Summary
Kapillært isoelectric fokus er et antistoff-basert, ultrasensitive, høy gjennomstrømming teknikk, muliggjør detaljert karakterisering av proteiner og deres isoformene fra svært små biologiske prøver. Følgende beskriver en protokoll for oppdagelse og kvantifisering av spesifikke proteiner og deres isoformene i en automatisert og robotisert måte.
Abstract
Immunoblotting har blitt en rutinemessig teknikk i mange laboratorier for protein karakterisering fra biologiske prøver. Følgende protokollen gir en alternativ strategi, kapillære isoelectric fokuserer (cIEF), med mange fordeler sammenlignet med konvensjonelle immunoblotting. Dette er et antistoff-basert, automatisert, rask og kvantitativ metode der en komplett vestlige blotting prosedyre finner sted i en supertynn kapillær. Denne teknikken ikke krever en gel å overføre til en membran, stripping av blots, eller x-ray filmer, som vanligvis kreves for vanlig immunoblotting. Her proteiner skilles i henhold til sine kostnader (isoelectric punkt, pI), bruker mindre enn en mikroliter (400 nL) totalt protein lysate. Etter geleelektroforese, proteiner er blokkert på capillary vegger av ultrafiolett lys behandling, etterfulgt av primære og sekundære (pepperrotperoksidase (HRP) konjugert) antistoff inkubasjon som bindende oppdages gjennom forbedret chemiluminescence (ECL), generere et lys signal som kan fanges opp og registrert av en kostnad - sammen enhet (CCD) kameraet. Det digitale bildet kan bli analysert og kvantifisert (peak området) ved hjelp av programvare. Denne høy gjennomstrømning prosedyren kan håndtere 96 prøver om gangen. er svært følsom, med proteinet oppdagelsen i hører området; og produserer svært reproduserbar skyldes automatisering. Alle disse aspektene er svært verdifull når antall prøver (f.eks, vevsprøver og biopsier) er en begrensende faktor. Teknikken har større programmer, inkludert screening av narkotika eller antistoffer, biomarkør oppdagelse og diagnostiske formål.
Introduction
Kapillær isoelectric fokus (cIEF) er en automatisert, kapillær-baserte immunanalyse som løser proteiner basert på deres kostnad1,2,3. Det er svært reproduserbare og i stand til å løse proteiner og deres post-translationally endret isoformene raskt og kvantitativt. Den presenterer et alternativ til konvensjonelle metoder som vestlige blotting. Mens vestlige blotting er veldig bra for å bekrefte tilstedeværelse av rikelig proteiner i lett tilgjengelig prøver; variasjon, tidsforbruk og nøyaktig kvantifisering alle tilstede utfordringer, særlig når undersøke biologiske vevsprøver. Faktisk variasjon er en iboende problem i vestlige blotting, som det er mange trinnene involvert, som laster inn og kjører SDS side gelé, overføring av proteiner på membran, inkubasjon med ulike reagenser (f.eks., primære og sekundære antistoffer, ECL), og utvikling på X-ray film4. Tiden, er den vestlige blotting teknikken bedre med implementeringen av digitale opptak av chemiluminescent signaler (digital westernfilmer). Nylig, et automatisert vestlige blotting system har blitt utviklet, nemlig av kapillær vestlige, som er et mer håndfri og gel-fri. Hele analysen er automatisert etter lasting av en prøve plate (eksempler med alle nødvendige reagenser) i systemet3,4. Instrumentet vil utføre alle skritt som protein separasjon, immobilisering av proteiner på kapillære veggen, antistoff incubations, vasker mellom forskjellige trinnene, og utvikling og kvantifisering av chemiluminescent signaler. Dermed gir cIEF prosedyren presenteres her høyere oppløsning og følsomhet.
Denne metoden er sensitiv, som signaler kan genereres og kvantifisert fra picograms proteiner1. Høy følsomhet med utmerket reproduserbarhet gjør denne teknologien svært nyttig for analyse av klinisk prøver. Det kan oppdage samt skille innlegget translasjonsforskning endring (f.eks annet fosforylert protein isoformene) av proteiner. Denne teknologien har blitt brukt til å analysere ulike signalnettverk trasé4,5 i kliniske studier å utvikle nye therapeutics i kreft3, og den har stort potensial for protein biomarkør og narkotika funnet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle kultur, stimulering og lyse
Merk: Denne metoden kan brukes med mange celletyper. For å illustrere metoden, er et eksempel bruker menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs) beskrevet.
