Summary
Kapillar isoelektrisk fokusering er en antistof-baseret, ultrasensitive, høje overførselshastighed teknik, muliggør detaljeret karakterisering af proteiner og deres isoformer fra ekstremt lille biologiske prøver. I det følgende beskrives en protokol til påvisning og kvantificering af specifikke proteiner og deres isoformer i en automatiseret og robotiserede måde.
Abstract
Immunoblotting er blevet en rutinemæssig teknik i mange laboratorier til protein karakterisering af biologiske prøver. Følgende protokol giver en alternativ strategi, kapillær isoelektrisk fokusering (cIEF), med mange fordele i forhold til konventionelle immunoblotting. Dette er en antistof-baseret, automatiseret, hurtig og kvantitativ metode, hvor en komplet western blotting procedure finder sted inde i en ultratynde kapillær. Denne teknik kræver en gel til at overføre til en membran, stripning af klatter, eller x-ray film, der er typisk kræves til konventionelle immunoblotting. Her, proteiner er adskilt i henhold til deres charge (isoelektriske punkt, pI), bruger mindre end en microliter (400 nL) af total protein lysate. Efter elektroforese, proteiner er immobiliseret på de kapillar vægge af ultraviolet lys behandling, efterfulgt af primære og sekundære (peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret) antistof inkubation, hvis bindende opdages gennem forbedret kemiluminescens (ECL), generere et lyssignal, som kan være fanget og optaget af et kamera, charge - sammen enhed (CCD). Det digitale billede kan analyseres og kvantificeret (toparealet) ved hjælp af software. Denne høje overførselshastighed procedure kan håndtere 96 prøver ad gangen; er meget følsomme, med protein påvisning i pikogram-området; og producerer meget reproducerbare resultater på grund af automatisering. Alle disse aspekter er meget værdifulde, når antallet af prøver (f.eks., vævsprøver og biopsier) er en begrænsende faktor. Teknikken har bredere applikationer samt, herunder screening af narkotika eller antistoffer, biomarkør opdagelse og diagnosticering.
Introduction
Kapillar isoelektrisk fokusering (cIEF) er en automatiseret, kapillær-baseret immunassay, der løser proteiner på grundlag af deres afgift1,2,3. Det er meget reproducerbare og i stand til at løse proteiner og deres post-translationally modificerede isoformer hurtigt og kvantitativt. Det præsenterer en alternativ til konventionelle metoder såsom western blotting. Mens western blotting er meget godt for at bekræfte tilstedeværelsen af rigelige proteiner i lettilgængelig prøver; variation, tidsforbrug og nøjagtig kvantificering alle nuværende udfordringer, især ved behandlingen af biologiske vævsprøver. Faktisk variation er en iboende problem i western blotting, da der er mange trin involveret, såsom lastning og drift af SDS-PAGE geler, overførsel af proteiner på membranen, inkubation med forskellige reagenser (fx., primære og sekundære antistoffer, ECL), og udvikling op på X-ray film4. I øjeblikket er at forbedre den western blotting teknik med gennemførelsen af digital optagelse af kemiluminescerende signaler (digital westerns). For nylig, en automatiseret western blotting system er blevet udviklet, nemlig den kapillar vestlige, som er en mere hænder-omkostningsfrit og gel-fri system. Hele analysen er automatiseret efter indlæsning af en prøve plade (prøver med alle nødvendige reagenser) ind i systemet3,4. Instrumentet vil udføre alle trinene såsom protein adskillelse, immobilisering af proteiner på kapillar væggen, antistof inkubationer, vasker mellem forskellige trin, og udvikling og kvantificering af kemiluminescens-signaler. Således giver cIEF proceduren præsenteres her højere opløsning og følsomhed.
