Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Zerebrale Organellen repräsentieren eine neue Modellsystem, frühe menschliche Gehirn Entwicklung in Vitrozu untersuchen. Dieser Artikel enthält die detaillierte Methodik um homogene dorsalen Vorderhirn-Typ Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen einschließlich kritische Charakterisierung und Validierung Schritte effizient zu generieren.

Zusammenfassung

Der menschlichen Hirnrinde ist stark erweitert und weist eine komplexe Struktur mit bestimmten Funktionsbereichen, Bereitstellung von höheren Gehirnfunktion, wie Kognition. Anstrengungen zur Entwicklung der menschlichen Hirnrinde studieren haben durch die Verfügbarkeit von Modellsystemen begrenzt. Ergebnisse von Nagetier Studien der menschlichen System zu übersetzen durch Artenunterschiede eingeschränkt ist und Studien über menschliche primäre Gewebe werden durch einen Mangel an Gewebe Verfügbarkeit sowie ethische Bedenken behindert. Aktuelle Entwicklung im menschlichen pluripotenten Stammzellen (PSC) Technologie beinhalten die Generation der dreidimensionalen (3D) selbstorganisierende organotypischen Kultur Systeme, die zu einem bestimmten Ausmaß Mensch-spezifische Gehirn Entwicklung in Vitrozu imitieren. Derzeit stehen verschiedene Protokolle für die Erzeugung von entweder ganze Gehirn oder Gehirn-Region spezifische Organellen. Die Methode für die Generierung von homogenen und reproduzierbare Vorderhirn-Typ Organellen von induzierten PSC (iPSC), die wir bisher geschaffen und hier beschreiben, verbindet die intrinsische Fähigkeit des PSC, mit geführten Differenzierung gegenüber selbst zu organisieren, die vorderen Neuroectodermal Abstammung und Matrix einbetten, um die Bildung eines kontinuierlichen Neuroepithelium zu unterstützen. Genauer gesagt, dieses Protokoll umfasst: (1) die Generation der iPSC-Aggregate, einschließlich der Umstellung der iPSC Kolonien zu einer konfluierende Monolayer Kultur; (2) die Induktion der vorderen Neuroectoderm; (3) die Einbettung von Neuroectodermal Aggregate in einem Matrix-Gerüst; (4) die Generation des Vorderhirns-Typ Organellen von Neuroectodermal Aggregaten; und (5) die Fixierung und Validierung des Vorderhirns-Typ Organellen. Dieses Protokoll bietet ein leicht einsetzbares System zur Erzeugung von standardisierten und reproduzierbaren iPSC-abgeleitete kortikalen Gewebe Strukturen in Vitro.

Einleitung

Das menschliche Gehirn ist eindeutig eines der komplexesten Organe und ist verantwortlich für alle menschlichen intellektuellen Fähigkeiten. Somit ist ein tieferes Verständnis der Mensch-spezifische Gehirnentwicklung eine entscheidende Voraussetzung für das Verständnis der menschlichen kognitiven Fähigkeiten. Traditionell serviert transgene Tiere als Modellorganismen, die Entwicklung des Gehirns zu studieren. Diese Modelle zur Verfügung gestellt grundlegenden Einblick in die Prinzipien der Entwicklung des Gehirns. Wir wissen jetzt, dass ein gemeinsames Merkmal der Entwicklung des Gehirns bei allen Säugetieren eine präzise Choreografie der Stammvater Proliferation, Neurogenese und neuronalen Migration. Allerdings gibt es erhebliche strukturelle Unterschiede zwischen den Gehirnen von Modellorganismen wie Nagern und Menschen, vor allem in der Großhirnrinde. Die wichtigsten Mechanismen, die vorgeschlagen wurden, zu Primaten kortikalen Entwicklung beitragen sind eine erhöhte Proliferation von Stamm-und Vorläuferzellen sowie die Erzeugung von äußeren radialen Glia-Zellen (oRGCs), die nur sehr selten bei Nagetieren^{1 gefunden ,2,3}.

Methoden der menschlichen Hirnrinde Modellentwicklung zählen die Generation der PSC abgeleitet Teleenzephalischer Vorläuferzellen und Großhirnrinde Projektion Neuronen als Monolayer-Kulturen. Diese Differenzierung standardisierte Protokolle Abspielen bestimmter Aspekte der menschlichen kortikalen Entwicklung wie die stereotype zeitliche Reihenfolge der kortikalen Neurogenese⁴. Sie fallen jedoch kurz, wenn es darum geht, die Reprise von Entwicklungsprozessen der Organogenese wie räumliche Musterbildung und Morphogenese. Neuere Entwicklungen in der Stammzellbiologie führte zur Gründung von 3D organoide Kulturen von EAP, die die Erforschung von in-Vitro menschliche Organogenese revolutioniert werden. Mit Hilfe der Handlungsfähigkeit der einheitlichen Ansprechpartner in organotypischen Strukturen selbst zu organisieren, wurden verschiedene Organellen, die wichtige strukturelle und funktionelle Eigenschaften der Organe einschließlich der Nieren, Darm, das Auge und Gehirn reflektieren etablierte⁵. Solche Organellen enthalten mehrere Organ-spezifische zelluläre Untertypen, die Gruppe zusammen und organisieren räumlich sehr ähnlich wie die entwickelnden Organe in Vivo^5,6. Darüber hinaus ergab Zelle Komposition, Linie Beziehung und gen Netzstudien mit einzelligen RNA Sequenzierung, dass menschliche zerebrale Organellen treu wesentliche Aspekte der Entwicklung der menschlichen fetalen Neokortex wie Ausdruck Genprogramme rekapitulieren ^{7 , 8}. einen großer Nachteil, die ihre breite Anwendung bisher verhindert, war jedoch der große Variationen von Charge zu Charge und organoide-organoide Heterogenität⁹.