- Kultur HUVECs gelatin-belagt, 10 cm Petri retter i endothelial celle basale medium med riktig kosttilskudd (se Tabell for materiale), og også inneholder 5% FCS, epidermal vekstfaktor (5 ng/mL), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF: 0,5 ng/mL), grunnleggende FGF (10 ng/mL), insulin-lignende vekstfaktor (20 ng/mL), hydrocortisone (0,2 µg/mL) og askorbinsyre (1 µg/mL).
- Sulte celler over natten med endothelial celle basale medium supplert med 1% FCS og ingen vekstfaktor supplement.
- Sug opp alle medium, tilsett 2 mL endothelial celle kultur medium uten vekstfaktorer (sult medium) i en rett (kontroll), deretter legge 50 ng/mL VEGF i 2 mL sult kultur medium i andre parabol i 7 min.
- Sug opp mediet og vask celler 2 ganger med 10 mL romtemperatur PBS.
- Sikre Petri retter på isen og holde dem der dette trinnet og utover.
- Legge til 250-400 µL av is kaldt lysis buffer (Bicine/CHAPS, se Tabellen for materiale) inneholder vandig protease hemmer blanding og DMSO hemmer blanding (fosfatase hemmere, se Tabellen for materiale) hver 10 cm plate. Snurr den for å sikre riktig dekning og beholde den for 10 min på is.
Merk: Den siste konsentrasjonen av protease og DMSO hemmer blanding bør være 1 x. - Skrap cellene fra retten med en celle skraper og overføre slik pre kjølt microfuge. Pipetter opp og ned 5 ganger til lyse cellene.
- Kort sonicate cellene på 4 ° C. Angi sonicator som følger: antall sykluser = 5, makt = lav, = 5 sek, av = 30 s. Dette trinnet er inkludert å bryte nucleic syrer, og ikke til lyse cellene.
Merk: Sonication må være mild å hindre denaturering av proteiner. - Vortex tube for 5 s (ikke kontinuerlig), 2 s tid (3 ganger), og holde på is.
- Klargjøre lysate med sentrifugering 14.000 x g i 15 min på 4 ° C, deretter umiddelbart overføre nedbryting slik rent pre kjølt microfuge.
- Måle protein konsentrasjonen med Bicinchoninic syre (BCA) protein analysen kit4.
- Gjør 10 µL dele, fest fryse i tørris eller flytende nitrogen, og lagre på-80 ° C før bruk.
2. prøven blanding forberedelse (beregning for 150 µL eksempel Mix)
- Først forberede en prøve fortynningsmiddel blanding ved å legge til 1 µL DMSO hemmer mix (lager 50 x) og 2 µL av proteasehemmere (lager 25 x) til 47 µL av prøven fortynner (se Tabell for materiale), slik at siste konsentrasjonen av DMSO hemmere og proteasehemmere blir 1 x. Deretter fortynne protein lysates bruke eksempel fortynningsmiddel mix for å oppnå de ønskede konsentrasjonene (se trinn 2.3).
- Klargjør ampholyte/ladder/protease hemmer/DMSO hemmer blandingen ved å legge 3.325 µL standard stigen (se Tabell for materiale; lager 60 x), 6 µL av protease hemmer (25 x), 3 µL av DMSO (50 x) hemmer til 137.675 µL ampholyte premix (se tabell av Materialer). Vortex tube minst 15 s totale, 5 s samtidig (3 - 4 ganger), og holde på is.
- Bland løsninger fra trinn 2.1 og 2.2 i 1:3 forholdet, slik at de endelige konsentrasjonene av DMSO og proteasehemmere pI standard stigen bli 1 X, og proteiner i av kapillær nå de endelige ønsket konsentrasjonene (f.eks50 µg/mL ble brukt for Figur 2).
Merk: Protein konsentrasjon i kapillær og godt er de samme. - Laste inn 10 µL av prøven i riktig godt, ifølge 384-vel plate analysen malen layout (se trinn 3 og figur 1) og holde platen på is.
- Fortynne primært (pERK1/2, 1:50. ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1:500) og sekundær antistoffer (1:300) med antistoff fortynner (se Tabell for materiale) og Pipetter 10 µL av primære og 15 µL av sekundær antistoffer i hver brønn.
Merk: vanligvis høyere konsentrasjon av antistoffer er nødvendig for cIEF analyser i forhold til konvensjonelle vestlige blots. - Bland Luminol og peroxide XDR (1:1 ratio, se Tabellen for materiale) sammen og Pipetter 15 µL i hver brønn.
Merk: Bland disse løsninger fersk hver gang før bruk og holde på is. - Når prøvene og alle reagenser er pipetted inn platen, sentrifuge platen på 2500 x g i 10 min på 4 ° C Nedspinning væsken og fjerne bobler. Hvis boblene fremdeles eksisterer, fjerne dem manuelt med en tynn pipette tips.
