Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Metastasierung ist die Hauptursache von Krebs Tod^1,2. Abgeleitet von primären Gewebe Tumorzellen geben Sie die Zirkulation in der Schwebe und verschiedenen Hämatogene Herausforderungen, z. B.Anoikis, immun Angriffe und Schäden, die durch Scherbeanspruchung von Blutdruck oder geometrische Abhängigkeiten zu überleben, bevor sie sind in der Lage, entfernte Organe besiedeln ein Schlüsselschritt diktieren den Erfolg von Metastasen^3,4,5,6. Daher wurden große Anstrengungen Unternehmen derzeit vorgenommen in Charakterisierung zirkulierende Tumorzellen (CTC) und korrelieren diese Eigenschaften mit malignen Tumor, Metastasen und Überlebensraten von Krebs Patienten^{7,8 , 9}. da der Prozess der Krebsmetastasen speziell ein Ereignis in Vivo zeigt, Tiermodelle sind der einzige Ansatz, der die vollständige systemischen Prozess der Metastasierung^{10,11,12 erfasst} .

CTC werden metastasiertem Tumorgewebe durch mehrere zelluläre Ereignisse, einschließlich der Besiedlung von entfernten Organen^1,2. Jedoch bieten die am häufigsten verwendeten Metastasierung Assays^13,14,15 keine Möglichkeit, CTC Besiedlung des entfernten Organen zu beobachten. Eine in-Vivo -Assay-Design für CTC Kolonisation Visualisierung ist daher dringend erforderlich. Obwohl mehrere in Vivo und ex Vivo kurze bleiben Begriff Lunge Kolonisation Assays wurden entwickelt, Probleme und Nachteile. Zum Beispiel zwar grüne Fluoreszenz-Protein (GFP)-überexprimierenden Zellen in diesen werden Tumor Proben^22,23, es braucht Zeit, stabil transfizieren und Tumorzellen mit ausreichender GFP Fluoreszenz-Intensität unter Klonen Das Mikroskop. In ähnlicher Weise zwar vorübergehende Verfärbung von Tumorzellen mit dem langfristigen Zelle Tracer CFSE-beschäftigt war, die GFP exprimierenden Tumorzellen zu ersetzen, es bleibt schwer zu beurteilen, ob die mit der Bezeichnung von CFSE-Tumorzellen angebracht sind oder nur vorhanden in der Gefäßsystem der ausgeschnittenen entfernte Organe^16,17.

Polymeren Fibronektin (PolyFN) montiert auf Oberflächen von CTCs wurde gefunden, um kritisch dazu beitragen, die endgültige Etablierung des metastasierten Tumor Gewebe^{18,19,20,21,22} . Hier führten wir kurzfristig Lunge Kolonisation Assays in die abgehängten Lewis Karzinom Lungenzellen (LLC) stabil FN-ShRNA (ShFN) oder Scramble-ShRNA (ShScr) zum Ausdruck bringen und vorher beschriftet mit CFSE intravenös in C57BL/6 Mäusen geimpft wurden. Nach 2-3 Tagen waren Maus Lungen zuerst mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) völlig ungebunden CTCs in das Gefäßsystem entfernen, bevor ausgesetzt konfokalen Mikroskopie und Quantifizierung der Lunge besiedeln LLCs durchblutet. Wir zeigten deutlich, dass die Zahl der Lunge besiedeln ShFN LLC und Tumor Knötchen im Vergleich zu ShScr LLC, im Wesentlichen die Rolle der PolyFN Versammlung auf CTCs bei der Erleichterung der Kolonisation und des Wachstums von CTCs im erhärten deutlich reduziert wurden die lungen. Unsere Studie rechtfertigt weitere Untersuchung für die Rolle des PolyFN in Krebsmetastasen.

Alle Experimente an Mäusen wurden nach den Richtlinien unseres Instituts (das Handbuch für Pflege und Verwendung von Labortieren, NCKU Medical College) durchgeführt.

1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte

1. Vor dem Start der experimentelle Protokolle erhalten steriles chirurgisches Nahtmaterial, 1 mL Spritzen mit 26G/0,5 cm Nadel (Injektionslösung Schweif Vene), 3 mL Spritzen mit 24G/3 cm Nadel (für Lunge Perfusion), Dulbeccos geändert Eagle Media (DMEM), Trypsin-EDTA-Lösung (5 g/L Trypsin und 0,53 mM), fetale bovine Serum (FBS), 1 X PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂PHO₄und 1,8 mM KH₂PO₄) und 6 cm Kultur Gerichte.

