Methodenartikel

Eine einfache und kostengünstige Test zur Messung der Gehfähigkeit in Mausmodellen der Muskeldystrophie

DOI:

10.3791/56772

⸱

29. Dezember 2017

 , 
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, 2Center for Duchenne Muscular Dystrophy, University of California, 3Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, 4Molecular Biology Institute, University of California

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt ein flexible und kostengünstige System zur Messung Maus Gehfähigkeit in ein offenes Feld Aktivität Assay. Wir zeigen, dass ein 6-minütige Gehfähigkeit Assay basiert auf diesem System eine Abnahme der Freiwillige Bewegung in Mdx Mäuse erkennt und Verbesserung der Muskel-spezifische Rettung dieser Tiere genau unterscheidet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Messung der funktionellen Ergebnisse bei der Behandlung von Muskeldystrophie ist ein wesentlicher Aspekt der präklinischen Erprobung. Die Beurteilung der freiwilligen Gehfähigkeit in Mausmodellen ist eine non-invasive und reproduzierbare Aktivität-Assay, der direkt analog zu Maßnahmen der Patient Gehfähigkeit wie der 6-Minuten Gehtest und im Zusammenhang mit Mobilität punktet. Viele gängige Methoden zum Testen der Maus Gehfähigkeit Geschwindigkeit und Distanz basieren auf dem offenen Feldtest, wo ein Tier Freizügigkeit innerhalb einer Arena im Laufe der Zeit gemessen wird. Ein großer Nachteil dieses Ansatzes ist, dass kommerzielle Software und Ausrüstung für hochauflösende Motion-tracking ist teuer und erfordern Mäuse an spezialisierten Einrichtungen zur Prüfung übertragen. Hier beschreiben wir eine kostengünstige, videobasierte System zur Messung Maus Gehfähigkeit, die freie und Open-Source-Software nutzt. Unter Verwendung dieses Protokolls, beweisen wir, dass freiwillige Gehfähigkeit im Mausmodell Dystrophin-Null Mdx für Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) im Vergleich zu Wildtyp Mausaktivität verringert wird. In Mdx Mäuse mit dem Ausdruck der Utrophin Transgen, diese Aktivität Defizite nicht eingehalten und die insgesamt zurückgelegte Strecke ist von Wildtyp Mäusen zu unterscheiden. Diese Methode ist effektiv für die Messung von Veränderungen im freiwilligen Gehfähigkeit dystrophischen Pathologie zugeordnet und bietet eine vielseitige Plattform, die leicht angepasst werden kann auf vielfältige Forschung Einstellungen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zuverlässige und reproduzierbare Messungen der Muskelfunktion sind entscheidend für die Beurteilung der Wirksamkeit von möglichen Therapien für DMD. DMD ist eine genetische Störung verursacht durch Mutationen im Dystrophin-gen führt zu progressive Muskelschwäche, Verlust der Gehfähigkeit und schließlich zum kardiorespiratorische Versagen. Die am häufigsten verwendete Tiermodell der DMD ist das Dystrophin-Null Mdx -Maus. Eine Reihe von funktionalen Tests entstanden als routinemäßige Tests zur Bewertung der Progression der Erkrankung in der Mdx -Maus ebenso wie in ähnlichen Tiermodellen für andere Dystrophien und Myopathien. Häufig verwendete in-Vivo -Tests sind Messungen der Vordergliedmaße Griffstärke, Draht hängende Rotarod maximal, Zeit, Zeit bis zur Erschöpfung während Laufband laufen und motor Aktivitätsanzeige. Gab es erhebliche Anstrengungen auf dem Gebiet dieser Tests, mit dem Ziel der Reduzierung Variabilität zwischen präklinischen Studien und die Erhöhung der translationalen Potenzials Therapeutika in Mäuse1,2getestet zu standardisieren.