Merk: Ikke Legg mer enn 20 µL av prøve eller reagenser per bra; ellers kan instrument pipette ikke vaskes ordentlig. Sørg for å følge bruksanvisningen fra produsenten å forberede reagenser.
3. utformer en ny analysen mal med systemprogramvaren (figur 1)
- Åpne systemprogramvaren og klikk "ny" fra Arkiv-menyen.
- Gå til layout-panelet og tilordne steder for reagenser og prøver en 384 godt-plate. Bruk opp til maksimalt 96 brønner per 384-vel plate.
- Lage en reagens oppgave ved å klikke en brønn hvor som helst i blokken. Velg en rad blokk 12 brønner. Brønner, f.eksfra 1-12 eller 13-24, tilordnes som en blokk som standard.
- Gå til layout ruten verktøylinjen og sette inn enten en tom rad blokk eller en prøve, primær, sekundær eller luminol rad blokk. Hver blokk er tilordnet en annen farge, slik at de er lett å skille.
Merk: Når du klikker en brønn, en svart ramme kan sees rundt blokken der nye blokken settes i ruten. Også du kan slette en rad blokk. - Gå til ruten protokollen og velge en reagens plassering i platen. Deretter klikker du en celle i kolonnen utvalg og velg reagensen fra rullegardinmenyen.
- I denne samme mote, Velg reagens steder for primær, sekundær, og luminol for hver syklus.
- Klikk cellene, en om gangen, i primær eller sekundær antistoff-kolonnen og endre inkubasjon tiden, om nødvendig.
Merk: Oppføring notater for hver syklus kan også legges. - Legge sykluser ved å klikke på "Legg til" knappen under protokollen. 1 syklus, 4 sykluser eller alle sykluser (maksimalt 8 sykluser kan legges til protokollen).
Merk: Det er mulig å kopiere og lime inn syklus informasjon i dette trinnet: Velg en syklus, gå til Rediger, kopier og lim inn. - Angi informasjon om prøven, som identiteten til de primære og sekundære Antistoffene, katalogfilene tall og fortynninger, etc., i ruten mal. Dette er et valgfritt trinn som er nyttig under etter utført analysen.
- Lagre filen for ny analyse. Før du klikker på "start"-knappen, raskt kontrollere oppsettet å sørge for at alt er riktig.
4. protokoll for cIEF Instrument innstillingen
- Angi kapillært isoelectric fokus geleelektroforese separasjon betingelser. Disse skal være 15,000 µW og 40 min, og UV immobilisering tiden bør være 80 s. Imidlertid UV immobilisering tiden kan settes innen 80-140 s, og må være optimalisert for protein av interesse.
Merk: En tidspunktet for UV immobilisering kan angis for hver syklus, men ikke for hver kapillær. - Sett vaske 1 til 2 vasker, 150 s hver vask (standard), og primære antistoff inkubasjonstiden for 120 min.
- Sett vask 2 til 2 vasker, 150 s hver vask (standard), og sekundære antistoff inkubasjonstiden for 60 min.
- Angi vask 3, som bør være 2 vasker, 150 s hver vask (standard).
- Angi eksponering når chemiluminescence vil bli oppdaget; disse skal være 30, 60, 120, 240, 490 og 960 s. Alle trinn (1-8) utføres i en enkelt kapillær.
5. kjører filen analysen
- Når alt er ferdig, klikker du start å starte kjøringen. Programvaren vil be deg fjerne avfallet, for å fylle vann og boksen kapillær til anolyte og catholyte ressurs magasinet legge vaskebuffer og laste inn platen i avkjølt eksempel skuffen.
Merk: Fjern lokket fra boksen kapillær, men ikke Fjern lokket fra analysen plate. Lokket fra platen kan fjernes automatisk av apparatet når det er nødvendig. Dette hjelper for å forhindre reagens fordampning. - Et par minutter etter løpet er startet, et instrument statuslinjen vises på skjermen. Statusmeldinger og fremdriftsindikatorer kan sees tilsvarer hele gjeldende trinn.
Merk: I utgangspunktet instrumentet vil sjekke om alt er riktig før du fortsetter Pipetter anolyte og catholyte i separasjon skuffen, plukke den første blokken i 12 kapillærene, fjerne lokket på platen og plassere prøvene fra prøven platen i kapillærene, og så til slutt i separasjon kammeret for geleelektroforese. - Klikk på Kjør sammendraget skjermen å se to ruter: status og separasjon. Brukere kan vise kjøre fremdriften og filmer av separasjon (12 kapillærene hver syklus) kan lagres når geleelektroforese trinn hver syklus er fullført. Å observere geleelektroforese separasjon i en kapillære, spille separasjon filmen for at kapillær ved å klikke ønsket syklusen og deretter på play-knappen i kontrollpanelet.