2. Vorbereitung und Rückgewinnung von Tumorzellen in der Schwebe

1. Bereiten Sie sterile Dulbecco geändert Eagle Media (DMEM) mit 10 % oder 20 % FBS und frisch fügen 2 mM L-Glutamin, 1 X PBS und 0,05 % Trypsin-EDTA.
2. Kultur der Zellen in DMEM mit 10 % ergänzt FBS bei 37 ° C und sie wachsen, bis gibt es 70-80 % Zusammenfluss in der Kulturschale.
3. Die Gerichte, gefolgt von zwei Wäschen mit 2 mL sterilen 1 X PBS entnehmen Sie Nährmedien (DMEM).
4. Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA in den Gerichten um die Zellen gründlich zu decken. Entfernen Sie 800 μl Lösung sofort und verlassen Sie nur 200 μL in den Gerichten. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C für 30 s, 1 min (je nach Zelltyp) und warten Sie, bis der Großteil der Zellen im angehaltenen Zustand sind.
5. Fügen Sie 1 mL frische DMEM mit 10 % FBS direkt in die Gerichte, die enzymatische Aktivität von Trypsin und energisch zu stoppen pipette die Zellsuspension nach oben und unten mit einer 1000 µL Pipette, einen einzigen Zellsuspension vorzubereiten.
6. Übertragen Sie die Zellen aus der Schale zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und spin-down der Zellen bei Raumtemperatur bei 162 X g 3 Minuten lang.
7. Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Tumorzellen in 1,5 mL DMEM mit 20 % FBS und Endverbraucher über die Zellen in der Suspension bei 37 ° C für 2 h drehen.
   Hinweis: Wenn das Medium während der Wiederherstellung gelb dargestellt wird, tauschen Sie das alte Medium mit frisches Medium mit 20 % FBS.

(3) Fluoreszenz-Färbung und Analyse von Tumorzellen in der Schwebe mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-)

1. Nach der Wiederherstellung der Zelle in der Schwebe zählen die entsprechenden lebensfähigen Zelle Zahlen mit Trypan blau in eine Kammer für die Fluoreszenz Färbung Dosen titrieren zählen Neubauer und für Tail Ader Injektion.
2. Spin-down der Zellen bei 162 X g bei Raumtemperatur für 3 min und Aufschwemmen der gebeizte Zellen in 1 mL 1 X PBS, gefolgt von Raumtemperatur Zentrifugation bei 162 X g 3 min sterilisiert.
3. Aufschwemmen gebeizte Zellen in 500 µL 1 X PBS mit 10 % FBS und 0, 5, 10, 20 oder 40 µM CFSE für dosistitration, und die Zellsuspension auf 37 ^oC für 10 Minuten im Dunkeln inkubieren.
4. Spin-down der Zellen bei 162 X g bei Raumtemperatur 3 min und Aufschwemmen der gebeizte Zellen mit 4 mL DMEM mit 1 % FBS. Wiederholen Sie diese Waschschritt noch dreimal. Die gebeizte Zellen mit 4 mL DMEM allein für die letzte Wäsche aufzuwirbeln.
5. CFSE--markierte Zellen zur Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Analyse zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität aus einer einzigen Zelle zu unterziehen, oder tail Vene Injektion.
   Hinweis: Halten Sie die Zellen auf dem Eis vor der Durchführung der FACS Analyse oder Endstück Vene Spritzen.