Eine wichtige Kategorie von präklinischen Tests ist die Messung der willkürliche Bewegungen, ein Parameter, der häufig in murinen Modellen der Muskeldystrophie geändert wird. Dies ist in der Regel von Assays basierend auf freiem Feld Aktivitätsüberwachung getestet und kann entweder Horizontal (zu Fuß) oder vertikal (Aufzucht) Bewegungen über einen Verlauf von Minuten oder Stunden2,3,4zu bewerten. Eine Reihe von Studien haben gezeigt, willkürliche Bewegungen in Mdx Mäuse, besonders nach dem Training, geändert werden und diese Messungen haben gezeigt, dass Medikament Behandlung und Krankheit fortschreiten werden. Eine große Einschränkung bei der Durchführung dieser Tests ist die Notwendigkeit einer speziellen, teuren Ausrüstung. Hier ist eine kostengünstige Methode, die Maus Gehfähigkeit mit leicht verfügbaren Ressourcen verfolgt präsentiert.

Der 6-Minuten-Gehstrecke ist eine Metrik, die gemeinhin als klinische Bewertungswerkzeug bei Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie-5,-6. Änderungen dieser Maßnahme wurden zur Ergebnisse in Tiermodellen der Duchenne, einschließlich Mdx Mäuse7 und golden Retriever Muskeldystrophie (GRMD) Hunde8bewerten. In dieser Studie erfassen wir Freiwillige Freiland-Bewegung in den 6 Minuten unmittelbar nach eine leichte Übung-Herausforderung. Gehfähigkeit Entfernung wurde dann anhand freien Opensource-Software horizontale Bewegungen im Laufe der Zeit zu messen.

Der wesentliche Vorteil dieser Methode ist, dass Tiere in einer Vielzahl von Einstellungen getestet werden können, ohne spezielle Ausrüstung oder kostenintensive kommerzielle Software für Analyse. Ein wichtiger Aspekt dieser Analyse ist, dass es in einer Labor-Umgebung ausgeführt werden kann, ohne sich verschieben oder Mäuse aus dem Vivarium in eine spezielle Kern-Anlage übertragen. Das hier beschriebene Video-Tracking-Protokoll kann eignet sich gut für die Beurteilung der Gehfähigkeit über relativ kurze Zeiträume und Aktivität Unterschiede zwischen Wildtyp und Mdx Mäuse zu erkennen, sowie funktionelle Verbesserung in einer Rettung zu offenbaren Modell des DMD.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier beschriebenen Methoden wurden von der institutionellen Animal Care und Nutzung hat an der University of California, Los Angeles genehmigt. Wildtyp (C57BL/6J) und Mdx Mäuse (C57Bl/10ScSn Hintergrund) wurden von einer kommerziellen Quelle erworben. MDX: Utrophin-Tg Mäuse waren ein Geschenk von James Ervasti, mit freundlicher Genehmigung von Kay Davies und gepflegt auf die Mdx -Hintergrund. Gehfähigkeit Assays wurden auf männliche Mäuse im Alter von 6 Monaten durchgeführt. Mäuse wurden in folgenden Richtlinien festgelegten institutionellen Animal Care Terasaki Life Sciences Vivarium gepflegt und Use Committee an der University of California, Los Angeles (Genehmigung Nr. 2000-029-43) und Genehmigung für diese Studien erteilte der UCLA Animal Welfare Assurance (Genehmigung Nr. A3196-01).

1. Vorbereitung der Kammer

  1. Eine einheitliche Zeit der Tag9Höchstleistungen Sie Datenerfassung in einem ruhigen, klimatisierten Raum. Führen Sie die Tests geblendet, der Genotyp und Behandlung der Maus getestet.
  2. Passen Sie jede Freiland-Kammer-System für diese Analyse.
    Hinweis: In dieser Studie verwenden wir eine kostengünstige und leicht zu transportieren-Aufnahme Kammer besteht aus einem großen Papierkorb. Die Freiland-Arena ist ein Tablett auf einem Käfig oder ähnliche erhöhte Plattform gesetzt.
  3. Legen Sie die Kamera auf einem Drahtgeflecht über die Kammer in der vollen Arena aufnehmen.
  4. Reinigen Sie die Aufnahme-Kammer mit einem Desinfektionsmittel vor jeder Verhandlung.

