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Eine kinetische Fluoreszenz basierenden Ca2 + Mobilisierung Assay, G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten allosterische Modulatoren zu identifizieren

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DOI:

10.3791/56780

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20. Februar 2018

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1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Beschriebenen zelluläre Assay dient zur Identifizierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4)-interaktiver Agenten, die hemmen oder fördern, kompetitiv oder allosterically, die intrazelluläre Ca2 + Release von CXCR4 Aktivierung initiiert.

Zusammenfassung

G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) sind für die pharmazeutische Industrie von großer Bedeutung, da sie bei vielen menschlichen Krankheiten beteiligt sind und gut validierte für eine therapeutische Intervention Zielvorgaben. Entdeckung von Bleiverbindungen, einschließlich kleine synthetische Moleküle, die speziell die Rezeptor-Funktion hemmen, ist ein erster wichtiger Schritt in der Medikamentenentwicklung und stützt sich auf sensible, spezifische und robuste zellbasierte Assays. Hier beschreiben wir einen kinetische zellularen Assay mit einer fluoreszierenden Anzeige in erster Linie entwickelt, um spezifischen Rezeptor-Antagonisten zu identifizieren, die die intrazelluläre Ca2 + Freigabe, hervorgerufen durch die Aktivierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hemmen, indem seine endogenen Liganden, der CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12). Ein entscheidender Vorteil dieser Methode ist, dass es ermöglicht auch Screening von Verbindungen mit agonistischen Eigenschaften (d.h., Verbindungen, die einen Anstieg der intrazellulären Ca2 + Konzentration in der Abwesenheit von CXCL12 zu entlocken) oder Verbindungen ausgestattet Modulation der Rezeptor-Funktion durch Interaktion mit allosterische Bindungsstellen (d.h., positive und negative allosterische Modulatoren (PAMs und NAMs, beziehungsweise)). Auf der anderen Seite können die Probe auslesen, dadurch behindert zuverlässige Dateninterpretation Autofluorescent Verbindungen beeinträchtigen. Am ehesten kann dieser Assay mit minimalen Anpassungen als ein generisches Medikament Entdeckung Assay für viele andere GPCRs umgesetzt werden, von denen die Aktivierung zu einer Freisetzung von intrazellulären Ca2 führt +.

Einleitung

GPCRs sind eine wichtige Superfamilie Zelle Oberflächenproteine, die Transduktion Signalkaskaden bei extrazellulären Liganden Bindung zu aktivieren. Sie können durch eine Vielzahl von Reizen wie Peptide, Proteinhormone, biogene Amine und Lipide, aktiviert werden die Ergebnisse in der Einleitung der unterschiedlichen intrazellulären Signalwege und schließlich biologischen Reaktionen1,2 . Darüber hinaus GPCRs engagieren sich in vielen, wenn nicht alle Entwicklungs- und physiologische Prozesse und viele menschliche Erkrankungen werden mit dysfunktionalen GPCR-Signalisierung oder Rezeptor-Überexpression in Verbindung gebracht. GPCRs gehören daher die meisten validierten pharmakologische Ziele in Medizin1,3.

In der Regel beginnt ein GPCR Drug Discovery Workflow zellulären Screening-Tests ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen wie kleine Moleküle, monoklonale Antikörper und Peptide, die die Aktivität von bestimmten GPCR modulieren können. In GPCR Arzneimittelforschung, dass viele verschiedene Arten von Tests vorhanden sind, um solche Verbindungen zu suchen sind die meisten davon mit Mitte - zum Hochdurchsatz-Screening Kampagnen kompatibel. Die am häufigsten verwendeten Assays gehören Rezeptor-Bindung-Experimente, Fluoreszenz und Lumineszenz basierte Assays erkennen die Schwankungen der so genannte sekundäre Botenstoffe (z.B. Ca2 +, zyklische Adenosin Monophosphate (AMP)), phänotypische Screening-Assays und β-arrestin Rekrutierung assays4. Die Wahl für eine bestimmte Art von Assay kann von mehreren Faktoren abhängen, sondern richtet sich auch nach Vorwissen über die Signalisierung Eigenschaften einer gegebenen GPCR. Agonisten binden an ein GPCR induziert eine Konformationsänderung katalysieren den Austausch von Guanidin diphosphat (BIP) für Guanidin Triphosphat (GTP) auf die α-Untereinheit des Heterotrimeric G-Proteine. Anschließend die Gα-GTP-Untereinheit distanziert sich von den G-βγ -Untereinheit und beide Untereinheiten werden weitere Signalwege zu initiieren. Hydrolyse der GTP-Molekül und anschließende erneute Vereinigung von Gα- BIP und Gβγ Untereinheiten werden das G-Protein in seine inaktiven Konformation5,6wiederherzustellen. Basierend auf Sequenzähnlichkeit der G-α -Untereinheit werden verschiedene Arten von G-Proteinen definiert (G-s, Gich, GQ, G12/13)7. Signalisierung über die G-α Untereinheit gibt steigen mehrere typische Reaktionen wie z. B. die Erhöhung (über G-s) oder verringern (über Gich) zyklisches AMP Produktions-und intrazellulären Ca2 + Mobilisierung (über G-Q)5 ,7. Gβγ Untereinheiten sind auch in der Lage, intrazelluläre Effektor Wege zu induzieren. Zum Beispiel bei einer Aktivierung der Gich-gekoppelten GPCRs, Gβγ können direkt stimulieren Phospholipase C (PLC-β), Inositol-Triphosphat (IP3) zu produzieren, die die Freisetzung von Ca2 + von intrazellulären Speichern7 auslöst . Nach der Aktivierung der Rezeptor sind GPCRs phosphoryliert von GPCR Kinasen (GRKs) die Interaktion mit β-Arrestins fördert. Dieser Prozess endet G Protein signaling und führt zu Rezeptor Desensibilisierung und schließlich Verinnerlichung. Β-Arrestins sind auch in der Lage, Multi-molekulare komplexe bilden, die andere Signalwege unabhängig von G Protein signaling8auslösen können.