(4) Lunge Kolonisation Assay

1. Bereiten Sie die Zellen mit 20 µM CFSE beschriftet (siehe Schritte 3.1 bis 3.4).
   Hinweis: Entscheiden die Arbeiten Dosis von CFSE-zur Kennzeichnung von Tumorzellen, basierend auf den Ergebnissen der Titration der FACS-Analyse (siehe Schritt 3.3).
2. Wärmen Sie den Schwänzen von 4-6 Wochen-alten männlichen C57BL/6 Mäusen (6 Mäuse) mit einer Halogenid-Lampe für ca. 5-10 min auf Basis von Maus zu Maus, Maus Schweif Venen erweitern.
3. Gründlich mischen und mit der Bezeichnung von CFSE-Tumorzellen mit einer 1 mL (26Gx1/2)-Spritze, Vermeidung von Bläschen in der Zellsuspension (mit einer endgültigen Zelldichte von 5 x 10⁶ Zellen/mL) Aspirieren.
4. Sorgfältig zu injizieren 1 X10⁶ CFSE--Label Tumorzellen in 200 µL DMEM in die Maus Schweif Vene, die in eine Maus Restrainer eingereicht werden sollte.
   Hinweis: Während der Injektion, wenn die Nadel direkt in das Lumen der Schweif Vene befindet sollte Tumorzellen leicht in den Blutkreislauf geliefert werden ohne Druck auf die Spritze. Ist es schwer, die Tumorzellen durch drücken, haben sie höchstwahrscheinlich in den subkutanen Raum außerhalb der Schweif Vene injiziert.
5. Die Mäuse, die intravenös die CFSE-beschriftet Tumorzellen in zwei Gruppen erhalten unterteilen: eine Gruppe durchläuft Perfusion der Lunge gefolgt von konfokalen Mikroskopie und ImageJ Quantifizierung in der Lunge Kolonisation Assay und der andere bleibt allein für 4-5 Wochen in der langfristig Lunge Kolonisation assay.
6. Betäuben Sie bei 20, 38 oder 45 h und 1 x 10⁶ Tumorzellen intravenös injiziert, während einer Zeit Kurs und dosisabhängige Titration Tumor-tragenden Mäusen mit 50-75 mg/kg Zoletil 50, ist ein gut angenommen und ordnungsgemäße Anesthetizer²³.
   Hinweis: Verwendung Tierarzt Salbe auf die Mäuse Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
7. Längs geschnitten Sie der Haut und subkutanen Gewebe aus dem Bauch, der Brustbereich mit Chirurgische Schere. Öffnen Sie den pleuralen Raum mit chirurgische Scheren und Pinzetten, Herz und Lunge voll verfügbar zu machen.
   Hinweis: Seien Sie vorsichtig Abschneiden Blutgefäße zu vermeiden.
8. Binden Sie die überlegene Vena Cava (SVC) und unteren Hohlvene (IVC) mit sterilem chirurgischem Nahtmaterial, den Rückfluss der Perfusion Lösung während der Perfusion der Lunge zu verhindern.
9. Schneiden Sie die Wand des linken Ventrikels mit chirurgische Scheren, einen Riss (ca. 2-4 mm) um die Perfusion Lösung aus den Lungen entleeren zu öffnen.
10. Injizieren Sie 1 X PBS in die Rechte Herzkammer mit einer 3 mL Spritze und entfernen Sie die Abgetropfte Lösung mit konstanter Absaugung während der Perfusion der Lunge zu, bis die Lunge von einem rötlichen Farbe völlig blass zuwenden.

5. konfokale mikroskopische Bildgebung und Analyse der Lunge kolonisiert Tumorzellen

1. Entfernen Sie die Lunge jetzt blass aus der Pleurahöhle und trennen Sie die fünf Lappen durch die Luftröhre und Bindegewebe Bänder mit chirurgische Scheren und Pinzetten²⁴wegschneiden.
2. Bereiten Sie einen Keilrahmen-wie Lunge Halter wie in Abbildung 3 b dargestellt durch eine Nylon-Naht wickeln um zwei Metallstangen, netzartig Textur mit einem Leerzeichen zwischen den beiden Stangen für die Platzierung der Lungenlappen zu produzieren. Die Lunge-Halter in einer Petrischale 6 cm eingestellt.
   Hinweis: Die Lunge Halter wird eingesetzt werden, die Lungenlappen unterhalb der Objektivlinse eines Konfokalen Mikroskops zu stabilisieren.
3. Einlegen Sie und fixieren Sie die Lungenlappen auf die netzartig Textur des Inhabers Lunge. Decken Sie und befeuchten Sie die Lungenlappen mit 1 X PBS.
4. Thema der 6-cm-Kulturschale beherbergen die Lungenlappen auf die Lunge Inhaber konfokalen Mikroskopie Fluoreszenzbilder Aufnahme der Lunge besiedeln Tumorzellen zu erfassen.
5. Verwenden Sie für die Bildgebung, Objektive (5 X, MPLN, NA: 0.1, WD: 20, Luft).
6. Drehen Sie das Filterrad, NIBA (Anregung/Emission; 470-495 nm/510-550 nm) und mit 488 nm Laser um CFSE deutlich zu visualisieren, Bilder von Fluoreszenz-Punkte in die Lungenlappen zu begeistern.
7. Drehen Sie das Filterrad, R690 (für MaiTai HP InterSystems Laser) mit 2.0 Scan µs/Pixel Scannen beschleunigen und optimieren die HV, Gain und Offset Ebenen.
8. Fluoreszenzbilder (512 x 512 Pixel) zu erfassen, mithilfe der Mikroskop-Software mit einer 10 µs/Pixel Scan-Geschwindigkeit.
9. Quantifizieren Sie und analysieren Sie statistisch die mikroskopischen Aufnahmen mit ImageJ und GraphPad Software als zuvor beschriebenen²¹.