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für eine einfache und standardisierte Vorderhirn-Typ organoide Kultursystem. Das zentrale Merkmal dieses Systems ist, dass es effizient und reproduzierbar PSC-abgeleitete Organellen der nahezu ausschließlichen dorsalen Teleenzephalischer Identität erzeugt. Das Protokoll basiert auf den Methoden unserer jüngsten Cell Reports Papier¹⁰. Es verbindet die Selbstorganisation Kapazität des iPSCs mit selektiven Induktion der kortikalen Neuroepithelium und erzeugen robust homogenere Kulturen der frühen dorsalen Teleenzephalischer Gewebe innerhalb von 3 Wochen. Das Protokoll baut auf den bereits gemeldeten SMAD Signalisierung und Wnt-Hemmung-Strategie, die die Differenzierung des PSC in Richtung der vorderen Neuroectodermal Linie^11,12 in Kombination mit einbetten, die Matrix führt fördert die Bildung von großen und kontinuierliche neuroepithelialer Strukturen¹³. Wir haben erfolgreich das beschriebene Verfahren auf verschiedenen iPSC-Linien, mit mehreren Klonen pro Person verwendet. Wir haben gezeigt, dass dieses System in der Reproduzierbarkeit und Homogenität von großer Bedeutung wie Krankheit Modellierung sind für downstream-Anwendungen geeignet ist. Bei der Umsetzung des Protokolls zu iPSCs von Patienten mit einer schweren kortikalen Fehlbildung abgeleitet, konnten wir um pathologische Kennzeichen der Krankheit in Vitro zu rekapitulieren und neue molekulare Mechanismen, die die phänotypische identifizieren ¹⁰ändert. Wir empfehlen, dass die beschriebenen organoide Protokoll genutzt werden kann, dass die Lücke zwischen reduktionistischen PSC abgeleitet kortikalen Monolayer-Kulturen und in Vivo Studien und es steht für eine zuverlässige und stabile zellbasierte Modellsystem, früh zu simulieren kortikale Bildungsforschung in Gesundheit und Krankheit außerhalb des menschlichen Körpers.

Protokoll

1. Generation der iPSC-Aggregate

1. Generation von einzelligen Monolayer-Kulturen aus iPSC Kolonien
   1. Bereiten Sie eine Basalmembran Extrakt (BME) beschichtet 6-Well-Platte. Tauen Sie BME auf Eis bei 4 ° C für ca. 2-3 h, verdünnen Sie es mit kalten Dulbecco geändert Eagle Medium F12 (DMEM-F12; 01:50 Verdünnung), Abdeckplatte mit 1 mL/gut von der BME-Lösung verdünnt und die Platte über Nacht bei 4 ° c lagern
   2. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie intakt iPSC Kolonien von mindestens 2 Brunnen von einem 6-Well-Platte mit 0,5 mM EDTA in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zweimal, bevor Sie ausbrüten Kolonien mit 0,5 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) mit PBS-Puffer für 4 min bei Raumtemperatur (RT). Aspirieren Sie EDTA Lösung und lösen Sie sanft die Kolonien durch Waschen sie aus dem Boden der Schale mit 5 mL DMEM-F12 Medium. Sammeln sie in einem 15-mL-Tube und pellet sie durch Zentrifugieren (4 min bei 1.200 X g bei RT).
      Hinweis: iPSCs aus handelsüblichen Fibroblasten umprogrammiert wurde erfolgreich verwendete¹⁰.
   3. Den Überstand abgesaugt und die iPSC-Kolonien mit 500 µL der Zelle-Dissoziation Reagenz für 6 min bei 37 ° c inkubieren
   4. Pipettieren der Zellsuspension mehrmals sanft nach oben und unten mit einer 1-mL-Pipette, verbleibenden Zellcluster in Einzelzellen zu brechen.
   5. Die Zellsuspension zu verdünnen, die Zelle-Dissoziation-Reagenz fügen Sie 4 mL DMEM-F12 hinzu.
   6. Drehen Sie die Zellen nach unten bei 1.200 X g für 4 min bei RT
   7. Aufschwemmen der Zellen in 2 mL iPSC Medium ergänzt mit 5 µM Y-27632 und Samen Zellen in einem Brunnen der BME beschichtet 6-Well Platte.
      Hinweis: Verwenden Sie das iPSC-Medium in der Tabelle der Materialien für eine einzelne Zelle Monolage iPSC Kulturen angegeben.
   8. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium mit frischen iPSC Medium fehlt Y-27632. Ab diesem Zeitpunkt weiterhin Kulturzellen, ändern des Mediums täglich bis iPSCs Zusammenfluss von 100 % sind. Abhängig von der Zell-Linie und die Konfluenz der Ausgangspunkt Brunnen dauert dies zwischen 2-4 Tage.
   9. Einmal konfluierende, Durchgang die iPSCs. Aspirieren Sie Medium und wenden Sie 500 µL der Zelle-Dissoziation Reagenz auf Zellen an.
   10. Inkubieren Sie die Zellen für 5-10 Minuten bei 37 ° c Schütteln Sie die Platte, um die Zellen zu lösen.
   11. Waschen Sie die Zellen aus dem Brunnen mit 2 mL DMEM-F12 und sammeln sie in einem 15-mL-Tube. Fügen Sie für ein Gesamtvolumen von 5 mL DMEM-F12.
   12. Spin-down der Zellen bei 1.200 X g für 4 min bei RT und den Überstand abgesaugt.
   13. Samen der Zellen in iPSC Medium ergänzt mit 5 µM beschichtet Y-27632 in einer 1:2 bis 1:4-Verhältnis auf eine BME 6-Well-Platte (2 mL/Well des Mediums).
   14. Weiterhin Kulturzellen für 2-5 Tage und iPSC Medium fehlt Y-27632 jeden Tag verändern. Einmal konfluierende, Durchgang iPSCs (Schritte 1.1.4-1.1.8).
       Hinweis: Kultur die iPSCs für mindestens 2 Passagen als eine Monolage iPSC Mittel-und vor der Verwendung für die Generation der iPSC-Aggregate, die Zellen zur Anpassung an die Kulturbedingungen können in der Tabelle der Materialien angegeben.
2. Verwenden Sie Monolage iPSC Kulturen, wenn sie 70-90 % Zusammenfluss für die Generation der iPSC-Aggregate sind.
   Hinweis: iPSC angepasst an die Kulturbedingungen als Einzelzellen weniger anfällig sind für betonen, dass führt zum Zelltod bei der Dissoziation und Aggregation. Monolage iPSC Kulturen müssen typische pluripotenten Morphologie ohne Anzeichen von Differenzierung anzeigen. Testen Sie die Kulturen auf einer regelmäßigen Basis für Mykoplasmen Kontamination. Arbeiten Sie nur mit Mykoplasmen-freien iPSC Kulturen.
   1. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus einem Brunnen von einem 6-Well-Platte und wenden Sie 500 µL der Zelle-Dissoziation Reagenz auf Zellen an.
   2. Inkubieren Sie die Zellen für 5-10 Minuten bei 37 ° c Schütteln Sie die Platte, um die Zellen zu lösen.
   3. Zellen aus dem Brunnen zu waschen mit 2 mL DMEM-F12 und sammeln sie in einem 15-mL-Tube. Fügen Sie DMEM-F12 für ein Gesamtvolumen von 10 mL.
   4. Nehmen Sie für die Zellzählung 25 µL aus der Zellsuspension und mischen Sie es mit 25 µL Trypan blau, um tote Zellen zu markieren. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einer Zählkammer.
   5. Sammle genügend Zellen (4.500 pro Aggregat iPSC) von der Zellsuspension in einer 15 mL Tube.
   6. Spin-down der Zellen bei 1.200 X g für 4 min bei RT und den Überstand abgesaugt.
   7. Aufschwemmen der Zellen in einem entsprechenden Volumen des iPSC Medium ergänzt mit 50 µM Y-27632, 4.500 lebenden Zellen pro 150 µL zu erhalten.
      Hinweis: Mit einer hohen Konzentration von Y-27632 (50 µM) ist entscheidend für das Überleben der iPSCs.
   8. Platte 150 µL in jedem gut von einem Low-Anlage 96-Well U-Boden-Platte und legen Sie sie in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂.
      Hinweis: Beim iPSC-Aggregate zu generieren, der Ansicht, dass mindestens 6 Organellen für die Qualitätskontrolle bei Tag 20 benötigt werden (siehe Abschnitt 5).