2. Pre-Übung Protokoll und Datenerhebung

  1. Optional, unmittelbar vor der Leistungserfassung, Herausforderung jeder Maus mit einem Muskel-Aktivierung-Protokoll.
    Hinweis: Dies ist optional, aber empfohlen in Experimenten mit Mäusen Mdx .
    1. Lassen Sie die Maus zu greifen den Zugstab des digitalen Kraftmesser und ziehen vorsichtig zurück, bis der Zugstab freigegeben wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal pro Versuch.
    2. Rekordhoch Spannung (N) für jede Prüfung.
      Hinweis: Zusätzlich zu seiner Tätigkeit als Herausforderung für die Gehfähigkeit Assay Übung, die Kraft, die durch das Tier während dieser Griff-Stärke-Test als eine zusätzliche funktionelle Ergebnis Maßnahme2,10einsetzbar.
    3. Durchführen Sie insgesamt fünf Studien für jede Maus mit 1 min Pause zwischen jedem Versuch.
  2. Unmittelbar nach der Griff-Stärke-Test oder andere Übung Protokoll, platzieren Sie den Mauszeiger in der Aktivität-Kammer.
  3. Starten Sie die video-Aufzeichnung der Bewegung der Maus in der Kammer-Arena. Lassen Sie die Maus, frei für 6 min zu erkunden.
  4. Halten Sie die Aufnahme bei 6 min und zurückkehren Sie die Maus zu seinem Hause Käfig.

3. video-Analyse

  1. Optional, bereiten Sie Video für die Analyse durch die Reduzierung der Frame-Rate. Um die Frame-Rate für die Verfolgung von Analyse zu reduzieren, verwenden Sie das folgende Protokoll in einer Video-editing-Software (z.B., iMovie oder ähnliches Programm), die video-Frame-Rate um den Faktor 2 zu dezimieren.
    Hinweis: Je nach Länge und Frame-Rate des Videos, kann es zur Senkung der video-Frame-Rate vor der Analyse nützlich sein. Video wurde in dieser Studie bei 30 Frames/s (6 min Aufnahme, insgesamt rund 10.800 Frames) aufgenommen.
    1. Laden Sie das Video in die Software.
    2. Klicken Sie im Menü "Speed", "Geschwindigkeit: schnell" und Geschwindigkeit auf 2 X einstellen.
    3. Exportieren Sie die dezimierte Video in MP4-Datei-Format für tracking-Analyse.
  2. Öffnen Sie das Video zur Analyse in das Software-Programm. Legen Sie die Kalibrierung für die Video-Aufnahme mit dem Linienwerkzeug. Zeichnen Sie eine Linie entlang einer Seite der Kammer. Rechter Mausklick auf die Linie und wählen Sie "Calibrate messen..." Geben Sie die tatsächliche Größe der Kammer Seite in Zentimetern.
  3. Um semi-automatischen Tracking der Position des Mauszeigers zu beginnen, klicken Sie auf "verschieben" Cursor.
    Das erste Bild im Video ab, der rechten Maustaste auf den Punkt verfolgt werden; die Tracking-Punkt ist mit einem blauen Kreis markiert.
    Hinweis: In der vorliegenden Studie war die Position jedes einzelnen Tieres durch Rückverfolgung der Schwanzwurzel verfolgt.
  4. Gehen Sie den Frame, indem Sie auf den Pfeil nach rechts auf der Tastatur; der Spurpunkt sollte automatisch basierend auf die Position der Schweif Basis bewegen.
    1. Wenn die Tracking-Position nicht mit dem Punkt von Interesse in einem bestimmten Rahmen ausgerichtet ist, manuell ausrichten des blauen Kreises um die Schwanzwurzel.
      Hinweis: Abhängig von der Qualität des Videos und die Geschwindigkeit der Maus möglicherweise das Tracking Variable Ebenen von Benutzereingaben in Ausrichtung mit dem Punkt von Interesse zu erhalten. Der Weg der Maus soll im Verlauf des Videos voraus.
  5. Bei der Verfolgung von das ganze Video abgeschlossen ist, speichern Sie das video und Rückverfolgung Overlay. Exportieren Sie die Positionsdaten von der Verfolgung durch die Auswahl "Exportieren, Spreadsheet".

