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Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

DOI:

10.3791/56778

⸱

January 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mass Spectrometry Core Facility, University of Sydney, 2Proteomics Core Facility, University of Technology Sydney, 3Neuropathology Group, Discipline of Pathology, School of Medical Sciences, University of Sydney, 4Redox Biology Group, Discipline of Pathology, School of Medical Sciences, University of Sydney

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und zuverlässige Methode für die Sublimation-basierte Erstellung von Formalin fixiert Gewebe für bildgebende Massenspektrometrie bestimmt.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verwendung von Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung hat Massenspektrometrie imaging (MALDI MSI) schnell erweitert, da diese Technik eine Vielzahl von Biomolekülen von Drogen und Lipide zu N-Glykane analysiert. Obwohl verschiedene Probe Präparationstechniken vorhanden, bleibt Erkennung Peptide aus Formaldehyd konserviert Gewebe eine der schwierigsten Herausforderungen für diese Art der massenspektrometrischen Analyse. Aus diesem Grund haben wir erstellt und optimiert eine robuste Methode, die die räumliche Informationen innerhalb der Probe, während die größte Anzahl an ionizable Peptide zu entlocken bewahrt. Wir haben auch zum Ziel, zu erreichen dies in eine kostengünstige und einfache Möglichkeit, wodurch möglichen Voreingenommenheit oder Vorbereitung Fehler, die auftreten kann, wenn mit Instrumenten automatisierten. Das Endergebnis ist eine reproduzierbare und kostengünstige Protokoll.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie imaging (MALDI MSI) als Bild-basierte Technik für zwei Jahrzehnte1,2, eine Reihe von Biomolekülen einschließlich Analyse beschäftigt: Lipide3, Peptide2 ,4, Proteine2,5, Metaboliten6,7, N-Glykane8und synthetische Moleküle wie z. B. Medikamente9,10. Die Anzahl der Publikationen zeigen die Nützlichkeit dieser Technik sind deutlich über der letzten Dekade6,11,12,13gewachsen. Bestimmte Moleküle wie Lipide, sind relativ einfach, über MALDI MSI zu analysieren, wie sie leicht aufgrund ihrer chemischen Natur ionisieren und erfordern daher wenig Vorbereitung3. Jedoch sind die Schritte erforderlich, um effektiv diese Moleküle ionisieren für schwieriger Ziele wie Peptide, umfangreich und in der Regel kompliziert14. Derzeit gibt es nur wenige Veröffentlichungen, die darauf abzielen, Adresse oder demonstrieren Reproduzierbarkeit in den Methoden, die eingesetzt werden, um Gewebe für dieses einzigartige visuelle Technik15vorzubereiten. Aus diesem Grund haben wir zusammengestellt, Beobachtungen und Optimierungen umgesetzt in einer einzigen, einfach zu implementieren, Methodik, die wenig bis gar keine Änderung für die Analyse von Peptiden aus einem Formaldehyd erfordern sollte vernetzt Gewebe Quelle14.

In dieser Handschrift haben wir eine validierte, low-cost reproduzierbare Methode zum Nachweis und zur räumlichen Zuordnung von Peptiden, generiert von Formalin fixiert gefroren (FFF) und Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeschnitte beschrieben. Diese Methode erfordert und verlassen Sie sich auf spezielle Instrumentierung3. Insbesondere gehen wir auf die vielen Aspekte der spezialisierten Probenvorbereitung notwendig, Peptide zu analysieren; Schritte wie Antigen-Retrieval-16 und Matrix-Beschichtung. Unser Protokoll nutzt auch preiswerte Geräte und Reagenzien, wodurch diese Methodik zugänglich zu einer größeren Gemeinschaft, die sonst nicht die Alternative Roboter Apparat17leisten.

Die Beweggründe für die Entwicklung einer manuellen Probe Vorbereitung Methode hatte zwei Ziele: Erstens die Verwendung von einem Sublimator schafft eine konsistente und homogene Beschichtung von Matrix-Kristalle, ~ 1 µm Länge18, etwas Unerreichbares mit häufiger Spritzen sind, Techniken. Zweitens die relativ kleine Einrichtung Kosten: die Gesamtkosten für den benutzerdefinierten Apparat war <$ 1500 AUD. Wir beachten Sie, dass in Bezug auf Wirtschaftlichkeit, der Preis pro Probe viel billiger ist, wenn keine Roboter Maschinen beteiligt ist. Die Verwendung von Sublimation wurde zuvor jedoch nach bestem Wissen und Gewissen, berichtet schrittweise Methoden, die diesen Prozess beschreiben und Probenvorbereitung nicht berichtet noch in der Literatur beschrieben worden.