Denne metode er følsomme, som signaler kan genereres og kvantificeres fra picogram proteiner1. Den høje følsomhed med fremragende reproducerbarhed gør denne teknologi meget nyttigt til analyse af kliniske prøver. Det kan detektere samt skelne post translationel ændring (f.eks. forskellige fosforyleres protein isoformer) af proteiner. Denne teknologi held har været anvendt til at dissekere forskellige signaling veje4,5 i kliniske undersøgelser med henblik på at udvikle nye therapeutics i kræft3, og det har stort potentiale for protein biomarkør og drug discovery .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle kultur, Stimulation og Lysis
Bemærk: Denne metode kan bruges med mange celletyper. For at illustrere metoden, beskrevet et eksempel på brug af menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs).
- Kultur HUVECs på gelatine-belagt, 10 cm petriskåle i endothelial celle basal medium med passende tilskud (Se Tabel af materialer), og som også indeholder 5% FCS, epidermal vækstfaktor (5 ng/mL), vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF: 0,5 ng/mL), grundlæggende FGF (10 ng/mL), insulin-lignende vækstfaktor (20 ng/mL), hydrocortison (0,2 µg/mL) og ascorbinsyre (1 µg/mL).
- Sulte celler natten med endotel celle basal medium suppleret med 1% FCS og ingen vækstfaktor supplement.
- Opsug alle medium, tilsættes 2 mL i endothelial cellekulturmedium uden vækstfaktorer (sult medium) i én skål (kontrol), hvorefter der tilsættes 50 ng/mL VEGF i 2 mL af sult næringssubstratet i en anden skål for 7 min.
- Opsug mediet og vaske cellerne 2 gange med 10 mL stuetemperatur PBS.
- Sikre Petriskålene er på is og holde dem der fra dette trin og fremefter.
- Tilsæt 250-400 µL af is kold lysering buffer (Bicine/kæbe; Se Tabel af materialer) der indeholder vandige protease hæmmer mix og DMSO hæmmer mix (fosfatase hæmmere; Se Tabel af materialer) til hver 10 cm plade. Swirl plade for at sikre ordentlig dækning og holde den for 10 min på is.
Bemærk: Den endelige koncentration af protease og DMSO hæmmer blanding skal være 1 x. - Skrab cellerne fra skålen med en celle skraber og overførsel til en pre kølet mikrofuge tube. Pipetteres op og ned 5 gange til lyse celler.
- Kort der sonikeres celler ved 4 ° C. Angiv sonikator som følger: antal cyklusser = 5, power = lav, på = 5 sek, OFF = 30 s. Dette trin er inkluderet til at bryde nukleinsyrer og ikke til lyse celler.
Bemærk: Sonikering skal være mild til at forhindre denaturering af proteiner. - Vortex rør for 5 s (ikke konstant), 2 s på et tidspunkt (3 gange), og holde på is.
- Afklare lysate ved centrifugering ved 14.000 x g i 15 min. ved 4 ° C, derefter straks overføre supernatanten til en ren pre kølet mikrofuge tube.
- Måle proteinkoncentration ved hjælp af en Bicinchoninic syre (BCA) protein assay kit4.
- Gøre 10 µL delprøver, snap fryse i tøris eller flydende nitrogen, og opbevares ved-80 ° C indtil brug.
2. Mix Prøveforberedelse (beregning for 150 µL prøve Mix)
- Først, forberede en prøve fortynder mix ved at tilføje 1 µL af DMSO hæmmer mix (stock 50 x) og 2 µL for proteasehæmmere (stock 25 x) til 47 µL af prøven fortyndingsmiddel (Se Tabel af materialer), således at den endelige koncentration af DMSO hæmmere og proteasehæmmere bliver 1 x. Næste, fortyndes protein lysates ved hjælp af prøve fortynder mix for at opnå de ønskede koncentrationer (Se trin 2.3).
- Forbered ampholyte/stige/protease hæmmer/DMSO hæmmer mix ved at tilføje 3.325 µL standard stigen (Se Tabel af materialer; lager 60 x), 6 µL af protease inhibitor (25 x), 3 µL af DMSO (50 x) hæmmer til 137.675 µL ampholyte premix (Se tabel af Materialer). Vortex tube mindst 15 s samlede, 5 s ad gangen (3 - 4 gange), og holde på is.