(2) Induktion der vorderen Neuroectoderm

1. Verfolgen Sie aufmerksam Änderungen der Morphologie der iPSC Aggregate jeden Tag unter der Gewebekultur-Mikroskop mit 4 X oder 10 X-Objektiv macht. Beobachten Sie am Tag 1, Zelle Aggregate mit klaren Grenzen. Kultur-iPSC-Aggregate im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂weiter.
   Hinweis: Eine bestimmte Anzahl von toten Zellen/gut ist normal und hat keine Auswirkungen auf organoide Generation.
2. Die iPSC-Aggregate ab Tag 2 und Weiterbildung mit jeden zweiten Tag durch sanft Absaugen etwa 2/3 des Mediums ohne zu stören die Zelle Aggregate am unteren zu ernähren. Fügen Sie eine zusätzliche 100 µL der iPSC Medium fehlt Y-27632.
   Hinweis: Innerhalb von 4-6 Tagen werden die Zelle-Aggregate werden 350-450 µm im Durchmesser und glatte Kanten aufweisen.
3. In diesem Stadium Aggregate Pool die Zelle mit einem Schnitt 100 µL Pipettenspitze in eine niedrig-Anlage 6 cm Schale (maximal 20 Aggregate/Gericht) in kortikalen Induktion DMEM-F12 mit N2-Ergänzung (1: 200), B27 Ergänzung (1: 100), Glukose (0,2 mg/mL), zyklische-haltigem medium Adenosin Monophosphate (cAMP; 0,15 µg/mL), 0,5 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 % L-Alanyl-L-Glutamin, Heparin (10 µg/mL) und die Verbindungen LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM), und Inhibitor der Wnt Antwort-1 (IWR-1) (10 µg/mL). Füttern Sie die Zelle Aggregate durch Ändern der kortikalen Induktion Medium 3 Tage nach der Übertragung auf die 6-cm-Schüssel.
4. Überwachen Sie eng morphologische Veränderungen im kortikalen Induktion unter der Gewebekultur-Mikroskop mit einem 4 X Power-Objektiv.
   Hinweis: Nach 4-5 Tagen in kortikalen Induktion Medium sollten die Kanten der Zelle Aggregate beginnen, an der Oberfläche zeigt Neuroectodermal Differenzierung zu erhellen. Zu diesem Zeitpunkt ergibt sich radial Organisation pseudostratified Epithel. Fahren Sie mit Abschnitt 3 der Zelle-Aggregate in einer BME-Matrix eingebettet.