Innerhalb der Unterfamilie der Chemokin-Rezeptoren, die Gich-gekoppelten CXCR4 ist ein GPCR, die viel Interesse als ein viel versprechendes Ziel für die Wirkstoffforschung ausgelöst hat. Angesichts seiner etablierten Rolle als eine große Ko-Rezeptor für Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) 1 wurden virale Eintrag und Infektion, Verbindungen gezielt CXCR4 zunächst als Anti-HIV-Medikament Kandidaten9entwickelt. Vor kurzem hat eine wachsende Zahl von Beweisen auf eine wichtige Rolle für CXCR4 in Tumorgenese und Krebs Metastasen, so dass es eine gut validierte therapeutische Ziel in der Onkologie sowie10hingewiesen. CXCR4 ist hoch in mehr als zwanzig Arten von Krebserkrankungen und Steuerelemente Tumor Zelle überleben, Verbreitung, sowie Migration und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese10ausgedrückt. CXCR4-Antagonisten von verschiedenen chemischen Klassen wurden zuvor beschriebenen11,12, sondern nur das kleine Molekül AMD3100 derzeit für den Einsatz in der Klinik als Stammzell-Mobilisierung Agent verwendet während der Behandlung des Lymphoms zugelassen und Myelom-Patienten13,14. Klinische Studien sind im Gange, die Sicherheit und Wirksamkeit von mehreren anderen CXCR4-Antagonisten in verschiedenen Krankheiten des Menschen, aber mit einem starken Fokus auf Onkologie12bewertet. Angesichts der vielen Anwendungsmöglichkeiten für CXCR4-Antagonisten, ist die Suche nach neuartigen Verbindungen mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften, verbesserte Bioverfügbarkeit oder möglicherweise weniger Nebenwirkungen gerechtfertigt.

