Methodenartikel

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

DOI:

10.3791/56761

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16. Juni 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Einem Tiermodell wird benötigt, um die Rolle der zirkulierende Tumorzellen (CTC) bei der Förderung der Lunge Kolonisation in Krebsmetastasen zu entschlüsseln. Hier wir etabliert und erfolgreich durchgeführt eine in Vivo assay, speziell Test das Erfordernis der Polymeren Fibronektin (PolyFN) Montage auf CTCs zur Besiedlung der Lunge.

Zusammenfassung

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Metastasierung ist die Hauptursache für Tod durch Krebs. Die Rolle der zirkulierende Tumorzellen (CTC) bei der Förderung der Krebsmetastasen in der Lunge Besiedlung durch CTCs kritisch zu frühen Lunge metastasierendem Prozesse, trägt ist kräftig untersucht worden. Als solche sind Tiermodelle der einzige Ansatz, der die vollständige systemischen Prozess der Metastasierung erfasst. Angesichts der Tatsache, dass Probleme in früheren experimentellen Designs für die Prüfung der Beiträge von CTCs, Blutgefäß Extravasation auftreten, wir etabliert einen in Vivo Lunge Kolonisation Assay in denen ein long-term-Fluoreszenz Zelle-Tracer, Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-), wurde verwendet, um abgehängte Tumorzellen zu beschriften und Perfusion der Lunge wurde durchgeführt, um unspezifisch eingeschlossene CTCs vor der Lunge entfernen, konfokale Bildgebung und Quantifizierung zu löschen. Polymeren Fibronektin (PolyFN) montiert auf CTC Oberflächen hat sich herausgestellt, um Lunge Kolonisation in die endgültige Etablierung des metastasierten Tumorgewebe zu vermitteln. Hier, um die Anforderung der PolyFN Montage auf CTCs Lunge Kolonisation und Extravasation speziell zu testen, wir führten kurzfristig Lunge Kolonisation Assays in denen ausgesetzt Lewis Karzinom Lungenzellen (LLC) mit dem stabil Ausdruck FN-ShRNA (ShFN) oder Scramble-ShRNA (ShScr) und Pre-beschriftet mit 20 μM CFSE wurden intravenös in C57BL/6 Mäusen geimpft. Wir bewiesen erfolgreich, dass die Fähigkeiten von ShFN LLC Zellen der Maus-Lunge besiedeln im Vergleich zu ShScr LLC Zellen erheblich vermindert wurden. Daher kann diese kurzfristige Methode weit angewendet werden, um speziell die Fähigkeit der CTC innerhalb der Zirkulation um die Lunge zu kolonisieren zu demonstrieren.

Einleitung

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Metastasierung ist die Hauptursache von Krebs Tod1,2. Abgeleitet von primären Gewebe Tumorzellen geben Sie die Zirkulation in der Schwebe und verschiedenen Hämatogene Herausforderungen, z. B.Anoikis, immun Angriffe und Schäden, die durch Scherbeanspruchung von Blutdruck oder geometrische Abhängigkeiten zu überleben, bevor sie sind in der Lage, entfernte Organe besiedeln ein Schlüsselschritt diktieren den Erfolg von Metastasen3,4,5,6. Daher wurden große Anstrengungen Unterneh....

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Protokoll

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Alle Experimente an Mäusen wurden nach den Richtlinien unseres Instituts (das Handbuch für Pflege und Verwendung von Labortieren, NCKU Medical College) durchgeführt.

1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte

  1. Vor dem Start der experimentelle Protokolle erhalten steriles chirurgisches Nahtmaterial, 1 mL Spritzen mit 26G/0,5 cm Nadel (Injektionslösung Schweif Vene), 3 mL Spritzen mit 24G/3 cm Nadel (für Lunge Perfusion), Dulbeccos geändert Eagle Media (DMEM), Trypsin-EDTA-Lösung (5 g/L Trypsin und 0,53 mM), fetale bovine Serum (FBS), 1 X PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PHO4und 1,8 mM KH....

