empfindlichkeit/Auflösung". Lassen Sie "Digitalisierung Bild hinzufügen" deaktiviert. Klicken Sie auf "Start", um das Bild aufzunehmen.
    10. Speichern Sie das Bild, das erschien auf dem Display des Computers als TIFF-Datei.
    11. Wiederholen Sie die Aufnahmen mit der Belichtungszeit von 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s und bis zu 180 s. Bei der Einnahme von des letzten Bildes überprüfen Sie "Digitalisierung Bild hinzufügen", damit das digitale Bild, nicht die Chemilumineszenz der Membran gleichzeitig entnommen werden kann.
    12. Wählen Sie das beste Bild mit der größten Dynamik und ohne jede sättigbaren Pixel (rot dargestellt) in den Bands von Interesse.
      Hinweis: Konventionelle Röntgenaufnahmen können auch für Erkennung19verwendet werden.

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    Ergebnisse

    Überexpression System: Phosphorylierung des HA-Rab10 von 3 Zellen × Fahne-LRRK2 in HEK293:

    HEK293 Zellen wurden mit 0,266 µg von HA-Rab10 Wildtyp und 1.066 µg von 3 × Flagge LRRK2 (Wildtyp, Kinase-inaktive Mutant (K1906M) oder FPD Mutanten) transfiziert. Rab10 Phosphorylierung wurde geprüft durch P-Tag SDS-PAGE gefolgt von Immunoblotting mit einem Anti-HA Antikörper (Abbildung 2). 10 µg Proteine wurden...

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    Diskussion

    Hier beschreiben wir eine einfache und robuste Methode zum Nachweis Rab10 Phosphorylierung von LRRK2 auf endogene Ebenen basierend auf der P-Tag-Methode. Da die derzeit verfügbaren Antikörper gegen phosphorylierten Rab10 nur mit überexprimieren Proteine15arbeitet, ist das vorliegende Verfahren unter Verwendung von P-Tag SDS-PAGE die einzige Möglichkeit, endogene Ebenen der Rab10 Phosphorylierung zu beurteilen. Darüber hinaus erlaubt das vorliegende Verfahren die Schätzung der Stöchiometrie der Rab...

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    Offenlegungen

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Danksagungen

    Wir danken Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität von Tokyo, Japan) freundlicherweise dafür die Plasmiden Codierung 3xFLAG LRRK2 WT und Mutanten. Wir danken auch Dr. Dario Alessi (Universität von Dundee, UK) freundlicherweise zur MLi-2 und das Plasmid Codierung HA-Rab10. Diese Arbeit wurde von der Japan Society für Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Anzahl JP17K08265 (G.I) unterstützt.