(6) langfristig Lunge Kolonisation assays

Hinweis: Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.5.

1. Opfern Sie die Mäuse nach Tumor Zelle Inokulation für 4-5 Wochen zu und fixieren Sie ihre Lungen mit Bouins Fluid²⁵ für 1 bis 2 Tage.
2. Quantifizieren Sie und analysieren Sie statistisch die Knötchen Tumor aus der Lunge von Mäusen mit Software²¹.

Vor der Durchführung der in Vivo Lunge Kolonisation Assay titriert wie abgebildet in Figur 1A zu testen, ob PolyFN auf abgehängte Tumorzellen Lunge Kolonisation und/oder Paravasation bei der Erleichterung der Metastasierung, vermittelt wir zunächst verschiedene Konzentrationen von CFSE, eine fluoreszierende Substanz, die Zelle durchlässig ist und kovalent Konjugate intrazellulären Amin-haltige Moleküle26,27 in abgehängten Tumorzellen und bleibt in den Zellen für längere Zeit. Wir fanden diesen Tumor Zellen effektiv in einer Dosis-abhängigen Weise, wie in dargestellt Abbildung 1 bmit CFSE beschriftet wurden. Die CFSE--Kennzeichnung in 6 X105 LLC Zellen/mL fast ein Plateau bei 20 µM als erreicht in Abbildung 1dargestellt.

Aufgrund der reichlich verengten Kapillarsystem, welche physisch die CTCs in das Gefäßsystem der Lunge hemmen könnte, führten wir Perfusion bei Mäusen mit intravenös injiziert mit der Bezeichnung von CFSE-LLC Lungenzellen um unspezifisch eingeschlossene CTCs als löschen vor dem Entfernen der Lunge zu jedem Zeitpunkt wie in Abbildung 4dargestellt dargestellt in Abbildung 1A . Vor Perfusion, die Lungen waren deutlich rötlich aufgrund des Vorhandenseins von Blut, wie in der linken Abbildung 2. Die Lunge wurde blass nach Perfusion mit 10-15 mL 1 X PBS, wie in der rechten Abbildung 2dargestellt.

Unmittelbar nach der PERFUNDIERTEN Maus-Lunge aus der Pleuraraum entfernt wurden, waren die Lungenlappen getrennt und auf die Lunge Halter platziert in Gerichten wie in Abbildung 3A mit 1 X PBS gründlich über die Lungenlappen montiert. Die Lungenlappen, montiert auf der Lunge-Halter wie in Bild 3 b illustriert wurden konfokale Fluoreszenzmikroskopie wie in Abbildung 3Aunterzogen. Besiedeln die Lungen mit der Bezeichnung von CFSE-Tumorzellen wurden abgebildet, wie in der oberen Bereich der Abbildung 3 und verwandelte sich in schwarz-weiß-Bildern, wie in der unteren Bereich des Abbildung 3 , die Quantifizierung der Besiedlung der Lunge mit Bild J Software zu erleichtern.