(4) Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Positionsdaten in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Bewegung-Analyse-Software meldet, dass die X, Y Position der Maus in den einzelnen Frames koordinieren.
  2. Um zurückgelegte Strecke von Frame zu berechnen, verwenden Sie die folgende Gleichung (wo steht im Rahmen einer x1, y1 und Bild 2 ist x2, y2):
    figure-protocol-1
    Hinweis: Gesamtdistanz im Laufe der Zeit kann berechnet werden, indem man die zurückgelegte Strecke zwischen den Einzelbildern.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Variationen des Freiland-Tests haben gezeigt, eine wirksame Methode, um das Fortschreiten der Erkrankung in den Modellen der Muskeldystrophie zu testen sein. Hier zeigen wir eine vielseitigere Video tracking-Methode für die Analyse der zweidimensionalen Mausbewegung mit leicht verfügbaren Kontrollgerät und open Source Software (Abbildung 1A–B). In Übereinstimmung mit Ergebnissen berichtet von ähnlichen Assays, wir zeigen, das...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Freiland-Test bietet eine effektive und nicht-invasive Weise Motorik in Mausmodellen der Muskelerkrankung zu testen, und Variationen des Assays können als wertvolle Endpunkt Maß für prä-klinischen Studien dienen. Eine große Einschränkung bei dieser Art von Test ist die hohen Kosten und begrenzten Zugänglichkeit der Activity monitoring-Systeme. In dieser Studie demonstrieren wir ein kostengünstiges System für Freiland Aktivitätsanalyse, die ähnliche Ergebnisse wie vorhandene kommerzielle Software und Geräte erzeugen k...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health [R01 AR048179 und R01 HL126204, R.C.W, T32 AR059033 und F32 AR069469to E.M.G] und die Muscular Dystrophy Association USA [274143 und 416364, R.C.W.].

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
VideokameraApple Inc.ME553LL/AFür die Aufzeichnung von Gehvideos, iPhone 5S Plus (oder gleichwertig)
Kinovea-Software (Version 0.8.15)Kinovea AssociationOpen-Source-Videoanalysesoftware. Kostenloser Download, PC-kompatibel (Version 0.8.15, www.kinovea.org)
iMovie (Version 10.0.6)Apple Inc.Jede ähnliche Software kann verwendet werden, um die Videobildrate zu reduzieren (optional)
Roughneck 32 Gallonen schwarzer runder Mülleimer (offene Feldkammer)Rubbermaid# 1778013Jedes offene Feldkammersystem kann für die Aufzeichnung angepasst werden. In dieser Studie wird eine Aufnahmekammer verwendet, die aus einem Tablett auf einer Plattform am Boden eines großen Mülleimers besteht.
Avant Weißes Kunststofftablett 15 "B x 10" T x 1,45 "H (Freifeldkammer)US Acrylic, LLCJedes Freifeldkammersystem kann für die Aufnahme angepasst werden. In dieser Studie wird eine Aufnahmekammer verwendet, die aus einem Tablett auf einer Plattform am Boden eines großen Mülleimers besteht.
C57BL/6JJackson Laboratory#000664Männliche 6-Monats-Mäuse
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx)Jackson Laboratory#001801Männliche 6-Monats-Mäuse
mdx: Utrophin-Tg (fiona)Geschenk von James Ervasti, mit Genehmigung von Kay DaviesMännliche 6-Monats-Mäuse

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
  2. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
  3. Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
  4. Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
  5. McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
  6. Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
  7. Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
  8. Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
  9. Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).
  10. Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
  11. Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).
  12. Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
  13. Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
  14. Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

MauslokomotionOpen Field Testwillk rliche BewegungVideo TrackingGriffkraftmessungMdx MausmodellUtrophin TransgenDuchenne Muskeldystrophie

Verwandte Artikel