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    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    ReagenzienDulbecco's
    phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)hausgemachte150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 in MilliQ-Wasser und sterilisiert durch Autoklavieren
    NatriumchloridNacalai Tesque31320-34
    Natrium-Dinatriumhydrogenphosphat 12-WasserWako196-02835
    KaliumchloridWako163-03545
    KaliumdihydrogenphosphatWako169-04245
    2,5% Trypsin (10X)Sigma-AldrichT454910-fach mit sterilem DPBS verdünnen zur Herstellung der Arbeitslösung
    Dulbecco's modifiziertes Eagle medium
    (DMEM)    		Wako044-29765
    Fötales RinderserumBioWestS1560Hitzeinaktiviert bei 56 μd; C für 30 min
    Penicillin-Streptomycin (100X)Wako168-23191
    HEPESWako342-01375
    NatriumhydroxidWako198-13765
    Polyethylenimin HCl MAX, Linear, Mw 40.000 (PEI MAX 40000)PolySciences, Inc.24765-1Die Stammlösung wurde in 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0 bei 1 mg/ml hergestellt, und der pH-Wert wurde dann auf 7,0 eingestellt: mit NaOH
    DimethylsulfoxidWako045-28335
    TrisSTAR, RSP-THA500G
    Wako080-01066
    Polyoxyethylen(10)-OctylphenyletherWako160-24751entspricht Triton X-100
    Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA)Wako346-01312
    Natriumorthovanadat(V)Wako198-09752
    NatriumfluoridKanto Chemical37174-20
    β-Glycerophosphorsäure Dinatriumsalz PentahydratNacalai Tesque17103-82
    Natrium Pyrophosphat-DecahydratKokusan Chemical2113899
    Microcystin-LRWako136-12241
    SaccharoseWako196-00015
    Vollständiger EDTA-freier Proteasehemmer-CocktailRoche11873580001Lösen Sie eine Tablette in 1 ml Wasser auf, das bei -20 & deg gelagert werden kann; C für einen Monat. Verwenden Sie es in einer Verdünnung von 1:50 für die Zelllyse
    Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23200
    NatriumdodecylsulfatNacalai Tesque31607-65
    GlycerinWako075-00616
    BromphenolblauWako021-02911
    β-MercaptoethanolKanto Chemical25099-00
    EthanolWako056-06967
    MethanolWako136-01837
    Phosphat-bindendes Tag AcrylamidWakoAAL-107P-Tag Acrylamid
    40% (w/v) AcrylamidlösungNacalai Tesque06119-45Acrylamid:Bis = 29:1
    Tetramethylethylendiamin (TEMED)Nacalai Tesque33401-72
    Ammoniumpersulfat (APS)Wako016-0802110%ige (w/v) Lösung wurde durch Auflösen des Ammoniumpersulfatpulvers in MilliQ Wasser
    hergestellt 2-PropanolWako166-04831
    Manganchlorid-TetrahydratSigma-AldrichM3634
    Precision Plus Protein Prestained StandardBio-Rad1610374, 1610373, 1610377Molekulargewichtsmarker, der im Protokoll verwendet wird
    : WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker IIIWako230-02461
    Glycin, Nacalai Tesque, 17109-64
    Amersham, Protran, NC 0,45GE HealthcareNitrocellulose-Membran
    Durapore-Membranfilter,EMD-Millipore, GVHP00010PVDF-Membran
    Filterpapiere Nr. 1Advantec00013600
    Ponceau SNacalai Tesque28322-72
    EssigsäureWako017-00251
    Tween-20Sigma-AldrichP1379Polyoxyethylenorbitanmonolaurat
    Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Wako345-01865
    MagermilchpulverDifco Laboratories232100
    ImmunostarWako291-55203ECL-Lösung (normale Empfindlichkeit)
    Immunostar LDWako290-69904ECL-Lösung (hohe Empfindlichkeit)
    CBB-Färbelösunghausgemacht1 g CBB R-250, 50% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure in 1 L MilliQ Wasser
    CBB R-250Wako031-17922
    CBB-Entfärbung hausgemachte12% (v/v) Methanol, 7% (v/v) Essigsäure in 1 L MilliQ Wasser
    NameCompanyKatalognummer>Kommentare
    Antikörper
    anti-HA AntikörperSigma-Aldrich11583816001Verwendet bei 0,2 μ; g/ml für Immunblotting.
    anti-Rab10-AntikörperCell Signaling Technology#8127Wird bei 1:1000 für das Immunblotting verwendet.
    Die Spezifität wurde durch CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016, bestätigt.
    anti-pSer935 AntikörperAbcamab133450Verwendet bei 1 μ g/ml für Immunblotting.
    Anti-LRRK2-AntikörperAbcamab133518Verwendet bei 1 μ g/ml für Immunblotting.
    anti-α-Tubulin-AntikörperSigma-AldrichT9026Verwendet bei 1 μ g/ml für Immunblotting.
    anti-GAPDH-AntikörperSanta-Cruzsc-32233Verwendet bei 0,02 μ g/ml für Immunblotting.
    Peroxidase AffiniPure Schaf Anti-Maus IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch515-035-003Verwendet bei 0,16 μ g/ml für Immunblotting.
    Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-035-003Verwendet bei 0,16 μ g/ml für Immunblotting.