3. Einbetten von Neuroectodermal Aggregate in einem Matrix-Gerüst

1. Tauen Sie BME auf Eis bei 4 ° C für ca. 2-3 h aliquoten unverdünnt BME in ausreichender Menge.
2. Bereiten Sie ein Kunststoff Paraffin-Film-Blatt für das Einbetten von Verfahren. Schnitt der Kunststoff Paraffin-Film mit steriler Schere in 4 x 4 cm große Stücke, legen Sie ein Stück des Kunststoffs paraffin Film über eine leere 100 µL Tipp Ablage für 100 µL Tipps, und drücken Sie mit einem behandschuhten Finger, so dass kleine Grübchen in den Kunststoff Paraffin Film Blatt (1 di erstellt werden Provinzialverwaltung/Zelle Aggregat benötigt). Den Kunststoff Paraffin-Film mit 70 % Ethanol zu reinigen und mit UV-Licht bestrahlen (Leistung: 15 Watt, Wellenlänge: 435 nm) unter der geschlossenen sterilen Bank für 30 min.
3. Übertragen Sie jedes Zellverbandes auf ein Grübchen der Kunststoff Paraffin Film Blatt mit einer 100 µL geschnittene Spitze mit 1,5-2 mm im Durchmesser. Im Fall, dass zwei Aggregate Zelle verschmolzen sind, trennen sie nicht aber sie zusammen in einem Grübchen übertragen.
4. Aspirieren Sie sanft das Medium umgibt die Zelle-Aggregate mit einem unbeschnittenen 100 µL Pipettenspitze.
   Hinweis: Achten Sie darauf, nicht die Zelle Aggregate in der Spitze zu saugen, da dadurch die Aggregate beschädigt wird.
5. Jede Zellverbandes 40 µL unverdünnte BME hinzufügen.
6. Jede Zelle in der Mitte der BME aggregierte drop mit einem unbeschnittenen 100 µL Pipettenspitze Stellung.
   Hinweis: Seien Sie sehr vorsichtig, nicht auf die Entwicklung Neuroepithelium mit der Pipettenspitze Schaden.
7. Sorgfältig die Kunststoff Paraffin Film Blatt mit sterilen Pinzette in einer 10 cm Petrischale (oder eine andere ausreichende Zelle Kulturschale) und das Gericht im Brutkasten für 15-20 min erlauben die BME zu festigen.
8. Unterdessen bereiten Sie eine niedrig-Anlage 6 cm Schale mit 5 mL Medium kortikalen Induktion.
9. Entfernen Sie nach der Polymerisation des BME die Tröpfchen, die die Zelle Aggregate aus dem Kunststoff Paraffin Film Blatt enthält. Umdrehen, dass den Kunststoff Paraffin-Film mit sterilen Pinzette und drücken Sie vorsichtig die Zelle Aggregate in die leicht geneigte (ca. 30°) Low-Anlage 6 cm Schüssel, bis die Tropfen aus dem Kunststoff Paraffin Film Blatt fallen. Maximal 16 Zelle Aggregate in einem 6 cm Schüssel zu übertragen.
10. Weiterhin die Zelle Aggregate bei 37 ° c inkubieren

4. Generation des Vorderhirns-Typ Organellen von Neuroectodermal Aggregaten

1. Platzieren Sie einen Tag nach der Einbettung in eine Matrix BME organoide Kultur Gerichte auf einem schaukelnden Zelle Kultur Shaker mit einem Neigungswinkel von 5° und 14 u/min, in eine Zelle Kultur Inkubator installiert.
2. Monitor Organellen jeden Tag. Homogene neuroepithelialer Schleife-artige Strukturen entwickeln sich allmählich nach dem Einbetten in BME-Matrix.
3. Wenn Gliazellen Loop-Strukturen sichtbar sind, ändern Sie das Medium in organoide Differenzierung DMEM-F12 mit N2-Ergänzung (1: 200), B27 Ergänzung (1: 100), Glukose (0,2 mg/mL), Lager (0,15 µg/mL), 0,5 %-haltigem Medium NEAA, 1 % L-Alanyl-L-Glutamin, Insulin (2,5 µg/mL)
4. Ersetzen Sie organoide Differenzierung Medium alle 3-4 Tage, bis die gewünschte Differenzierung-Zeitpunkt erreicht ist. Dann fix Organellen (siehe Abschnitt 5).
   Hinweis: Gelegentlich kann das Gewebe Knospen der optisch durchscheinende Gewebe ohne Loop-Strukturen aufweisen. Obwohl dies nicht ideal ist, betrifft dies nicht die Entwicklung der kortikalen Strukturen. Die Organellen können bis zu 40 Tage lang in organoide Differenzierung Medium kultiviert werden. Für erweiterte Kultur Zeit (40-100 Tage) organoide Differenzierung Medium werden mit 01:50 ergänzt kann BME Gewebe Komplexität zu erhöhen und mit BDNF und GDNF neuronalen überleben und Reifung^14,15zu ermöglichen.