Intravenös injiziert wir entweder ShScr oder ShFN LLC-Zellen, die mit 20 µM CFSE beschriftet waren und wartete auf einen zeitlichen Verlauf von 24-72 h vor Durchführung der Lunge Perfusionen und konfokale mikroskopische Bildgebung. Quantifizierung des Tumors Lunge besiedeln, die Zellen in 6 Mäuse wie abgebildet in Figur 4A mit ImageJ Software ergeben, dass deutlich weniger ShFN LLC Zellen als ShScr LLC Zellen an der 38 h und 45 h Zeitpunkten als gezählt wurden in illustriert Abbildung 4 b . Der Grund, warum die Zahl der Lunge-kolonisierten ShScr und ShFN LLC Zellen allmählich vermindert sehr wahrscheinlich wegen der kontinuierlichen Zytotoxizität durch die Zirkulation Immunität auch gegen die bereits kolonisierten LLC Zellen ausgeübt wurde. Insgesamt, diese Ergebnisse deuten darauf hin, PolyFN, montiert auf CTCs ist in der Tat erforderlich, in der Lunge Besiedlung durch LLC Zellen, führt zu kompletten Metastasen in der Lunge durch die Ergebnisse in welcher einige Mäuse intravenös erhalten Aliquote der Vermittlung der CFSE--mit der Bezeichnung ShScr und ShFN LLC Zellen für die Lunge Kolonisation Assays wie in Abbildung 4 dargestellt blieben Aloneuntil Lungentumor Knötchen in der experimentellen Tumor Metastasen Assay entwickelt wurden, wie in Abbildung 5A und 5 b.

Abbildung 1: Titration von CFSE-Konzentrationen für die Kennzeichnung von Tumorzellen in die Lunge Kolonisation Assay. (A) schematische Darstellung der Verfahren für die Lunge Kolonisation Assay und der experimentelle Metastasierung Test wie beschrieben im Abschnitt Protokolle. (B) FACS-Analyse für die CFSE--Fluoreszenz-Intensitäten der LLC-Zellen, die befleckt wurden mit verschiedenen Konzentrationen von CFSE. (C) Fluoreszenz-Intensitäten wurden als Funktionen der verschiedenen CFSE-Konzentrationen aufgetragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Lunge vor und nach der Perfusion. Repräsentative Bilder der Lungen vor (unperfused; Unperf.) und nachher (durchblutet; Perf.) Perfusion der Lunge durchführen. Goldener Stern: Herz. Weißer Pfeil: das Band, das die IVC/SVC geschlossen. Rote Pfeile: die Lunge der gleichen Maus vor und nach der Perfusion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Montage der PERFUNDIERTEN Lungenlappen auf der Lunge-Halter für konfokale Fluoreszenzmikroskopie. (A) Regelung der Lunge-Montage auf der Lunge-Halter für die konfokale Mikroskopie. (B) ein repräsentatives Bild der 3 PERFUNDIERTEN Lungenlappen auf der Lunge-Halter. (C) repräsentative Bilder der Lunge besiedeln LLC Zellen mit CFSE-Fluoreszenz für die Quantifizierung von Bild J Software. Obere Leiste: regelmäßige Bildgebung. Untere Leiste: umgekehrt schwarz-weiß-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Zeit Kurs Bildgebung, Quantifizierung und statistische Auswertung für die Lunge kolonisiert ShScr und ShFN LLC-Zellen nach Perfusion der Lunge in die Lunge Kolonisation Assay. (A) repräsentative Schwarzweißbilder (umgerechnet aus Fluoreszenzbilder) von ShScr und ShFN LLC-Zellen, die in das Gefäßsystem der Lunge zu verschiedenen Zeitpunkten kolonisiert wurden, wie nach umfangreichen Lunge Perfusion dargestellt. Gestrichelten Linien kennzeichnen den Rand der Bereiche im Fokus konfokale Lunge Gewebe. (B) Quantifizierung und statistische Auswertung für die Lunge besiedeln LLC Zellen wie in (A) von durchschnittlich 5 absolute repräsentative Bilder/Lunge Lappen/Maus visualisiert. Hinweis: Jeder Balken zeigt die gemittelten Fluoreszenzintensität von jedem konfokale in-Focus-Bereich. Daten wurden statistisch analysiert aus 6 Mäuse und Fertigmeldung ± SD bedeuten; n.s. bedeutet unwichtigen; * bedeutet p < 0,05; und ** bedeutet p < 0,01; Zwei-Wege-ANOVA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Silencing FN-Expression in Zellen mit der Bezeichnung von CFSE-LLC Tumor Knötchen in der Lunge verringert sich auf lange Sicht in Vivo CTC Kolonisation Assay. (A) Bouin Flüssigkeit-feste Maus Lungen mit Tumor Knötchen aus CFSE--mit der Bezeichnung ShScr oder ShFN LLC Zellen abgeleitet. (B) Quantifizierung und statistische Auswertung für die Tumor-Knötchen in der Lunge. Daten werden als ± SD bedeuten gemeldet; : p < 0,001; n = 6 pro Gruppe; Ungepaarten t-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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