- Bland løsninger fra trin 2.1 og 2.2 i forholdet 1:3, således at de endelige koncentrationer af DMSO, proteasehæmmere og pI standard stigen bliver 1 X, og proteinerne i kapillar nå frem til de endelige ønskede koncentrationer (f.eks.50 µg/mL blev brugt til Figur 2).
Bemærk: Proteinkoncentration i kapillær og godt er det samme. - Indlæse 10 µL af prøven blanding i passende brønden, ifølge 384-godt plade assay skabelonen layout (Se trin 3 og figur 1) og holde pladen på is.
- Fortynd primære (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) og sekundære antistoffer (1: 300) med antistof fortyndingsmiddel (Se Tabel af materialer) og tilsæt 10 µL af primære og 15 µL af sekundære antistoffer i hver brønd.
Bemærk: generelt højere koncentration af antistoffer er nødvendige for cIEF assays i forhold til konventionelle western blotting. - Bland Luminol og peroxid XDR (forholdet 1:1; Se Tabel af materialer) sammen og afpipetteres 15 µL i hver brønd.
Bemærk: Bland disse løsninger frisk hver gang før brug og holde på is. - Når prøver og reagenser, der alle er pipetted i pladen, centrifugeres plade på 2.500 x g i 10 min. ved 4 ° C til spin ned væsken og fjerne boblerne. Hvis bobler stadig eksisterer, fjerne dem manuelt ved hjælp af en tynd pipette tip.
Bemærk: Ilæg ikke mere end 20 µL af prøven eller reagenser pr. brønd; ellers, instrument-pipette kan ikke vaskes ordentligt. Sørg for at følge brugsanvisningen fra producenten til at forberede alle reagenser.
3. at designe en ny analyse skabelon med systemsoftwaren (figur 1)
- Åbn system-software og klik på "ny" fra menuen filer.
- Gå til vinduet layout og tildele lokationer til reagenser og prøver i en 384 godt-plade. Brug til et maksimum på 96 brønde pr. 384-godt plade.
- Foretage en reagens tildeling ved at klikke på et godt overalt i blokken. Vælg en række blok af 12 brønde. Brønde, fxfra 1-12 eller 13-24, er som standard tildelt som en blok.
- Gå til layout rude værktøj advokatstanden og indsætte enten en tom række blok eller en prøve, primær, sekundær eller luminol række blok. Hver blok er tildelt en anden farve, så de er nemme at skelne.
Bemærk: Når du klikker på en brønd, en sort kant kan ses rundt om blokken, hvor den nye blok vil blive indsat i ruden. En række blok kan også blive slettet. - Gå til ruden protokol og vælg et reagens placering i pladen. Derefter, klik på en celle i kolonnen prøve og vælg reagenset i rullemenuen.
- I denne samme mode, Vælg reagens steder for den primære, sekundære, og luminol for hver cyklus.
- Klik på cellerne, en ad gangen, i kolonnen primær eller sekundær antistof og ændre inkuberingstider, hvis nødvendigt.
Bemærk: Posten noter for hver cyklus kan også tilføjes. - Tilføje cyklusser ved at klikke på knappen 'Tilføj' i afsnittet protokol. 1 cyklus, 4 cyklusser eller alle cykler (højst 8 cyklusser kan føjes til protokollen).
Bemærk: Det er muligt at kopiere og indsætte cyklus oplysninger i dette trin: Vælg en cyklus, gå til edit, og kopier og Indsæt. - Angiv oplysninger om prøven, såsom identiteten af de primære og sekundære antistoffer, deres katalog numre og fortyndinger, osv., i ruden skabelon. Dette er et valgfrit trin, der er nyttige under den efterfølgende køre analyse.
