Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Gen-silencing murine NK-Zellen durch ein Feeder-freie Unterscheidung System für mechanistischen Studie in Vitro und in Vivoin Serienfertigung herzustellen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Natürliche killer (NK) Zellen des angeborenen Immunsystems gehören und sind eine Erstlinien Anti-Krebs-Immunabwehr; aber sie werden in den Tumor Mikroumgebung unterdrückt und der zugrunde liegende Mechanismus ist noch weitgehend unbekannt. Das Fehlen einer einheitlichen und zuverlässigen Quelle von NK-Zellen begrenzt den Forschungsfortschritt NK Zelle Immunität. Hier berichten wir über eine in-vitro- System, die hohe Qualität und Quantität der Knochenmark-abgeleitete murinen NK-Zellen unter einem Feeder-freie Zustand zur Verfügung stellen kann. Noch wichtiger ist, zeigen wir auch, dass SiRNA-vermittelten Gen-silencing erfolgreich die E4bp4-abhängige NK Zelle Reifung hemmt durch den Einsatz dieses Systems. Somit ist diese neuartige in-vitro- NK-Zelle Unterscheidung System eine Biomaterial-Lösung für Immunitäts-Forschung.
Einleitung
Tumorprogression ist weitgehend abhängig von den Tumor Mikroumgebung1,2, einschließlich Host abgeleitet Immunzellen, z.B., NK-Zellen. Mehrere Studien gezeigt, dass die intratumorale NK-Zellen mit dem Tumor Progression3,4negativ korreliert sind. Klinische Studien zeigten darüber hinaus, dass NK-Zell-Adoptiv-Therapie eine mögliche Strategie für Krebs5,6,7,8,9 ist. NK-Zell-basierte Kre....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Das Protokoll für Erhalt und Differenzierung Knochenmark stammenden NK Zellen (BM-NK) basiert auf zuvor veröffentlichten Methoden20,21,22. Alle Verfahren mit Mäusen wurden durch das Tier Ethik experimentelle Ausschuss (AEEC) an der Chinese University of Hong Kong genehmigt.
1. Vorbereitung des OP9 bedingte Medium
- Kultur die murinen Stroma-Zell-Linie OP9 in Alpha-MEM mit 20 % FBS, 100 U/mL Penicillin G und 100 µg/mL Streptomycin, bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre von Luft/CO2 (95 %: 5 %).
- Zählen Sie die Zellen mit ei....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Repräsentative Ergebnisse nach dem beschriebenen Protokoll. Insgesamt Knochenmarkzellen Aussetzung wurden unter dem Zubringer-freie Unterscheidung System für 11 Tage kultiviert; deutlichen Anstieg der Proliferationsrate wurde von Tag 7 im Vergleich mit der Anzahl der gesamten Zellen am Tag 0 (Abb. 1A) beobachtet. Reife NK-Zellen mit hohen Kernenergie bis zytoplasmatischen Verhältnis und Granulat-reiche Zytoplasma Morphologie wurden von Tag 6 .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
In der vorliegenden Arbeit haben wir eine neuartige Methode zur Herstellung von Knochenmark stammenden murinen NK Zellen in Vitrobeschrieben. Die Zelle Zuführung in das ursprüngliche System21,22 wird erfolgreich durch das Medium bedingte OP9 Zellen, die weitgehend die Stabilität des Systems der Differenzierung erhöht ersetzt. Darüber hinaus kann das System hohen Menge produzieren und Reinheit der Reife NK Zellen in Vitro als auch in Vivo
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt durch die Research Grants Council of Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) und der Innovation und Technology Fund of Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), direkte Finanzhilfe für Forschung-CUHK (2016.035) und Hong Kong Gelehrter Programm.
H.-YL konzipiert und betreut alle Experimente und trugen zum Manuskript Vorbereitung. Uhr-k.t. Experimente durchgeführt, analysiert Daten und trugen zum Manuskript Vorbereitung. P.C.-T. T., D.S.-F.C., j.s.-C., H., f.-M.W., und G.-YL tierische Proben gesammelt und im Tierversuch teilgenommen. J.s., X.-R.H. und K.-f.t. zum Manuskript Vorbereitung beigetragen.<....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| OP9 Zelllinie | ATCC | ATCC® CRL-2749&etagen; | |
| MEM α, ohne Nukleoside | Gibco | 22561021 | |
| Fötales Rinderserum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010049 | |
| rekombinante Maus IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| rekombinante Maus SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| rekombinante Maus Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Rekombinant Maus IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfektionsreagenz | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixierungspuffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Färbepuffer für die Durchflusszytometrie | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-konjugierte Anti-Maus CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-konjugierte Anti-Maus NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense-Kontrolle (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA gegen Maus E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& prim; |
Referenzen
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on the....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