Dieses Protokoll soll Forscher zu unterstützen, Zugang zu einem MALDI-Massenspektrometer und die Absicht auf die Generierung von räumlichen Informationen in Bezug auf ein Bio-Molekül des Interesses19. MALDI MSI ist im Wesentlichen eine Form der histologischen screening, verlässt sich nicht auf Antikörper oder2Flecken.

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Protocol

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Achtung: Alle geltenden Sicherheitsvorkehrungen sollten befolgt werden, bei der Durchführung dieses Verfahrens, einschließlich der Verwendung von geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) (z.B. Kittel, Nitril-Handschuhe, Schutzbrille, etc.)

1. Vorbereitung der Reagenzien und Geräte

  1. Vorbereitung der Lösungen
    1. 500 mL Carnoys Flüssigkeit vorbereiten, mischen Sie 100 % Ethanol (EtOH), Chloroform und Eisessig in einem 6:3:1 V/V/V-Verhältnis in einer sauberen Glas Schott.
    2. Um flüssige Nitrozellulose (NC) zu machen, lösen Sie NC-Membran (allgemein verwendet in westliche Beflecken auf) in ordentlich Aceton durch sanfte Bewegung, um eine Endkonzentration von 40 mg/mL.
  2. Vorbereitung der NC beschichtete Folien
    1. Verwendung eine Technik ähnlich dem verwendet für die Zubereitung von Blut für histologische Untersuchung20 NC Vorbereitung schmiert beschichteten Folien.
    2. Pipette 40 µL Flüssigkeit NC auf eine Kante des einen Objektträger leitfähigem Indium-Zinn-Oxid (ITO). Verwenden einen normales Glas-Objektträger, ziehen Sie die NC unter Oberflächenspannung über die Folie, um eine sogar Dünnfilm-Beschichtung zu erstellen.
    3. Lassen Sie die NC bei Raumtemperatur für 20 s und dann speichern, bis benötigt bei Raumtemperatur trocknen. Lagerung von Proben unter diesen Bedingungen kann auf unbestimmte vorgesehen Gewebe gepflegt sind und frei von Staub sein.
      Hinweis: Diese Methode der Vorbereitung ist besser bekannt als "thin Film" und erzeugt eine gleichmäßige Beschichtung, die abhängig von der Viskosität des NC sowie das Fehlen der Oberflächenspannung, die auf der Folie einzunivellieren. Die einzige Sorge, die ergriffen werden sollten, bei der Vorbereitung der Folien nicht zu schnell bewegt, die Streifen von NC, anstatt eine vollständige Abdeckung schaffen wird.
      Achtung: Flüssige NC sehr schnell trocknet, ist es wichtig, schnell zu arbeiten, um zu vermeiden, die Lösung zu trocknen, bevor es richtig ausgebreitet hat. Auch sollte darauf geachtet werden, bei der Handhabung von NC in seinem flüssigen Zustand, wie es ist eine hoch energetische Verbindung und wenden keine Zündquelle Brandsätze Explosion zu verhindern. NC erfährt auch endotherm Übergänge beim Trocknen und kalten Verbrennungen verursachen können, wenn erlaubt, in längerer Kontakt mit Haut oder behandschuhten Hände kommen. Um alle damit verbundenen Risiken zu minimieren, sollten nur geringe Mengen zu jeder Zeit bereit sein (< 1 mL wird empfohlen). Nach dem Trocknen ist es bei Raumtemperatur stabil. NC bleiben jedoch kann explosive wenn in großen Mengen vorhanden.
  3. Erstellung von benutzerdefinierten Dampf Kammern
    1. Schneiden Sie ein Stück dickes Löschpapier mit einer Schere groß genug, um unten passen die Hälfte einer standard Kunststoff Petrischale (94 mm im Durchmesser und 3 mm dick).
    2. Schneiden Sie das Papier, so dass einen rechteckige Streifen in der Mitte, die gleiche Größe wie ein Mikroskop-Objektträger, genug überschüssige verlassen, so dass das Papier seine Position in der Petrischale (ergänzende Abbildung1) zu halten.