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Ergebnisse

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Vor der Durchführung der in Vivo Lunge Kolonisation Assay titriert wie abgebildet in Figur 1A zu testen, ob PolyFN auf abgehängte Tumorzellen Lunge Kolonisation und/oder Paravasation bei der Erleichterung der Metastasierung, vermittelt wir zunächst verschiedene Konzentrationen von CFSE, eine fluoreszierende Substanz, die Zelle durchlässig ist und kovalent Konjugate intrazellulären Amin-haltige Moleküle26,

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Diskussion

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Zusammen mit lange Begriff Lunge Kolonisation Assays, die kurzfristig Methodik, die wir hier in Vivo Lunge Besiedlung durch CTCs in entfernten Organen auszuwertende beschäftigt klar enthüllt und differenziert die spezifische Rolle der PolyFN an der Kolonisierung auf CTCs montiert die Lunge, führte dann zu der Extravasation und metastatische Prozesse18,19,20,21. Obwohl Kennzeichnung Zel.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Autoren möchte Dr. Ming-Min Chang und Frau Ya-Hsin Cheng für ihre technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie Taiwans (die meisten-103-2325-B-006-009, die meisten-104-2325-B-006-001, die meisten-105-2325-B-006-001 und MOST-106-2320-B-006-068-MY3) und das Ministerium für Gesundheit und Soziales (MOHW106-TDU-B-211-144004). Wir sind auch dankbar für die Unterstützung von Core Research Laboratory des College of Medicine, National Cheng Kung University, für ihre Multi-Photonen confocal Mikroskop.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Material
Rinderserumalbumin ( BSA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-9048-46-8
Bouin's FluidMCC (Medical Chemical Corporation)/POISON456-A-1GL
CFSE Proliferation Dyeebiosciences65-0850-85Vollständiger Name: Carboxyfluorescein-Succinimidylester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) (Gibco)ThermoFisher Scientific12100-061
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Cyrusbioscience (Taipeh, Taiwan)101-6381-92-6Für zubereitete Trypsin-EDTA-Lösung (Endkonzentration: 0,53 mM)
Fötales Rinderserum (FBS)(Gibco)ThermoFisher Scientific10437-028
Lewis-Lungenkarzinom (LLC)ATCC, Manassas, VA, USACRL-1642
L-Glutamin, USP (Gibco)ThermoFisher Scientific21051-024
Kaliumchlorid (KCl)Cyrusbioscience (Taipeh, Taiwan)101-7447-40-7Für zubereitetes 1X PBS (Endkonzentration: 2,7 mM)
Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)Cyrusbioscience (Taipeh, Taiwan)101-7778-77-0Für zubereitetes 1X PBS (Endkonzentration: 1,8 mM)
Natrium Chlorid (NaCl)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7647-14-5Für zubereitetes 1X PBS (Endkonzentration: 137mM)
Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-10039-32-4Für zubereitetes 1X PBS (Endkonzentration: 10mM)
Trypan BlueSigma AldrichT61460,5 g mischen mit 100 mL 1X PBS
TrypsinSigma AldrichT4799Für zubereitete Trypsin-EDTA-Lösung (Endkonzentration: 5 g/L)
Zoletil 50VirbacZur Verdünnung mit 1X PBS 
Name<>UnternehmenKatalognummer<strong>Kommentare
Ausrüstung
Kompakte Tischzentrifuge 2420KUBOTA Co.2420
Kulturschale (6cm)Wuxi NEST Biotechnologie Co.
Einwegspritze (mit Nadel)Perfect Medical Industry Co.24G/3 cm; 3 ml & 26G/0,5 cm; 1 ml
End-over-End-MischerC.T.I YOUNG CHENNTS-20Für die Wiederherstellung suspendierter Zellen 
FACSCalibur (FACS)BD biosciences
PinzetteDimeda10.102.14
Forma Direct Heat CO2 InkubatorThermo Fisher Scientific Inc.HEPA CLASS 100
Maus-Restrainer (Zylindrischer Restrainer 15-30 g)Stoelting51338
Konfokales Multiphotonenmikroskop BX61WIOlympusFV1000MPE
Neubauer ZählkammerMarienfeld-Superior640010
Chirurgische SchereDimeda08.370.11
Chirurgisches Nahtmaterial UNIK CHIRURGISCHES NÄHTMATERIAL MFG. CO.NO. 0034Schwarz Geflochtene Seide; nicht resorbierbar (25YD; U.S.P. 4/0)
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenWuxi NEST Biotechnology Co.
15 mL Greiner TubeGreiner bio-one188271
705001615001

Referenzen

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  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K.

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Schlagwörter

Zirkulierende TumorzellenCFSE MarkierungLungenperfusionKonfokalmikroskopieFibronectin AssemblierungLewis Lungenkarzinomintraven se InokulationC57BL 6 M useFluoreszenzbildgebung

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