Hierin eine kinetische Fluoreszenz basierende zelluläre Assays in erster Linie verwendet, um Bildschirm für Verbindungen in der Lage, Hemmung CXCR4 wird beschrieben. Die fluoreszente Messung dieser Methode basiert auf der vorübergehende Anstieg der intrazellulären Ca2 + Konzentration auf CXCR4 Aktivierung durch die endogene Agonist, der Chemokin-Liganden CXCL12 (früher bekannt als Stromazellen Zelle Faktor 1α abgeleitet (hervorgerufen SDF1-α)), und die möglichen Hemmung dieser CXCL12-induzierte Ca2 + Reaktion durch bestimmte Verbindungen. In diesem Test werden U87 menschlichen Glioblastom-Zellen stabil mit dem Ausdruck des menschlichen Rezeptors CXCR4 verwendet. Zur gleichen Zeit fehlt diese Zellen endogene Expression von CXCR7, einem Verwandten Chemokin-Rezeptor, der auch CXCL1215,16,17 bindet. CXCR7 zuvor auch nachweislich bilden Heterodimere mit CXCR4, werden dadurch modulieren die Signalisierung Eigenschaften dieser letzteren Rezeptor-18. Die Schwankungen der intrazellulären Ca2 + von CXCR4 vermittelt werden durch das Laden der CXCR4 überwacht+ Zellen mit Fluo-2 Acetoxymethyl (AM) Ester, eine Zelle durchlässig hohe Affinität fluoreszierende Ca2 +-bindende Farbstoff. Fluo-2 Uhr ist eine einzelne Wellenlänge fluoreszierende Molekül, das auf 490 angeregt werden kann nm während der Emission Fluoreszenz bei 520 gemessen wird nm. Diese Fluoreszenz Emission erhöht sich auf Ca2 + Bindung mit einem großen Dynamikbereich zwischen Ca2 +-gebunden und ungebunden Zustand. Die Zunahme der Fluoreszenzsignal ist vergänglich, auftreten innerhalb einer Zeitspanne von ein paar Minuten, und wird danach verfallen. Die Peakhöhe der die Fluoreszenz Emission weiterer korreliert mit dem Niveau der Rezeptor-Aktivierung. Der Test selbst erfolgt mit einem Fluoreszenz Mikrotestplatte Reader verfügt über eine intensivierte CCD (ICCD) Kamera, die ein integriertes Pipettierens System besitzt, die Standardisierung der Pipettier Schritte in der Probe ermöglicht (siehe Tabelle der Materialien) . Darüber hinaus ist die gleichzeitige Messung von das Fluoreszenzsignal in alle Vertiefungen der einer Mikrotestplatte ein weiterer wesentlicher Vorteil der Fluoreszenz-Leser, die verwendet wird. Während der erste Teil des Tests die Verbindungen untersucht (z.B. eine Gruppe von kleinen Molekülen in einer festen Konzentration oder in einer Verdünnungsreihe), um die Fluo-2 Uhr hinzugefügt werden geladen CXCR4+ U87 Zellen gefolgt von einer ~ 10 min Inkubationszeit während dessen wird die potenzielle agonistische Wirkung der Verbindungen kontinuierlich in Echtzeit gemessen. Dann die endogenen Agonisten (d. h.CXCL12) wird hinzugefügt, um die Zellen zu einen CXCR4-vermittelten vorübergehenden Anstieg der Ebene der intrazellulären Ca2 +evozieren. In diesem Teil des Tests kann die potenziellen antagonistische Aktivität der getesteten Verbindungen ausgewertet werden. Ein schematischer Überblick über die Assay allgemeinen Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.

Obwohl in erster Linie diese Ca2 + Mobilisierung Assay verwendet worden ist, zu identifizieren und zu bestimmen, die inhibitorische Potenz von wettbewerbsfähigen CXCR4-Antagonisten (d.h., Verbindungen, die verhindern, dass die endogene Agonisten stimulieren den Rezeptor zu binden), es auch -Rezeptor-Agonisten identifizieren können und darüber hinaus Verbindungen, die ihre Funktion durch die Bindung an allosterische Standorten (z.B. Websites, die topographisch unterscheiden sich von den Orthosteric-Bindungsstelle von endogenen Agonisten besetzt) ausüben. Beispiele für die zweite Kategorie von Verbindungen allosterische Agonisten und PAMs und NAMs19,20. Während spezifischen Rezeptor-Antagonisten sowie NAMs CXCL12-induzierte Ca2 + Reaktion hemmen würde, PAMs würde diese Reaktion zu verbessern (siehe auch Diskussion Abschnitt). Obwohl der Test hier speziell CXCR4 Ziele beschrieben, es wird davon ausgegangen, dass diese Methode auf andere GPCRs mit minimalen Optimierung Aufwand mindestens angewendet werden kann wenn sie über die Freigabe des intrazellulären Ca2 +signalisieren.

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Protokoll

Hinweis: Alle in den Abschnitten 1 und 2 beschriebenen Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow Kabinett durchgeführt.

1. Wartung von U87. CD4.hCXCR4 Zellen

  1. Wachsen Sie die Zellen in T75 Kulturflaschen bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator.
    Hinweis: Die in-vitro- Zellinie in diesem Protokoll verwendeten ist ein U87 Glioblastom-Zelllinie stabil Cluster der Differenzierung 4 (CD4) und Menschen zum Ausdruck bringen CXCR4 und wurde zuvor beschriebenen17. Zelle Oberflächenexpression von CD4 und CXCR4 wird kontinuierlich überwacht, durch Durchflusszytometrie und Ausdruck Niveaus im Laufe der Zeit konstant bleiben (~ 100 % CD4+ und ~ 100 % CXCR4+ Zellen). Eine detaillierte Beschreibung der Generation der verwendeten Zelllinie und des Verfahrens Flow Cytometry Rezeptor Ausdruck Ebenen zu untersuchen ist nicht in den Anwendungsbereich dieses Protokolls.
    1. Subkultur-Zellen bei 80-85 % Konfluenz. Lassen Sie alle Reagenzien, Raumtemperatur (RT) vor der Zelle Kultivierung zu erreichen.
    2. Entfernen Sie das konditionierte Kulturmedium aus den Zellen zu und waschen Sie der Zelle monomolekularen Film einmal mit 5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    3. Geben Sie 3 mL 0,25 % Trypsin-EDTA und die Zelle Monolage verteilen Sie gleichmäßig. Dann entfernen Sie das überschüssige Trypsin-EDTA und inkubieren Sie bis zu 5 min bei 37 ° C, bis die Zellen beginnen sich zu lösen.
    4. 10 mL frische komplette Wachstumsmedium (Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) + 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) + 0,01 M HEPES + entsprechende Auswahl Agenten) hinzugeben. Aufschwemmen der Zellen durch sanft auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine steril 50 mL-Tube.
    5. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einer Methode der Wahl. Im Falle von U87 Glioblastoma Zellen im allgemeinen Lebensfähigkeit erreicht ~ 100 %.
      Hinweis: Zellzahlen können auf verschiedene Arten bestimmt werden. Wir verwenden routinemäßig eine automatisierte Analyse Zellsystem basierend auf Trypan blau Färbung (siehe Tabelle der Materialien) nach seinen Standard Umgang mit Verfahren, aber andere Manieren sollte genauso gut funktionieren.
    6. Fügen Sie 2 x 106 oder 3 x 106 (lebensfähige) Zellen zu einem Endvolumen von 25 mL frisches Nährmedium in einem T75 Kultur Kolben und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.
      Hinweis: Wenn 3 x 106 Zellen verwendet werden die Zellen erreichen 80-90 % Konfluenz nach 2 Tagen. Wenn 2 x 106 Zellen verwendet werden, werden sie die gleichen Konfluenz nach 3 Tagen erreichen. Die Wachstumsrate der Zellen sollte zunächst empirisch ermittelt werden, wenn andere Zelllinien verwendet werden.