5. Fixierung und Validierung des Vorderhirns-Typ Organellen

1. Für die Validierung sammeln Sie 6 Organellen am 20. Tag. Verwenden Sie 3 Organellen für die mRNA isoliert und PCR-Analysen. Übertragen Sie die zusätzlichen 3 Organellen auf einer 24-Well-Platte mit PBS mit einer Pipettenspitze geschnitten 1 mL mit einer Öffnung von 3-3,5 mm für Fixierung und sequentielle Immunocytochemical Analysen.
2. Waschen Sie die Organellen zweimal durch sorgfältig Absaugen der PBS und ersetzt sie durch neue PBS mit einer 5-mL-Pipette. Die Organellen für 15 min in kalten 4 % Paraformaldehyd (PFA) (pH 7,4) befestigen.
   Vorsicht: Beachten Sie, dass PFA ein bekanntes menschliches Karzinogen ist. Alle Arbeiten erfolgen in einem chemischen Abzug Nitril-Handschuhe tragen. Es wird empfohlen, Schutzbrille tragen. Formaldehyd kann irreversible Schäden an der Hornhaut verursachen.
3. Der PFA sorgfältig abzusaugen und waschen drei Mal mit Raumtemperatur PBS für 10 min.
4. Die PBS mit 30 % Saccharose-Lösung zu ersetzen (wt/Vol, PBS-basierte) und speichern Sie die Proben bei 4 ° C erlauben Organellen zu dehydrieren. Organellen können für bis zu 7 Tage bis zu Weiterverarbeitung gespeichert werden.
5. Einen Tag nach der Fixierung, Pre-Fleck dehydrierten Organellen durch Zugabe von Trypan blau bei ca. 01:50 für 10 min um die Visualisierung der Organellen während des Kryoschneiden-Verfahrens zu ermöglichen.
6. Bereiten Sie das Einbetten von Medium mit 10 % Saccharose, 7,5 % Gelatine wt/Vol in PBS, und auf 75 ° C erwärmen Sie, bis es flüssig ist.
7. Ersetzen Sie 30 % Saccharoselösung mit Einbetten von Medium und übertragen Sie 24-Well-Platte auf eine Heizplatte (60 ° C) für 15 min auf die Organellen equilibrate.
8. Bedecken Sie den Boden der einbettenden Formen mit einer Schicht aus Einbetten von Medien und legen Sie sie auf dem Eis zu polymerisieren.
9. Übertragung der Organellen von 24-Well-Platte zur Einbettung Formen mit der polymerisierten einbetten Medium zusätzliche Einbettungs Medium an der Spitze hinzufügen, so dass die Organellen bedeckt sind, und legen Sie die Form schnell in eine 100 % Ethanol/Trockeneis Bad (Einfrieren Temperatur sollte zwischen-30 bis-50 ° C) für mindestens 1 min zum Schock-Freeze.
10. Legen Sie die Form mit Zange auf Trockeneis vorübergehend und entweder speichern, gehen sie bei-80 ° C oder direkt mit Kryoschneiden.
11. Cryosection Organellen auf 20 µm Dicke und sammeln verfolgen die Abschnitte auf Objektträger, halten des Ordens Abschnitte auf den Folien (sequenzielle Aufnahme). Abschnitte auf Folien für mehrere Stunden trocknen, bevor sie bei-80 ° C zu speichern oder direkt ausführen Immunocytochemical Färbung zu ermöglichen.

Ergebnisse

Das standardisierte Vorderhirn-Typ organoide Protokoll beschrieben hier in der Regel erzeugt sehr homogene organoide Kulturen fast ausschließlich dorsale kortikale Identität aus menschlichen iPSCs innerhalb von 20 Tagen des Anbaus (Protokoll in Abbildung 1 aufgeführten A). es wird empfohlen, mehrere Qualitätskontrolle Schritte ausführen, während der zeitliche Verlauf des Protokolls definiert hier als: "go" (den Differenzierungsprozess weiter) und "No-Go" (suboptimale Kulturen, es wird empfohlen, die Partie zu beenden) (Abbildung 1 ). Es ist auch ratsam, jeden Schritt der Qualitätskontrolle zu dokumentieren, auch durch die Bilder und Notizen.

Der erste wichtige Schritt bei der Schaffung von Vorderhirn-Typ Organellen ist mit qualitativ hochwertigen iPSC Kulturen zu beginnen. Es ist wichtig, dass iPSCs keine größeren Fraktionen von differenzierten Zellen enthalten. Verwenden Sie nur iPSC-Kulturen, die zu präsentieren, als eine homogene Monolage von undifferenzierten Zellen am Start Bevölkerung (Zahlen 1 b, C). Darüber hinaus ist es entscheidend, mit der angegebenen Handynummer für iPSC-Aggregation zu beginnen. Die erste detaillierte Inspektion der iPSC Aggregate sollte am 2. Tag durchgeführt werden. In diesem Stadium sollten die Aggregate Kompaktzelle Knospen mit glatten Kanten ("Go") gebildet haben unregelmäßig erscheinenden Aggregaten oder Aggregate mit Hohlräume sollte verworfen ("No-Go") (Abbildungen 1, E) werden. Der nächste Schritt der Qualitätskontrolle sollte am 10. Tag des Protokolls durchgeführt werden. Zu diesem Zeitpunkt die Zelle Aggregate sollten zeigen glatt und optisch durchscheinende Gewebe auf der äußeren Oberfläche, Induktion von Neuroectoderm ("Go") darstellt, während das Fehlen solcher Gewebe suboptimale neurale Induktion anzeigt ("No-Go") (Zahlen 1F, G ). Nur diesen Aggregaten, die eine transluzente Oberfläche (Abbildung 1F) aufweisen sollte in BME-Matrix eingebettet werden. Nachdem eingebettet, entwickeln die kortikalen Organellen kontinuierliche neuroepithelialer Schleife-ähnliche Strukturen, die schnell erweitern wird. Analysieren Sie die Effizienz der kortikalen Induktion am Tag 15 und 20 durch die Untersuchung, ob die Organellen entwickelten polarisierte neuronale Ektoderm haben, wie in Abbildung 1H, J ("Go") gezeigt. Überarbeiten Sie im Falle der Organellen nicht solche neuroepithelialer Knospen ("No-Go" wie in Abbildung 1I, K), kritisch entwickelt haben die durchgeführten Qualitätskontrolle Schritte zur Problembehandlung. Wenn fest im Anschluss das Protokoll hochstandardisierten organoide Chargen werden generiert (Figuren 2A, B), der ≥ 90 % Homogenität in hervorgeht, neuronale Ektoderm Bildung innerhalb und zwischen den Chargen (Abbildung 2C) polarisiert. Ein häufiger Fehler führt zu Variable Effizienz der polarisierten neuronale Ektoderm Bildung soll die Zelle Startnummer für iPSC Aggregation erhöht, oder starten Sie mit minderwertigen iPSC Kulturen wie Mycoplasmen verunreinigt, Kulturen oder Kulturen, die enthalten differenzierte Zellen.