2. Vorbereitung von Gewebeschnitten

  1. FFPE Gewebe21.
    1. Wählen Sie das gewünschte Gewebe Block und es bei 12 µm Dicke in einem standard Bank montiert Mikrotom und Schwimmer montiert auf der NC ITO Folien vorbeschichtet.
    2. Tauchen Sie die Folien in frischen Xylol, Rest Paraffin für 2 min zu entfernen, und wiederholen Sie den Vorgang ein zweites Mal.
      Hinweis: Wenn der Paraffinblock besonders weit verbreitet ist, das Gewebe relativ klein im Vergleich zu den Paraffinblock ist können die Proben bei 60 ° C zu schmelzen die Mehrheit entfernt vor dem Waschen in Xylol beheizt werden.
    3. Waschen Sie die deparaffinized Proben durch Eintauchen der Folien in einer abgestuften Lösungsmittel Serie: 70 % V/V EtOH/Wasser, 100 % EtOH, Carnoy Flüssigkeit, 100 % EtOH, Reinstwasser und 100 % EtOH. Die Dauer der einzelnen eintauchen sollte 30 s, mit Ausnahme von Carnoy Flüssigkeit, die 2 min dauern muss.
      Achtung: Carnoy Flüssigkeit und Xylol muss gespeichert und verwendet in einer Dampfhaube sind sehr giftig beim Einatmen.
  2. Formalin fixiert gefroren (FFF) Gewebe
    Hinweis: Proben sollten bereits, entsprechend je nach Probentyp eingefroren werden.
    1. Equilibrate des Gewebe-Blocks bei der Betriebstemperatur der Mikrotom für 20 min22.
      Hinweis: Gleichgewichtherstellung Temperatur ist abhängig von der Art des Gewebes.
    2. Abschnitt 12 µm und Tauwetter Mount ein Mikrotom mit Gewebe in den Abschnitten auf einer vorbereiteten NC ITO beschichtet schieben.
    3. Speichern Sie die Folien in einem Vakuum Exsikkator auf der Bank im Dunkeln.
      Hinweis: Proben können für mehrere Wochen unter diesen Bedingungen gelagert werden.
    4. Waschen Sie die Proben in einer abgestuften Lösungsmittel wie FFPE Gewebe (2.1.3) angegeben.
      Hinweis: Gibt es keine Notwendigkeit für einen Xylol Deparaffinisation Schritt, wie die Probe nicht eingebettet ist.

(3) Methylen Crosslink Hydrolyse

  1. Laden Sie die Probe-Folien (FFF oder FFPE) in einer Kunststoff-Folie-Box, die an der Spitze mit 20 Mmol Tris-HCl (pH 8,8) gefüllt ist. Versiegeln Sie die Box und legen Sie sie in ein Wasserbad mit 500 mL Wasser, so dass das Feld, um den Boden berühren. Erhitzen Sie es dann für 15 min bei 120 ° C in einem Schnellkochtopf, der einen Betriebsdruck von 70 kPa erreichen kann.
  2. Entfernen Sie die Folien, abkühlen lassen und bei Raumtemperatur 15 Minuten trocknen lassen.

(4) Gewebe Verdauung

  1. Sobald hydrolysiert, Mantel der Proben mit 10 µL Trypsin-Lösung (1 mg/mL) in Reinstwasser, von Pipettieren 10 µL der Lösung auf den Rand des Abschnitts Gewebe, verwenden die gleichen Pipettenspitze, und ziehen Sie dann das Tröpfchen über die ganze Oberfläche des Gewebes unter Oberfläche Spannung.
    Hinweis: Vermeiden Sie Kratzer auf der Gewebeoberfläche mit der Pipettenspitze und über das Enzym über die Grenzen der Gewebe Kanten zu verbreiten.
  2. Lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur trocknen.
  3. Nach dem Trocknen montieren Sie die Proben innerhalb der Spitze der zuvor gebaute Dampf Kammer (Gewebe nach unten) mit Autoklav Klebeband auf entweder Seite des Schlittens (ergänzende Abbildung2).
  4. Pipette 600 µL einer Lösung mit einem 1:1 V/V-Mix aus 100 % Acetonitril und 50 mM Ammonium Bicarbonat vorsichtig auf dem Löschpapier Finger im Unterteil der Petrischale bis die Finger scheint gleichmäßig feucht sein.
  5. Legen Sie die obere Hälfte der Dampf Kammer auf die untere Hälfte, Sicherstellung der Papier-Finger und Probe-Folie perfekt ausrichten, und Verschließen der Kammer um seinen Äquator mit Paraffin Film.
  6. Lassen Sie die Probe über Nacht in einem 37 ° C Inkubator komplette Verdauung zu ermöglichen.