2. Aussaat der Zellen für die Ca2 + Mobilisierung Assay

  1. Am Tag der Zelle Passagierung (Tag 0), Mantel schwarz-von Mauern umgebene Polystyrol 96-Well Platten mit klaren unten Sie (siehe Tabelle der Materialien) mit 0,1 % Gelatine-Lösung Zellhaftung zu erleichtern.
    Hinweis: Beschichtung von 96-Well-Platten mit Gelatine kann weggelassen werden, wenn vorbeschichtete Platten, die im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien) sind, werden verwendet. Es wird empfohlen, die Verwendung von vorbeschichtete Platten anstelle von Handbeschichtung für jede Zelllinie untersucht bevor Sie fortfahren mit dem Protokoll zu bewerten.
    1. Bereiten Sie Gelatine-Lösung durch Zugabe von 1 g Gelatine, 100 mL PBS, eine 1 % ige Lösung zu erhalten. Von 10 X mit PBS vor weiterem Gebrauch verdünnen. Verbesserung die Löslichkeit von Gelatine Erhitzen der Lösung auf 37 ° C.
    2. Fügen Sie 100 µL 0.1 % Gelatine-Lösung pro Bohrloch der 96-Well-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette. 2 h bei RT inkubieren
  2. In der Zwischenzeit bereiten Sie die Zellen für die Aussaat in den beschichteten 96-Well-Platte.
    1. Lösen Sie die Zellen aus der Kultur-Flasche, Aufschwemmen ihnen frisches Wachstum Mittel- und zählen sie verwenden Trypan blau Färbung Methode.
    2. Spin-down der Zellen in einem 50 mL Tube für 5 min bei 400 X g bei RT
    3. Zellen im frischen Wachstumsmedium Aufschwemmen (DMEM + 10 % FBS + 1 % HEPES, keine Antibiotika) eine Zelldichte von 0,1 x 106 (praktikable) Zellen/mL zu erhalten.
  3. Entfernen Sie die Gelatine-Lösung aus den schwarzen Wänden Platten mit klaren unten durch die Platte umdrehen und auf einem Tuch trocknen. Fügen Sie 200 µL/Well PBS zu entfernen überschüssige Gelatine und die Platte wieder umzudrehen.
  4. 200 µL Zellsuspension (entsprechend 0,2 x 105 Zellen) pro Bohrloch in der Gelatine beschichtet 96-Well-Platte zu verzichten (ab jetzt man diese Platte wird weiter als bezeichnet "Messung Platte").
  5. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2.