Eine detaillierte Überprüfung der dorsalen Teleenzephalischer Identität des generierten Organellen sollte am 20. Tag durchgeführt werden. Zu diesem Zweck sollte 3 Organellen fixiert und für Immunfluoreszenz Analysen verwendet werden. Geschichtete neuroepithelialer Schleifen(Abbildung 3)express die neurale Stammzellen Marker Sox2 (Abbildung 3B, D), das Vorderhirn Marker Pax6 und Otx2 (zahlen 3, E), und die dorsale kortikale Markierung Emx1 (Abbildung 3 F). diese kortikalen Schleifen weiter zeichnen sich durch eine apikale Lokalisierung von N-Cadherin und ZO-1 (zahlen 3, H), ventrikuläre Zone radialen Glia-Zellen (vRGC)-abgeleitet von Mikrotubuli, die auf der basalen Seite der Strukturen (von der apikalen erstreckt Abbildung 3 ich), und apikalen befindet sich teilenden Zellen, die positiv für phosphorylierten Vimentin beflecken (p-Vimentin, Abbildung 3J). Zelltod kann innerhalb der organoide Strukturen vorliegen. Zentralen Apoptose ist normal und hat keinen Einfluss auf die Entwicklung der kortikalen Gewebe. Darüber hinaus sollten 3 Organellen verwendet werden um die Homogenität des Protokolls zu beurteilen von Genexpressionsanalysen. Vorderhirn-Typ Organellen zeigen Ausdruck der dorsalen Vorderhirn Marker (FoxG1, Otx2, Emx1), während der Ausdruck des Zwischenhirns (FoxA2, Pax5) und die Marker Hinterhirn (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) ist nicht nachweisbar (Abbildung 3K).

Chargen von qualitätsgeprüften Organellen einsetzbar für verschiedene Anwendungen wie die Analysen der Division Ebene der apikalen radiale Gliazellen. Zu diesem Zweck empfehlen wir die Durchführung von doppelten Färbung mit Antikörpern gegen p-Vimentin und Tpx2 (Abbildung 3J). P-Vimentin ist während der Mitose durch CDK1 phosphoryliert und befindet sich im Zellkern, markiert damit alle Kerne in der mitotischen Phase¹⁶. Tpx2 ist ein Mikrotubuli assoziiert-Protein, das der mitotischen Spindel und die apikale Prozesse, während interkinetic nuklearen Migration^{17,18 visualisieren kann}. Mit diesen Markern, drei Aspekte der vRGC Division können im Prinzip analysiert werden: (I) ob Zelle Abteilung erfolgt an der apikalen Seite, (II) ob die Division Ebene ausgerichtet vertikal (Anzeige symmetrische Zellteilung), horizontal oder schräg (ist asymmetrische Zellteilung angibt) an die apikale Oberfläche, und (III) ob Mikrotubuli organisieren Zentren werden normalerweise gebildet.

Organellen können auch weiter in komplexer organisiert und geschichteten kortikalen Gewebestrukturen unterschieden werden. Kortikale Strukturen im Tag 35 ± 2 Organellen bestehen aus einer ventrikulären Zone (VZ)-, eine innere und äußere subventricular Zone (SVZ), sowie eine kortikale Platte (CP) - wie Bereich. Innerhalb der VZ und die inneren und äußeren SVZ können vRGCs, fortgeschrittene Stammväter (IPs) und erinnert an oRGCs Zellen identifiziert werden. Darüber hinaus die Anfangsausbildung eine geschichtete Rinde beobachtet werden in der CP-ähnlichen Umgebung mit tiefen kortikalen Neuronen, die mit dem Ausdruck Tbr1 und Ctip2 im Inneren und oberen kortikale Neuronen, die mit dem Ausdruck Satb2, sowie Reelin exprimierenden Zellen in den äußeren Regionen¹⁰.

Abbildung 1 : Schematische Übersicht über die organoide Protokoll und Abbildung von "gehen" und "No-Go" Kriterien. (A) schematische Übersicht des Protokolls. CI-Medium: kortikale Induktion Mittel; CD: kortikale Differenzierung Medium. (B–C) Bild von einer optimalen 90 % konfluierende iPSC Monolayer Kultur (B) und eine nicht geeignete iPSC Kultur Differenzierung (C) ausstellen. (D–E) Ein iPSC-Aggregat optimale Größe, Zelldichte, und das Aussehen der Oberfläche (D) und zwei "No-Go" Zelle Aggregate ausstellen oder Zelle schont Hohlräume (E, obere Aggregat) oder unregelmäßige Kanten (E, untere Aggregat) zwei Tage folgende Zelle Aggregation. (F–G) Zelle Aggregate ausstellenden durchscheinend und glatte Kanten (F) und Zelle Aggregate fehlen optische clearing (G). Die gelbe Linie ist den Bereich von Interesse zu visualisieren. (H–K) Eine optimale organoide mit kontinuierlichen neuroepithelialer Schleifen (H, J) und eine organoide, die nicht radial entwickeln organisiert Neuroectoderm (ich, K) bzw. am Tag 15 und 20, abgebildet. Maßstabsbalken, B-C-500 µm; D-K-200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Homogenität und Reproduzierbarkeit des Vorderhirns-Typ organoide Protokolls. (A–B) Repräsentative Hellfeld Bilder von Organellen von einer Charge an Tag 15 (A) und 26 (B). (C) Quantitative Analysen von Organellen am Tag 20. Organellen, die an der äußeren Oberfläche eines Neuroepithelium, im Hellfeld als optisch klare oberflächlichen Gewebe eine klare Grenze und Beweise der radialen zellulären Architektur erkennbar anzeigen wurden quantifiziert (n = 3 pro iPSC Zeile mit mindestens 16 Organellen pro Experiment). Skala bars, A-b: 500 µm. Error Bars ± SD Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Validierung des Vorderhirns-Typ Organellen am Tag 20. (A–-J) Immunocytochemical Charakterisierung der Organellen. Organellen organisieren in mehreren neuroepithelialer Schleifen (A, counterstained mit DAPI). Organisierten Zellen innerhalb der Gliazellen Schleifen Express die neurale Stammzellen Marker Sox2 (B, D), das Vorderhirn Marker Pax6 geschichtet (C, D) und Otx2 (E), sowie der dorsalen Vorderhirn Marker Emx1 (F). Kortikale Schleifenstrukturen ausgestellt einem feinen anhaftenden Kreuzung Gürtel an den apikalen Seite mit der Akkumulation von N-Cadherin (G) und Zona Occludens Protein 1 (ZO-1; H). ventrikuläre Routinggruppenconnectors Mikrotubuli Netzwerke (gefärbt durch Schimmelpilzschäden α-Tubulin, Ac-Wanne) erstrecken sich von der apikalen auf der basalen Seite der Loop-Strukturen (ich). Proliferierende Zellen mit dem Ausdruck p-Vimentin (p-Vim) befinden sich auf der apikalen Oberfläche. Mitotische Spindeln sind gefärbt durch Tpx2. Vertreter höherer Vergrößerung Bild eine vertikale und eine horizontale Teilung-Ebene werden auf der rechten Seite (J) angezeigt. (K) RT-PCR-Analyse für die Region-spezifische Transkriptionsfaktoren am Tag 20 der zwei unabhängige Sätze von Organellen von 2 verschiedenen iPSC Linien abgeleitet. FB: fetalen Gehirnkontrolle; AB: erwachsenen Gehirn steuern. Maßstabsbalken, A-D 200 µm; E-I 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Epitop	Verdünnung
Sox2	1 - 300
Pax6	1 - 500
Otx2	1 - 500
Emx1	1 - 50
N-cadherin	1 - 500
ZO-1	1 - 100
P-Vimentin	1 - 1000
Tpx2	1 - 500
Schimmelpilzschäden α-tubulin	1 - 500
Alexa488 anti-ms	1 - 1000
Alexa488 anti-Rb	1 - 1000
Alexa555 anti-ms	1 - 1000
Alexa555 anti-Rb	1 - 1000