    Name<>CompanyKatalognummer<strong>Comments
    InhibitorsGSK2578215A
    MedChem ExpressHY-13237Stammlösung wurde in DMSO bei 10 mM hergestellt und bei -80 & Grad gelagert. C
    MLi-2zur Verfügung gestellt von Dr. Dario Alessi (University of Dundee)Die Stammlösung wurde in DMSO bei 10 mM hergestellt und bei -80 μg gelagert; C
    Name<>Unternehmen<>Katalognummer<strong>Comments
    Plasmide
    Rab10/pcDNA5 FRT TO HABereitgestellt von Dr. Dario Alessi
    (University of Dundee)    		Dieses Plasmid exprimiert aminoterminales HA-markiertes humanes Rab10.
    LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)Ito et al., Biochemistry, 46: 1380– 1388 (2007). Dieses Plasmid exprimiert aminoterminales 3xFLAG-markiertes humanes Wildtyp-LRRK2.
    LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)Ito et al., Biochemistry, 46: 1380– 1388 (2007). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte K1906M-Kinase-inaktive Mutante von humanem LRRK2.
    LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10Dieses Papier. Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte N1437H FPD-Mutante von humanem LRRK2.
    LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte R1441C FPD-Mutante von humanem LRRK2.
    LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte R1441G FPD-Mutante von humanem LRRK2.
    LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte R1441H FPD-Mutante von humanem LRRK2.
    LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10Dieses Papier. Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte R1441S FPD-Mutante von humanem LRRK2.
    LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte Y1699C FPD-Mutante von humanem LRRK2.
    LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)Kamikawaji et al., Biochemie, 48: 10963– 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte G2019S FPD-Mutante von humanem LRRK2.
    LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10Bereitgestellt von Dr. Takeshi Iwatsubo (Universität Tokio)Kamikawaji et al., Biochemie, 48: 10963– 10975 (2013). Dieses Plasmid exprimiert die aminoterminale 3xFLAG-markierte I2020T FPD-Mutante von humanem LRRK2.
    NameUnternehmen<strong>KatalognummerKommentare
    Ausrüstungen
    CO2 InkubatorThermo FisherScientific Forma Series II 3110 Wassermantel-Autopipette
    DrummondPipet-Aid PA-400
    Mikropipette P10Nichiryo00-NPX2-100.5– 10 μ L
    Mikropipette P200Nichiryo00-NPX2-20020– 200 μ L
    Mikropipette P1000Nichiryo00-NPX2-1000100– 1000 μ L
    Spitzen für Mikropipette P10STARRST-481LCRSTSterile
    Spitzen für Mikropipette P200FUKAEKASEI1201-705YSSterile
    Spitzen für Mikropipette P1000STARRST-4810BRSTSterile
    5 mL EinwegpipetteGreiner606180Sterile
    10 mL EinwegpipetteGreiner607180Sterile
    25-ml-EinwegpipetteFalcon357535Steriles
    HämatozytometerSunlead GlassA126Verbessertes Neubeuer-Mikroskop
    OlympusCKX53
    10-cm-SchalenFalcon353003Für Gewebekulturen
    6-Well-PlattenAGC Techno Glass3810-006Für Gewebekulturen
    Vortex-MischerScientific IndustriesVortex-Genie 2
    ZellenschaberSumitomo BakelitMS-93100
    1,5 mL RöhrchenSTARRSV-MTT1.5
    15 mL RöhrchenAGC Techno Glass2323-015
    50 mL RöhrchenAGC Techno Glass2343-050
    ZentrifugenTOMYMX-307
    96-Well-PlattenGreiner655061Nicht für Gewebekulturen
    geeignet Platten-ReaderMolecular DevicesSpectraMax M2e
    SDS– PAGE TanksNihon EidoNA-1010
    TransfertanksNihon EidoNA-1510B
    Gelplatten (gekerbt)Nihon EidoNA-1000-1
    Gel Platten (blank)Nihon EidoNA-1000-2
    Silikon AbstandshalterNihon EidoNA-1000-16
    17-Well-KämmeNihon EidoSonderanfertigung
    BindeklammernNihon EidoNA-1000-15
    5 mL SpritzeTerumoSS-05SZ
    21GTerumoNN-2138R
    Power Station 1000 VCATTOAE-8450Netzteil für SDS– PAGE und Transfer
    Große WägeschiffchenIna OptikaAS-DL
    KunststoffbehälterAS ONEPS CASE Nr.410 x 80 x 50 mm
    SchaukelschüttlerTitechNR-10
    StyrolschaumboxgenerischDie Innenmaße sollten für einen Übergabebehälter (200 x 250 x 250 mm) geeignet sein.
    ImageQuant LAS-4000GE HealthcareEin Imager, der mit einer gekühlten CCD-Kamera zur Erkennung von ECL ausgestattet
    von , , , , Salzsäure, , , , , , , , 10600007 , , Lösung ist

    Referenzen

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    SDS-PAGE-AnalyseWestern BlottingHEK293-ZellenParkinson-ForschungKinase-AssayP-Tag-Systemendogenes Rab10
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