3. Laden der Zellen mit einer fluoreszierenden Ca2 + -empfindlichen Farbstoff

  1. Am 1. Tag durchführen der eigentlichen Ca2 + Mobilisierung Assay, beginnend mit dem Laden der gesetzten Zellen mit dem fluoreszierenden Ca2 +-Bindung färben Fluo-2 Uhr.
    1. Bereiten Sie Testpuffer durch Zugabe von 40 mL HEPES (1 M), 200 mL Hank ausgewogen Salzlösung (HBSS, 10 X, kein Phenol rot, kein Natriumbicarbonat). Fügen Sie Reinstwasser einem Endvolumen von 2 L und 4 g Rinderserumalbumin (BSA) hinzufügen. Die BSA über magnetische Rühren auflösen. Anpassen des pH-Werts 7,4 (mit NaOH) und Filtern Sie die Lösung.
      Hinweis: Bei allen folgenden Arbeitsschritten wird der gleiche Puffer, genannt "Testpuffer" verwendet.
    2. Bereiten Sie eine Stammlösung (4 mM Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) des fluoreszierenden Ca2 +-Sensitive färben Fluo-2 Uhr. Vermeiden Sie übermäßige Sonnenbestrahlung ans Licht. Auflösen von 1 mg Fluo-2 Uhr (Molekulargewicht: 1.061 g/Mol) in 235.6 µL DMSO.
    3. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung Fluo-2 Uhr. Mix für eine 96-Well-Assay-Platte 12,5 µL Fluo-2 AM-Stammlösung (4 mM) und 12,5 µL nichtionische Tenside Polyol (z.B. Pluronic f-127) Lösung (20 % Gewicht/Volumen in DMSO, siehe Tabelle of Materials). 11 mL Testpuffer in einem 15 mL Röhrchen 22 µL dieser Mischung hinzufügen. Die Endkonzentration von Fluo-2 Uhr ist 4 µM.
      Hinweis: Nichtionische Tenside als Streuung Agent dient zur Verbesserung der wäßrigen Löslichkeit Fluo-2 Uhr und in der Folge, um Zelle laden zu verbessern. Um Tensid in DMSO solubilisieren, Erhitzen der Probe bei 37 ° C und Mix regelmäßig, um eine homogene Lösung zu erhalten.
    4. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den zuvor gesetzten Zellen in der Messung der 96-Well-Platte, indem die Platte umdrehen und auf einem Papiertuch trocknen.
    5. Fügen Sie 100 µL des Ladens Farbstofflösung pro Bohrloch mit einer Mehrkanal-Pipette und 45 min bei RT im Dunkeln inkubieren.

4. Vorbereitung der 96-Well Polypropylen-Platten mit der Chemokin Liganden CXCL12 oder die Verbindungen untersucht

  1. Erhalten Sie Rundboden-Polypropylen (PP)-96-Well-Platten (siehe Tabelle der Materialien).
    1. CXCL12-Stammlösung zu ermöglichen (1 mg/mL) und der Stammlösung der Verbindungen untersucht, bei RT equilibrate
      Hinweis: Der Stammlösung von CXCL12 bereitet Reinstwasser mit 0,01 % Tween20 ergänzt und als Einweg-Aliquote bei-20 ° C gelagert.
    2. Bereiten Sie eine 5 x konzentrierte Lösung von CXCL12 in Testpuffer (250 ng/mL entspricht 31,25 nM) und eine 5 x konzentrierte Verdünnung von jeder Verbindung (in Testpuffer).
    3. Die Stammlösungen in die entsprechenden 96-Well-Platte nach einem vordefinierten Platte Layout zu verzichten. 75 µL/Well in die Platte mit CXCL12 zu verzichten ("Chemokin-Platte"), 50 µL/Well in die Platte mit den Verbindungen (die "zusammengesetzte Platte") zu verzichten.
      Hinweis: Beide Verbindungen und CXCL12 wird schließlich verdünnt 5 X bei der Abgabe in der Messung-Platte. Es ist auch wichtig, negative Kontroll-Vertiefungen, enthält nur Testpuffer in die zusammengesetzte Platte sowie das Chemokin-Platte aufzunehmen. Auch positive Kontroll-Vertiefungen müssen einbezogen werden (d. h.wells mit CXCL12 in der Chemokin-Platte, aber mit Testpuffer in den entsprechenden Vertiefungen der zusammengesetzte Platte).

5. Protokoll-Einstellungen auf der Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser

Hinweis: Der Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser in diesem Protokoll verwendeten bezeichnet man in der Tabelle der Materialien.