5. Matrix Beschichtung über Sublimation

  1. Einmal verdaut, wiegen Sie die Beispielfolie 5-stellige mikroanalytische auflegen.
  2. Montieren Sie die Folie auf die Kühlung Finger der Sublimation Vorrichtung und sichern Sie es mit Kupferband, genauso, wie für die Dampf-Kammer (ergänzende Abbildung 3) beschrieben.
    Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Folie gleichmäßig durch den kühlen Finger kontaktiert wird, befindet sich eine Schicht aus Kupferband auf der Unterseite des kühlenden Fingers, die Oberfläche zu ebnen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Folie gleichmäßig gekühlt wird, sogar Abscheidung der Matrix führt.
  3. Legen Sie 300 mg α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (CHCA) Matrix in einer Petrischale Glas am unteren Rand der Kammer und verteilt gleichmäßig auf eine dünne Schicht von Matrix-Kristalle zu erstellen.
  4. Montieren Sie der Sublimator und befestigen Sie die beiden Hälften mit den Hufeisen-Klemme. Unterbrechen Sie die montierte Einheit 15-20 cm über ein Sandbad, indem man sie in einen Metallring verbunden mit einem Stativ bei 220 ° C vorgeheizt.
  5. Schließen Sie die Kammer an die Vakuumquelle, engagieren Sie das Vakuum zu und lassen Sie ihn bis zu ~ 25 mTorr für 5 min zu stabilisieren.
  6. Packen Sie den kühlen Finger an der Spitze mit Eis und fügen Sie 50 mL Wasser hinzu. Lassen Sie das Gerät für weitere 5 min bevor Sie fortfahren zu begleichen.
  7. Senken Sie die Kammer auf der Oberfläche des Sandes, sicherzustellen, dass der Sand vollständig den Boden der Kammer, Kontakte zu, und warten sie 45 min. eine ideale Beschichtung von 0,22 mg/cm2 erstellen
    Vorsicht: Darauf sollte geachtet werden, beim Umgang mit Glaswaren im Hochvakuum, wie Schäden an dem Gerät, während evakuiert, Totalausfall der Glas-Kammer führen kann.
  8. Nach 45 min entfernen der Kammers aus dem Sandbad durch die Erhöhung des Metallringes und Entlüften der Kammers.
    Hinweis: Wenn die Kammer entlüftet, die Folie muss entfernt werden sehr schnell Wasser in der Luft auf der eisigen Finger und Probe-Folie zu kondensieren beginnt.
  9. Entfernen Sie die Folie und wiegen Sie es um sicherzustellen, dass die gewünschte Beschichtung erreicht worden ist.
    Hinweis: Wenn nicht genügend Beschichtung erreicht worden ist, einfach wiederholen Sie Sublimation für die Folie bis die gewünschte Schichtdicke erreicht ist.

(6) Rekristallisation

  1. Sobald sublimiert, montieren Sie die Beispielfolie innerhalb der Spitze der zuvor gebaute Dampf-Kammer, als beschrieben früheren (Gewebe nach unten).
  2. Pipette 600 µL einer Lösung mit einem 1:1 (V/V) Mischung aus 100 % Acetonitril und 0,1 % V/V Trifluoroacetic Säure im Wasser vorsichtig auf das Löschpapier im Unterteil der Petrischale um eine gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten.
  3. Montieren Sie die Kammer, Sicherstellung der Papier-Registerkarte und Mikroskop-Folie perfekt ausrichten, und lassen Sie in einem Inkubator 37 ° C für 1 h.
    Achtung: Nicht verschließen der Kammers.
    Hinweis: Sobald umkristallisiert, die normalerweise gelblich der Matrix sollte weiß, sehen weniger glänzend und scheinen sehr sogar. Dies bedeutet, dass die Rekristallisation korrekt ausgeführt wurde.
  4. Die Probe ist nun bereit für die Analyse.

(7) Instrumentierung

  1. Scannen Sie die Folie in einen Flachbett-Scanner, ein digitales Bild zu erstellen.
  2. Laden Sie die Probe in das Massenspektrometer zu analysieren Sie und dann mit der entsprechenden Software-Plattform.
  3. Analysieren Sie die Proben im positiven Ionen Reflektron Modus mit einem Massenbereich von 750-3.500 Da, mit einer vor Ort Auflösung, die für das gewünschte Ergebnis. In den meisten Fällen 20-50 µm Raster Breite ist ausreichend, aber weniger als 10 µm verwendet15kann.
    Achtung: MALDI UV-Laser sind eine Quelle der ionisierenden Strahlung und sollte nicht direkt einsehbar. Sicherstellen Sie, dass der Laser innerhalb Instrument Abschirmung vor Operation enthalten ist.