Tabelle 1: Antikörper für die Qualitätskontrolle von Organellen am Tag 20.

Grundierung	Sequenz
Otx2 nach vorne	tgcaggggttcttctgtgat
Otx2 rückwärts	agggtcagagcaattgacca
FoxG1 nach vorne	ccctcccatttctgtacgttt
FoxG1 rückwärts	ctggcggctcttagagat
Emx1 nach vorne	agacgcaggtgaaggtgtgg
Emx1 rückwärts	caggcaggcaggctctcc
FoxA2 vorwärts	ccaccaccaaccccacaaaatg
FoxA2 reverse	tgcaacaccgtctccccaaagt
Pax5 vorwärts	aggatgccgctgatggagtac
Pax5 rückwärts	tggaggagtgaatcagcttgg
HoxB2 nach vorne	tttagccgttcgcttagagg
HoxB2 rückwärts	cggatagctggagacaggag
HoxA4 nach vorne	ttcagcaaaatgccctctct
HoxA4 rückwärts	taggccagctccacagttct
HoxB4 nach vorne	acacccgctaacaaatgagg
HoxB4 rückwärts	gcacgaaagatgagggagag
HoxB6 nach vorne	gaactgaggagcggactcac
HoxB6 rückwärts	ctgggatcagggagtcttca
18 Jahre nach vorne	ttccttggaccggcgcaag
18 s rückwärts	gccgcatcgccggtcgg

Tabelle 2: Primer und Grundierung Sequenzen für Genexpressionsprofil.

Diskussion

Gehirn Organellen sind ein mächtiges Werkzeug für menschliche Gehirn Entwicklung in Vitro zu studieren, da sie die relevanten Arten Hintergrund und die komplexen 3D Anordnung der Zellen in einem Gewebe-Kontext liefern. Damit Lücke sie die zwischen nichtmenschlichen Tiermodelle und reduktionistischen menschlichen zweidimensionale Monolage Zelle Kulturtechniken. Ihre Anwendungen sind, jedoch durch mangelnde Reproduzierbarkeit⁹behindert. Wir haben ein Vorderhirn-Typ organoide Protokoll entwickelt, die große Variabilität von Probe zu Probe überwindet durch die Kombination der selbstorganisierenden Kapazität des iPSC mit ihrer Bereitschaft zur Musterung Faktoren. Insbesondere iPSCs wurden zur Förderung der Selbstorganisation und anschließend hemmen TGF-ß/SMAD-Signalisierung, dorsalen Cortex Differenzierung zu fördern, indem man die Kulturen auf einem BMP (LDN-193189) zusammengefasst und TGF-β Typ I Rezeptor Hemmer (A83-01). Darüber hinaus wurde eine Hemmung des Wnt-Signalweg (IWR) um Posteriorization zu verhindern Verbindung angewendet. Im Gegensatz zu "intrinsische" zerebrale organoide Protokolle¹⁹, die auf basieren Selbstmontage ohne externe Steuerung zu recht heterogene Gehirn Organellen und ausstellenden Großserien-Variationen (gemessen an der Effizienz der polarisiert neuronale Ektoderm Bildung¹⁵), das Protokoll beschriebenen reproduzierbar erzeugt homogene Vorderhirn-spezifische Organellen von menschlichen iPSCs.