  1. Die Kühlereinheit der Fluoreszenz-Platte-Leser zuerst schalten Sie ein, und schalten Sie dann die Fluoreszenz-Leser selbst. Lassen Sie für ein paar Minuten zu initiieren und die System-Software zu öffnen.
  2. Erstellen der Test-Protokoll unter Verwendung der Drag-and-Drop-Menü, das die folgenden Schritte umfasst:
    1. Wählen Sie im Feld "Einstellungen", "Read_Mode" mit Erregung Wellenlänge: 470-495 nM; Emissionswellenlänge: 515-575 nM.
      Hinweis: Die ausgewählte Wellenlängen eignen sich für die Verwendung mit dem Ca2 +-empfindlichen Farbstoff fluo2.
    2. Sind die "Mix mit TF" (Transfer Flüssigkeit)-Box für automatisches Mischen der Verbindungen in der zusammengesetzte Platte, die an der 2-Quellposition des Gerätes gestellt wird (siehe Punkt 6.4). Wählen Sie 15 µL Lösung in jedem Bohrloch automatisch abgesaugt und dreimal gemischt werden. Die Höheneinstellung der Pipettenspitzen an 20 µL unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Aspiration und Verzicht auf 50 µL/s ein.
      Hinweis: Die Höhe der Pipettenspitzen bezieht sich auf das Volume, das unter die Pipettenspitzen übrig bleibt. Zum Beispiel wenn der Brunnen eine zusammengesetzte Platte 50 µL enthalten, entspricht eine Höhe von 30 µL 20 µL unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche. Das Volumen der zusammengesetzte Lösung getroffen, um zu mischen, die Geschwindigkeit der Vermischung, die Position der Pipette Tipps beim Mischen, und die Anzahl der Zyklen mischen alle eingestellt werden mit der Software.
    3. Im Feld "Fluid übertragen" zu definieren, dass 20 µL der einzelnen Brunnen aus der zusammengesetzten Platte in die Messung Platte übertragen werden. Setzen Sie die Pipettenspitze an 20 µL unter die Flüssigkeit die Oberfläche d.h.Höhe 30 µL während der Aspiration der Verbindungen und Höhe 60 µL bei Abgabe in der Messung-Platte. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Aspiration mit 50 µL/s und die Geschwindigkeit der Abgabe bei 25 µL/s ein.
      Hinweis: Die zusammengesetzte Platte enthält 50 µL der Lösung pro Bohrloch (siehe Schritt 4.1.3), eine Höhe von 30 µL entspricht somit einer Position 20 µL unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche. Die Messung Platte enthält 80 µL Testpuffer pro Bohrloch (siehe Punkt 6.3), so entspricht eine Höhe von 60 µL eine ähnliche Position der Tipps.
    4. Klicken Sie auf "Lesen mit TF". Wählen Sie in der ersten Pause 60 liest (fluoreszierende Messungen) mit einer lesen Sie Intervallzeit 1 S. definieren, das 10 mal gelesen werden vor der Abgabe der Verbindungen in die Messung Platte aufgezeichnet, und 50 liest danach. Definieren Sie das zweite Intervall mit einer lesen Sie Intervallzeit von 30 s und 18 mal gelesen.
      Hinweis: Während dieses Schrittes Fluoreszenz wird gemessen kinetisch (in definierten Zeitabständen) für ~ 10 min insgesamt.
    5. Gehören Sie die Schaltfläche "Wash-Tipps" im Protokoll dreimal. Innerhalb jeder Waschschritt, wählen Sie die flüssige Art: Flüssigkeit (Reinstwasser) oder Flüssigkeit B (70 % Ethanol), die Anzahl der Waschgänge (1), die Pumpe Geschwindigkeit (schnell), und die Anzahl der Hübe (5) bei jedem Schritt zu waschen.
      Hinweis: Während der ersten und letzten ist waschen Schritt Flüssigkeit A, während das zweite waschen Schritt Fluid verwendet B verwendet wird.
    6. Gehören Sie die "Pause-Pipette"-Funktion. Legen Sie die Pipette Pause für 300 s.
      Hinweis: Durch die Einbeziehung dieser Schritt im Protokoll, die Pipette-Kopf, der in der Fluoreszenz-Platte-Lesegerät integriert ist, für 5 min pausiert bevor Sie fortfahren des Protokolls.
    7. Gehören die "Mix mit TF" Kontrollkästchen erlauben automatische Vermischung der CXCL12-Lösung in der Chemokin-Platte, die an der Quelle 3 Position des Geräts positioniert werden (siehe Punkt 6.4). Wählen Sie 15 µL Lösung in jedem Bohrloch automatisch abgesaugt und dreimal gemischt werden. Während der Aspiration und mischen positionieren Sie die Pipette Tipps 20 µL unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche. Die Geschwindigkeit der Aspiration und Dosierung liegt bei 50 µL/s.
      Hinweis: Ähnlich wie bei Schritt 5.2.2, diese Parameter eingestellt werden.
    8. Im anschließenden "Fluid übertragen" Feld definieren, dass 25 µL voneinander gut von der Chemokin Platte in die Messung Platte übertragen werden. Position 20 µL Tipps unten die Flüssigkeit die Oberfläche d.h.auf Höhe 55 µL bei Aspiration aus der Chemokin-Platte, die 75 µL/Well enthält (siehe Schritt 4.1.3), und an Höhe 80 µL bei Abgabe in der Messung-Platte. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Aspiration mit 50 µL/s und die Geschwindigkeit der Abgabe bei 25 µL/s ein.
    9. Gehören Sie die "Read mit TF"-Taste. Wählen Sie in der ersten Pause 145 liest mit einer lesen Sie Intervallzeit 1 S. definieren, das 5 mal gelesen werden vor der Abgabe von CXCL12 in die Messung Platte aufgezeichnet, und 140 liest danach. Definieren Sie das zweite Intervall mit einer lesen Sie Intervallzeit von 6 s und wählen Sie 20 mal gelesen.
      Hinweis: Zusammengenommen, während das gesamte Protokoll 243 mal gelesen (fluoreszierende Messungen) erfasst: 78 bei Schritt 5.2.4 und 165 während Schritt 5.2.9.
    10. Ähnlich wie bei Schritt 5.2.5, gehören die "Wash Tipps"-Taste dreimal im Protokoll.
      Hinweis: Dieser Schritt am Ende des Protokolls einschließlich ermöglicht, dass die Spitzen wieder verwendet werden können, ein weiterer Test durchführen, ohne die Spitzenwechsel.
  3. Stellen Sie die Temperatur des Gerätes bei 37 ° C, indem Sie auf die Taste "Set Bühne Temperatur" und Auswahl von 37 ° C.