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Results

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Wenn korrekt befolgt, produziert dieses Protokoll Bilder, die eindeutig die grobe Morphologie des Gewebes ohne jegliche Kratzer oder andere Deformationen (Abbildung 1). Die ideale Validierung für eine korrekt durchgeführte Probenvorbereitung ist, dass die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen verschiedenen physikalischen Strukturen durch eine Änderung des Moleküls wird angezeigt (Abbildung 2).

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Discussion

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Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Generation der ionizable Molekülsorten ohne Verlagerung des Analyten zu maximieren. Die Schlüsselfaktoren betreffen mit dem gleichen oberstes Prinzip bei der Matrix, die Probe zu verdauen, oder recrystallizing nach Sublimation24Anwendung; nämlich, dass eine sogar Ablagerung von Dampf, Matrix oder andernfalls erstellt und gepflegt werden muss. Pipettieren Lösungsmittel wäscht für Rekristallisation und Verdauung, gleichmäßig unter der Probe verhindert, dass ...

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Disclosures

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt oder kommerzielles Interesse, offen zu legen

Acknowledgements

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Die Autoren möchte Sydney Medical School Foundation und Blues und Stiftung für die Finanzierung Bestandteil dieser Arbeit durch ihre PhD-Stipendien-Programm für die Alzheimer-Krankheit-Forschung und ein ARC Entdeckung Zuschuss (DP160102063), PKW anerkennen.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kryo-MikrotomLeicaCM3050Zur Präparation und Schnittung von Gewebe.
Indium-Zinnoxid-ObjektträgerBruker8237001Zur Präparation und Schnittung von Gewebe.
Coplin DosenSigma AldrichS5516Zur Aufbereitung und Sektion von Gewebe.
SchnellkochtopfKambrookKPR620BSSZur Vorbereitung und Sektion von Gewebe.
SublimatorChem GlassNAFür das Sublimationsverfahren. Ähnlich wie der CG-3038, jedoch war er eine Sonderanfertigung.
SandbadNANAFür das Sublimationsverfahren. Feiner Flusssand in gefalteter Aluminiumfolie, die von außen und nicht von einer bestimmten Firma stammt
Glas-PetrischaleSigma AldrichCLS70165100Für das Sublimationsverfahren.
VakuumpumpeNANAFür das Sublimationsverfahren. Als Ersatzteil von einem alten Massenspektrometer bezogen 
KühlfalleChem GlassCG-4510-02Für das Sublimationsverfahren.
KochplatteJohn MorrisEW-15956-32. Für das Sublimationsverfahren.
Petrischale aus KunststoffSigma AldrichZ717223Für das Sublimationsverfahren.
37°; C InkubatorNANAFür das Sublimationsverfahren. Nicht zutreffend, Inkubator ist unsteril und älter als 30 Jahre 
LöschpapierSigma AldrichP7796Für das Sublimationsverfahren.
Nitrozellulose Sigma AldrichN8395Zum Waschen von Objektträgern.
AcetonSigma Aldrich650501Zum Waschen von Objektträgern.
XylolSigma Aldrich214736Zum Waschen von Objektträgern.
100% EtOHSigma Aldrich1.02428Zum Waschen von Objektträgern.
70% EtOHSigma AldrichNAZum Waschen von Objektträgern. Hergestellt im Labor aus 95% Ethanol
ChloroformSigma AldrichC2432Zum Waschen von Objektträgern.
EisessigSigma AldrichARK2183Zum Waschen von Objektträgern.
Tris HCL pH 8,8Sigma AldrichTRIS-ROFür die proteolytische Spaltung. Pulver auf 1M hergestellt, gefolgt von einer Äquilibrierung mit 32 % HCl auf PH 8,8
Milli Q Ultra-PureWater Sigma AldrichNAFür die proteolytische Spaltung. Die Reinigung erfolgt im eigenen Haus mit einem schonenden Wasseraufbereitungssystem
Ammonium BircarbonatSigma AldrichA6141Für die proteolytische Spaltung.
TrypsinSigma AldrichT0303Für die proteolytische Spaltung. 
CHCA MatrixSigma AldrichC2020Für die Rekristallisation.
AcetonitrilSigma Aldrich1.00029Zur Rekristallisation.
Trifluoressigsäure (TFA)Sigma Aldrich302031Für die Rekristallisation.

References

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