Diese Organellen Vorderhirn-Typ eignet sich für eine Vielzahl von Anwendungen wie Entwicklungsstörungen Studien, evolutionäre gen Funktionsstudien, einschließlich Krankheit Modellierung und potenziell, Drogen Tests und therapeutischen Zwecken. Das Protokoll ist jedoch am besten geeigneten frühe Aspekte der menschlichen kortikalen Entwicklung untersuchen. Wir haben zum Beispiel die Vorderhirn-Typ Organellen verwendet, um Mensch-spezifische Aspekte von vRGC Verhalten zu untersuchen. Genauer gesagt, pathophysiologische Veränderungen im Zusammenhang mit einer schweren Form der Lissenzephalie, eine menschliche kortikalen Fehlbildung zeichnet sich durch eine in der Nähe von Abwesenheit von kortikalen Falten, wurde behoben. Nur bestimmte Aspekte dieser Krankheit können bei Mäusen modelliert werden, wie das Gehirn der Maus natürlich Lissencephalic ist. Wenn die organoide System auf Lissenzephalie Patienten abgeleitet iPSCs anwenden, könnten wir zuverlässig rekapitulieren Mensch-spezifische Aspekte der Erkrankung und zugrunde liegenden Mechanismen zu identifizieren. Genauer gesagt, konnten wir zeigen, dass Patienten-abgeleitete Organellen eine signifikante Reduktion in der Größe durch einen Schalter von symmetrischen auf asymmetrischen Zellteilung der vRGCs verursacht zeigen. Dieser Schalter wurde im Zusammenhang mit Veränderungen in der Organisation des vRGCs Mikrotubuli-Netzwerk, eine Störung der Architektur des VZ-Nische und Ausdruck der Zelle Adhäsionsmoleküle, was zu einer Beeinträchtigung Aktivierung des N-Cadherin/β-Catenin verändert Signalisierung Achse¹⁰. Note: β-Catenin-abhängige Regelung der vRGC Abteilung Modi wurde Mensch-spezifische Überexpression von β-Catenin bei Mäusen tangential Kortex Expansion führt und anschließend kortikalen Falten²⁰vorgeschlagen. So zeigen unsere Daten, dass organoide Vorderhirn-Typsystem ein viel versprechendes Instrument stellt, in gewissem Sinne quantifizierbare Mensch-spezifische Aspekte des frühen kortikalen Entwicklung in-vitro-Studie.

Eine große Herausforderung für die Zukunft ist die Homogenität der Organellen über längere Zeiträume beibehalten, um reifer neuronalen Phänotypen zu erreichen. Dies könnte durch eine oder mehrere der folgenden Schritte realisiert werden: Kultivierung der Organellen in einem Bioreaktor System¹⁴,¹⁵, zur Ergänzung der Differenzierung Medium mit Nervenwachstum oder neuronale überleben Faktoren Gerüste Anwendung schweben. Schließlich kann eine kontrollierte Steigerung im Gehirn Komplexität erreicht werden, durch die Verschmelzung der Vorderhirn-Typ Organellen mit zerebralen Organellen von verschiedenen regionalen Identität^21,22.

Zusammengenommen bietet das Vorderhirn-Typ organoide Protokoll hier vorgestellten eine leicht anwendbare und zuverlässiges Werkzeug für die Generation der frühen kortikalen Strukturen in Vitro. Das Protokoll zu sehr homogenen frühen kortikalen Gewebe auf mehrere iPSC-Zeilen und kann genutzt werden, um zuverlässig individuelle kundenspezifische kortikalen Gewebe erzeugen. Somit ist das System besonders geeignet für Anwendungen, die ein hohes Maß an Homogenität und Reproduzierbarkeit wie Krankheit Modellierung erfordern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
A83-01	StemGent	130-106-274	500 nM
B27 Supplement	Gibco	17504-044	1 bis 100
Basalmembran-Extrakt (z.B. Geltrex)	Gibco	A14132-02
Cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501	0,15 µ g/mL
Reagenz für die Zelldissoziation (TrypLE Express)	Gibco	12605028
Zählkammer, z.B. Fuchs-Rosenthal	Karl Hecht	40449001
D-Glucose	Carl Roth	HN06.3	0,2 mg/mL
, DMEM-F12, L-Glutamin	Gibco	11320033
Einbettformen (Tissue-Tek Cryomold)	Sakura Finetek	4565
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma-Aldrich	E6511	0,5 mM
Gelantin	Sigma-Aldrich	G1890
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-25KU	10 μg/
ml-Inhibitor des WNT-Ansprechens (IWR-1)	Enzo Life Science	BML-WN103-0005	10 μg/ml-Insulin
	Sigma-Aldrich	91077C	2,5 & Mikro; g/mL
IPSC-Medium für Monolayer-Kulturen (Pluripro)	Cell Guidance Systems	MK01
L-Alanyl-L-Glutamin (GlutaMax)	Gibco	35050038	1%
Niedrigadhäsive 6 cm Platten	Labomedic	2081646L
Niedrigadhäsive 10 cm Platten	Labomedic	2081646O
LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-104-171	180 nM
N2 Supplement	Gibco	17502-048	1 bis 200
nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140035	0,50%
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	4,00%
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	14190144
Kunststoff-Paraffinfolie (Parafilm)	BRAND GMBH + CO KG	701606
ROCK-Inhibitor Y-27632	Zellleitsysteme	SM02-100	5 µ M oder 50 µ M
Saccharose	Sigma-Aldrich	S7903
Röhrchen 15 mL	Corning Life Sciences	734-0451
Objektträger, z. B. Superfrost Plus Objektträger,	Thermo Scientific	4951PLUS4
Gewebekultur, 6-Well-Platte	Falcon	734-0019
Gewebekultur, 24-Well-Platte	Falcon	734-0949
Trypanblau-Färbung	Gibco	15250-061
Platte mit extrem geringer Bindung und 96-Well-Lipidurbeschichtung, A-U96	Amsbio	AMS.51011610
Antikörper
Sox2	R& D Systems	MAB2018
Pax6	Covance	PRB-278P-100
Otx2	R& D Systems	ab9566
Emx1	Sigma	HPA006421
N-Cadherin	BD	610921
ZO-1	Life Tech	61-7300
P-Vimentin	Biozol	D076-3
Tpx2	Novus Biologicals	NB500-179
Acetyliertes α-Tubulin	NEB/CS	5335
Alexa488 Anti MS	Invitrogen	A11001
Alexa488 Anti RB	Invitrogen	A11008
Alexa555 Anti	MS Invitrogen	A21424
Alexa555 Anti	Invitrogen	A21429