6. Ausführung des Fluoreszenz-Tests

  1. Nach der Messung hat Platte mit Ladepuffer 45 min inkubiert (siehe Schritt 3.1.5), entfernen Sie den Puffer durch die Platte umdrehen und auf einem Tuch trocknen.
  2. Waschen Sie die gesetzten Zellen durch Zugabe von 150 µL/Well Testpuffer und 2 min inkubieren.
  3. Entfernen Sie den Puffer wieder durch Umklappen der Plattenrandes. Fügen Sie 80 µL/Well Testpuffer mit einer Mehrkanal-Pipette.
  4. Setzen die Platten in das Gerät an der entsprechenden Position: die zusammengesetzte Platte an der 2-Quellposition, der Chemokin-Platte an der Quelle 3-Position, und die Messung Platte an die Leseposition. Setzen Sie eine Schachtel mit schwarzen Spitzen an der Quelle 1-Tipps-Position. Schließen Sie das Gerät Tür und 5 min inkubieren Sie, bevor Sie fortfahren des Protokolls.
  5. Klicken Sie auf "Protokoll-Signal-Test", um den Hintergrund relativ leichte Einheiten (RLUs) und Fluoreszenz Varianz über die Platte zu bestimmen. Ein neues Fenster öffnet sich. Wählen Sie "Test Signal".
    Hinweis: Während dieses Schrittes Hintergrund RLUs ICCD Kamera, richten sich nach der im Fach Optik der Fluoreszenz-Lesegerät integriert ist. Diese RLUs ergeben sich aus der Anregung von Ca2 +-empfindlichen Farbstoff (Fluo-2) durch Leuchtdioden (LEDs) (LED output-470-495 nm Wellenlänge). Werte von 8.000-10.000 RLUs eignen sich gut für diese Anwendung. RLUs können, falls erforderlich, durch eine Änderung der Erregung Intensität (Wählen Sie EXC Intensität) oder das Kamera-Tor (Wählen Sie Tor geöffnet) angepasst werden. Die Varianz über die Platte sollte idealerweise weniger als 7,5 % sein.
  6. Wählen Sie "Update", wenn Hintergrundwerte von 8.000-10.000 RLUs erhalten werden. Speichern Sie die wichtigsten Protokoll durch Klicken auf die Schaltfläche "Speichern".
    Hinweis: Auf diese Weise werden die Einstellungen aus der Protokoll-HUP-Test zum wichtigsten Protokoll übertragen.
  7. Führen Sie Tests durch Drücken der Schaltfläche "Ausführen".

(7) Datenanalyse und Qualität

  1. Nachdem der Test abgeschlossen ist, öffnen Sie die "Analyse"-Box, in der System-Software.
    1. Gehen Sie zu "Korrekturen konfigurieren" und wählen "Antwort über Base Line". Grundlinie 1 zur Messung 1 und Ende der Messung 5 beginnen zu definieren; die mittlere Fluoreszenz wird in jede Vertiefung zwischen 1 und 5 Messungen berechnet.
      Hinweis: Alle weitere Messungen von einem bestimmten gliedern sich gut durch diese Brunnen-spezifische Basis Linie 1.
      1. Grundlinie 2 Messung 78 bis 83 Messung starten zu definieren (CXCL12 entfällt nach der Messung 83; wieder die mittlere Fluoreszenz wird berechnet in jedem gut zwischen Messung 78 und 83 und dieser Korrekturfaktor gilt für alle Messungen nach Messung 83).
    2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "anzeigen als Prozentsatz" und "Subtrahieren Hintergrund".
    3. Gehen Sie zu "Kinetische Reduktion konfigurieren". Um die hemmende Wirkung von Verbindungen auf die CXCL12-induzierte Ca2 + Antwort auszuwerten, wählen Sie Max-Min-Messung 84 (d. h., die erste Messung nach dem CXCL12 abgegeben wird) auf 243 (d.h. die letzte Messung) ab.
      Hinweis: Durch die Wahl Max-Min des Unterschied zwischen der minimalen und maximalen Reaktion über Basislinie zwischen 84 Messung und Messung ist 243 berichtet. Wenn die Max-Min beginnend zwischen Messung 11 und Messung 78 gewählt wird, wird der Unterschied zwischen der minimalen und maximalen Reaktion über Baseline relativ zur Grundlinie 1 gemeldet. Dieser Wert kann verwendet werden, zur Analyse der potenziellen agonistischen Aktivität der Verbindungen, siehe Diskussion).
    4. Die Daten werden in der System-Software visualisiert werden. Bei Bedarf exportieren Sie die unformatierten Daten für weitere Analysen und Visualisierung in anderen gemeinsamen Analyse-Software-Paketen.