- Gem filen ny assay. Før du klikker på knappen 'start', hurtigt at kontrollere layoutet for at sikre at alt er korrekt.
4. protokollen for cIEF Instrument indstilling
- Angive kapillær isoelektrisk fokusering elektroforese adskillelse betingelser. Disse bør være 15.000 µW og 40 min, og UV immobilisering tid bør være 80 s. Men UV immobilisering tid kan indstilles i intervallet 80-140 s, og muligvis skal være optimeret til protein af interesse.
Bemærk: Et tidspunkt for UV immobilisering kan indstilles for hver cyklus, men ikke for hver kapillær. - Sæt vask 1 til 2 vasker, for 150 s hver vask (standard) og primære antistof inkubation i 120 min.
- Sæt vaske 2 til 2 vasker, for 150 s hver vask (standard) og sekundær antistof inkubation i 60 min.
- Indstille vask 3, som bør være 2 vasker, for 150 s hver vask (standard).
- Indstille eksponering gange når kemiluminescens vil blive opdaget; disse bør være 30, 60, 120, 240, 490 og 960 s. Alle trin (1-8) vil blive gennemført i en enkelt kapillær.
5. køre filen Assay
- Når alt er klar, skal du klikke på start til at begynde at køre. Softwaren vil bede dig om at fjerne affald, for at genopfylde vandet og føje anolyte og catholyte til bakken ressource til at tilføje wash buffer under boksen kapillær og endelig at indlæse pladen i den afkølede prøve bakke.
Bemærk: Fjern låget fra boksen kapillær, men tag ikke låget fra assay plade. Låget fra pladen kan fjernes automatisk af instrumentet, når det er nødvendigt. Dette medvirker til at forhindre reagens fordampning. - Et par minutter efter flugt er startet, et instrument statuslinjen vises på computerskærmen. Statusmeddelelser og statuslinjer kan ses svarer til instrumentets nuværende fase.
Bemærk: I første omgang, instrumentet vil tjekke hvis alt er korrekt, før du fortsætter til afpipetteres anolyte og catholyte i bakken adskillelse, picking den første blok af 12 kapillærer, at fjerne låget på pladen og placere prøver fra prøven pladen ind i kapillærerne, og så endelig i adskillelse kammer til elektroforese. - Klik på run Resumé skærmen for at se to ruder: status og adskillelse. Brugerne kan se den køre fremskridt, og film af separation (12 kapillærerne af hver cyklus) kan lagres, når trinnet elektroforese af hver cyklus er afsluttet. At observere elektroforese adskillelsen i en kapillær, spille adskillelse filmen for at kapillær ved at klikke på den ønskede cyklus og derefter afspilningsknappen i kontrolpanelet.
- Kør filen kan gemmes automatisk ved afslutningen af flugt.
6. analysere Data (figur S1)
- Åbn filen køre og vælg fanen analyse skærmen. I Figur S1Aer viste (toppe) i prøven grafen data fra den valgte kapillær (dvs., 4th kapillær fra cyklus 1).
- Klik på Rediger og derefter analyse (Figur S1B). På dette stadium, kan brugere ændre rækken pI, anvende passende pI standarden for en given eksperiment, tilføje en peak pasform og tilføje et peak navn.
Bemærk: Når du bruger en pH 5-8 ampholyte premix (som er tilfældet her), den anbefalede standard stigen til at bruge er en med fluorescently mærket peptider med pIs 4.9, 6.0, 6.4, 7.0 og 7.3, og når du bruger en pH 3-10 premix, anbefalede stigen er en med pIs af 4.0 , 4.9, 6.0, 6.4 og 7.3. 2 - Resultaterne vises i fanen toppe; de værdier, der vises for prøverne er holdning, pI, peak højde og område, % område, peak bredde og signal til støj (S/N) (Figur S1C). Vælg hvilke data der skal bruge, og eksportere data til yderligere analyse.