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Ergebnisse

Die Wirkung von CXCL12-Stimulation auf die intrazelluläre Ca2 + Mobilisierung in U87. CD4.CXCR4+ und U87. CD4-Zellen wurde mit Ca2 + Mobilisierung Assay bewertet. Statt 20 µL Testverbindung, die normalerweise während der ersten Pipettieren Schritt des Protokolls (Abbildung 1) hinzugefügt werden würden, Testpuffer wurde hinzugefügt, um die Fluo-2 AM U87 geladen. CD4.CXCR4+ Zellen in der Messung-Platte. Während der zw...

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Diskussion

Die Ca2 +-Mobilisierung Assay beschriebenen hat zuvor gezeigt, dass ein wertvolles Instrument zu identifizieren und zu charakterisieren, targeting CXCR417-Rezeptor-Antagonisten. Es ist, jedoch erwartet, dass diese Methode im Allgemeinen kann für eine große Gruppe von anderen GPCRs, die eine cytosolische Ca2 + Version auf ihre Aktivierung auslösen angewendet werden wie für den entsprechenden Chemokin-Rezeptor CCR5 dargestellt. Im Falle von CCR5 genau die gleichen Versuchsbedin...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten Eric Fonteyn und Geert Schoofs für ausgezeichnete technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde unterstützt von der KU Leuven (keine zu gewähren. PF/10/018), den Fonds Voor Wetenschappelijk Onderzoek-(FWO, Nein zu gewähren. G.485.08), und die Fondation Dormeur Vaduz.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fluo-2 AMAbcamab142775fluoreszierender Ca2+-empfindlicher Farbstoff
Pluronic F-127SigmaP2443-250GPluronsäure
GelatineSigmaG9391
AMD3100SigmaA5602-5 mgspezifischer CXCR4-Antagonist
MaravirocArt Geschenk des, CCR5-Antagonist
Chemokin-Ligand CXCL12PeproTech300-28A
Chemokin-Ligand CCL5PeproTech300-06
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaA1933-25G
Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)Gibco (Life Technologies)41965-039
HBSS (10 x), Calcium, Magnesium, kein PhenolrotGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1 M)Gibco (Life Technologies)15630-056
Trypsin-EDTA (0,25 %), PhenolrotGibco (Life Technologies)25200-056
Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Falcon Röhrchen, 50 mLGreiner Bio-One227 261
Gewebekulturflasche (T75)Corning353024
Schwarze Platte, 96 Well, klarer Boden, mit DeckelCostar/Fisher Scientific10530753Assay Platte (96 Well), für die Zellaussaat
Polypropylen (PP) PlattenThermo Scientific (VWR)732-2661Platten zur Vorbereitung der Compoundplatten und des Chemokins Platten mit rundem Boden
FLIPR Tetra zelluläres Screening-System für den hohen DurchsatzMolecularDevices Fluoreszenzplatten-Reader mit integriertem Pipettierkopf und ICCD-Kamera
FLIPR Tetra LED Modul 470 - 495 nmMolecular Devices0200-6128Leuchtdioden zur Anregung des fluoreszierenden Ca2+-empfindlichen Farbstoffs
FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 nmMolecular Devices0200-6203Emissionsfilter, kompatibel mit dem Fluoreszenzfarbstoff
FLIPR Tetra 96 HeadMolecular Devices0310-453696-Well-Pipettierkopf, integriert in den Fluoreszenzplatten-Reader
ScreenWorksMolecular DevicesSoftwarepaket für die Datenanalyse und Visualisierung auf dem FLIPR Tetra
Vi-CELLBeckman CoulterZellviabilitätsanalysator
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrol Mikrotiterplatten, mit Deckel, sterilCorning3340Vorbeschichtete 96-Well-Assay-Platten, die eine Alternative für die manuelle Beschichtung der Assay-Platte darstellen können.
antiretroviralen Medikaments AnorMed

Referenzen

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GPCR AssayCalcium Mobilisierungfluoreszenzbasierter AssayCXCR4 Antagonisten ScreeningGPCR Arzneimittelentwicklungkinetischer Fluoreszenz Assayintrazellul re CalciumfreisetzungDetektion allosterischer ModulatorenIdentifizierung von Agonisten und AntagonistenCXCL12 Stimulation

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