NOTE: Data kan kun blive udført efter mærkning peak (Figur S1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design af en ny analyse: En assay plade layout er vist i figur 1A. Maksimalt, kan 96 brønde bruges fra 384-godt plade i blokke af 12 brønde for hver betingelse (antistof). Hver blok af 12 brønde kan starte enten fra A1-A12 eller A13-A24. Farvekodede rækker tillader en at skelne prøver eller reagenser fra hinanden. I analysen skabelon (figur 1B), relevante oplysninger for at kan pågældende analysen lagres, som kan bruges i senere faser af resultat analyse. Figur 1 c viser Resumé af protokollen.
Påvisning af fosforyleres og unphosphorylated ekstracellulære regulerede kinase (pERK1/2 og ERK1/2) protein i HUVEC lysate stimuleres med VEGF: Generelt er indlæg translationally modificerede proteiner, såsom fosfoproteiner, vanskelig at opdage på grund af deres lave antal og forbigående karakter, og en mangel på specifikke antistoffer. Vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) stimulation efter serum sult aktiveres receptoren tyrosin kinase (VEGFR2) der fører hen til aktivere MAPK pathway og resultater i ERK fosforylering. For eksperimenter ved hjælp af HUVECs, kan lysates fra celler stimuleret med eller uden VEGF i 7 min. bruges, som vist i figur 2. Figur 2A viser elektroferogrammet pERK1/2 fra ± VEGF-stimuleret lysates. Der er helt klart, med VEGF meget høj induktion af fosforyleres proteiner (toppe skitseret i rød). Indsatsen viser kontrolelementet endogene lastning HSP 70 (figur 2A inset), der viser lignende lastning af prøver til både ubehandlede og behandlede prøver. I konventionelle immunblot (figur 2 cvenstre panel) kun to bands blev opdaget (phosphoERK1; pERK1 og pERK2). Men pERK1/2 proteiner var løst i 4 toppe for ppERK2, pERK2, ppERK1 og pERK1 af cIEF analyse (figur 2A). Tilsvarende viser figur 2B elektroferogrammet ERK1/2 fra ± VEGF-stimuleret lysates. Indsatsen viser det samme loading-objekt parallelt. En konventionel immunblot viser kun to bands svarende til ERK1 og ERK2 fosforyleret (figur 2 chøjre panel) boer med cIEF, pERK1/ERK2 blev løst i 6 toppe (figur 2B) svarer til alle 4 forskellige toppe og 2 unphosphorylated toppe, ERK1 og ERK2. Dette viser en af fordelene med cIEF, nemlig at protein isoformer kan løst og vurderet både kvalitativt og kvantitativt. Det er derudover muligt at få kvantitative oplysninger af fosforyleres isoformer fra et antistof rettet til protein core, snarere end den posttranslationelle modifikation.
Figur 1 : Design af assay plade layout i software. (A) 384-godt plade layout definere placeringen af alle reagenser. Farvekodede 12 godt rækker viser placeringen af prøver, antistoffer og kemiluminescens reagenser. (B) en analyse skabelon viser relevante oplysninger med individuelle godt. (C) protokollen viser alle de relevante oplysninger for cyklus 1 og 2. I cyklus 1 (12 kapillærer som vist i farvede kasse), instrumentet tager prøven fra A1 (wells fra A1-A12) efterfulgt af primære antistof fra B1 (wells fra B1-B12), sekundær antistof fra D1 (wells fra D1-D12), og endelig luminol:peroxide XDR fra J1 (brønde fra J1-J12). I 2cyklus, alt er den samme som den første cyklus, medmindre det tager primære antistof fra C1 (wells fra C1-C12). Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Aspinall-O'Dea et al. 20152. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Påvisning af fosforyleres og samlede Mitogen-Activated Protein Kinase (ERK 1/2) proteiner af cIEF assay og traditionelle immunblot analyse. (A) Repræsentant elektroferogrammet for pERK1/2 og proteiner i HUVECs behandlet ±VEGFA efterfulgt af cIEF assay, aftestede for pERK1/2 antistoffer. Blå linje (unstimulated) og røde linje (stimuleret). Toppe Vis den anderledes fosforyleres frynsegode/2 isoformer adskilt på grundlag af deres isoelektriske punkter. Indsatsen viser kontrolelementet endogene HSP70 køre parallelt med samme lysate. ()B) repræsentant elektroferogrammet viser ERK1/2 ± VEGFA-stimuleret lysate. Indsatsen viser den endogene kontrol HSP70 blev kørt sideløbende. For elektroferogrammet, 50 µg/mL lysate koncentrationer blev brugt, svarende til 20 ng af samlede proteiner i kapillar. (C) konventionel immunoblotting til pERK1/2 og ERK1/2 proteiner på ±VEGFA (50 ng/mL) stimuleret HUVEC celle lysate. 10 µg af samlede lysate pr. vognbane blev brugt til immunoblotting. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figur S1: faser af resultat analyse
(A) Se resultater fra en kapillær af interesse. (B) Rediger/Tilføj forskellige parametre til filen assay. (C) Det er muligt at tilføje peak navne til toppene før du eksporterer dataene til yderligere analyse. Venligst klik her for at downloade denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Følsomhed og opløsning af proteiner er afgørende for proteom forskning på biologiske prøver. Der er stor værdi i at være i stand til at opdage proteiner, som findes i små mængder i celler. cIEF kan tilbyde bedre følsomhed og opløsning til påvisning af proteiner og deres isoformer4.
Denne teknologi har held været anvendt i mange proteom forskning rapporter5,6,7. Stadig er flere begrænsninger forbundet med det, som den kendsgerning, at ikke alle primære antistoffer kan give et signal, selv om de arbejder pænt i konventionelle immunoblots. Der er endnu ingen liste over validerede antistoffer vist sig at fungere i cIEF, da denne teknik er ganske nye. Endelig, apparatet ikke kan håndtere færre end 12 prøver eller mere end 96 prøver ad gangen.
cIEF er en alternativ teknik for konventionelle immunoblotting, men det kan ikke give identiske resultater. cIEF har vist sig at være langt bedre end konventionelle immunoblotting følsomhed og opløsning. Derudover cIEF er høj overførselshastighed, robust, automatiske, robotiserede, og meget følsomme, giver signaler fra mindre end 25 celler afhængigt af proteinet analyseret1. Det er kvantitative og stærkt reproducerbar, så håndtering er minimeret. Påvisning af forskellige protein isoformer af lignende størrelser kan nemt løses. Således, den samme antistof kan give kvantitative oplysninger om fosforyleres og unphosphorylated protein former fra nanogram mængder af prøve4. Selv om både konventionelle immunblot og cIEF afhængige antistof baseret kemiluminescens opdagelse, der er nogle vigtige forskelle, som i konventionelle immunoblotting, proteiner er adskilt på grundlag af deres molekylvægt boer i cIEF, adskillelse er baseret på protein opladning. Endelig er proteiner denatureret i immunblot, der henviser til, at de er bevaret i deres oprindelige tilstand i cIEF. Dette sidste punkt er grunden til hvorfor det samme antistof kan eller ikke kan arbejde i begge metoder.
Mange forskellige undersøgelser har vist anvendelsen af cIEF at studere protein fosforylering fra menneskelige patientprøver3, menneskelige kolon kræft prøver4,8, mus tumor væv9eller forskellige cellelinjer 10. vedtagelse af denne metode kunne fremme hurtige fremskridt i proteom forskning i mange områder såsom drug discovery, diagnostiske formål, biomarkører opdagelse og signalering undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Forfatteren tak Prof. Lena Claesson-walisisk, Uppsala Universitet, Sverige for hendes støtte til udvikling af dette projekt. Derudover tak forfatteren Ross Smith og Lena Claesson-walisisk, Uppsala Universitet for deres kritisk læsning og forslag til at forbedre håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O'Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