- Kjør filen kan lagres automatisk ved fullføring av kjøringen.
6. analysere dataene (figur S1)
- Åpne kjøre filen, og velg kategorien analyse skjermen. I Figur S1Aer dataene (topper) på prøve grafen fra den valgte kapillær (dvs., 4th kapillær fra cycle 1).
- Klikk Rediger og deretter analyse (Figur S1B). På dette stadiet, kan brukere endre området pI, bruke aktuelle pI standarden for en bestemt eksperiment, legge til en topp-plass og legge til en topp.
Merk: Når du bruker en pH 5-8 ampholyte premix (som er tilfelle her), anbefalte standard stigen bruke er med fluorescently merket peptider med pIs 4.9, 6.0, 6.4, 7.0 og 7.3, og når du bruker en pH 3-10 premix, anbefalte stigen er med pIs av 4.0 , 4.9, 6.0, 6.4 og 7.3. 2 - Resultatene vises i kategorien topper. verdiene for prøvene er posisjon, pI, topp høyde og området, % området, topp bredde og signal til støy (S/N) (Figur S1C). Velg dataene du vil bruke, og eksportere data for videre analyse.
Merk: Data kan bare eksporteres etter merking toppen (Figur S1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utformingen av en ny analysen: En analysen plate layout er vist i figur 1A. Maksimalt, kan 96 brønner brukes fra 384-vel platen i blokker 12 brønner for hvert vilkår (antistoffer). Hver blokk 12 brønner kan starte fra A1-A12 eller A13-A24. Fargekodet rader tillater en å skille prøver eller reagenser fra hverandre. I analysen malen (figur 1B), relevant informasjon for det kan bestemte analysen lagres, og som kan brukes ved senere stadier av resultat analyse. Figur 1 c viser Sammendrag av protokollen.
Påvisning av fosforylert og unphosphorylated ekstracellulære regulert kinase (pERK1/2 og ERK1/2) protein i HUVEC lysate stimulert med VEGF: Generelt er innlegg translationally endret proteiner, slik som fosfoproteiner, vanskelig å oppdage på grunn av deres lave antall og forbigående natur og mangel på spesifikke antistoffer. Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) stimulering etter serum sult aktiverer receptor tyrosine kinase (VEGFR2) som fører til aktivere MAPK veien og resulterer i ERK fosforylering. For eksperimenter med HUVECs, kan lysates fra celler stimulert med eller uten VEGF i 7 min brukes som vist i figur 2. Figur 2A viser electropherogram pERK1/2 fra ± VEGF-stimulert lysates. Tydelig, med VEGF det er svært høy induksjon av fosforylert proteiner (topper uthevet i rødt). Rammemargen viser endogene lasting kontrollen HSP 70 (figur 2A innfelt), som viser lignende lasting av prøver for både ubehandlet og behandlet. Konvensjonelle immunoblot (figur 2Cvenstre panel) bare to band var oppdaget (phosphoERK1, pERK1 og pERK2). Men ble pERK1/2 proteiner løst i 4 topper for ppERK2, pERK2, ppERK1 og pERK1 av cIEF analyse (figur 2A). Tilsvarende viser figur 2B electropherogram ERK1/2 fra ± VEGF-stimulert lysates. Rammemargen viser samme lasting kontroll brukes parallelt. En tradisjonell immunoblot viser bare to band tilsvarer ERK1 og ERK2 fosforylert (figur 2Chøyre panel) mens med cIEF, pERK1/ERK2 ble løst i 6 topper (figur 2B) tilsvarer alle 4 forskjellige topper og 2 unphosphorylated topper, ERK1 og ERK2. Dette viser en av fordelene med cIEF, nemlig at protein isoformene kan være løst og vurdert både kvalitativt og kvantitativt. I tillegg er det mulig å få kvantitativ informasjon fosforylert isoformene fra et antistoff mot protein kjernen, i stedet for posttranslational endring.
Figur 1 : Av analysen plate oppsett programvare. (A) 384-vel plate layout definerer plasseringen av reagenser. Fargekodede 12 godt rader viser plasseringen for eksempler, antistoffer og chemiluminescent reagenser. (B) en analysen mal viser relevant informasjon med personlige godt. (C) protokoll viser all relevant informasjon for syklus 1 og 2. I cycle 1 (12 kapillærene som vist i fargede boksen), apparatet tar prøven fra A1 (brønner fra A1-A12) etterfulgt av primære antistoff fra B1 (brønner fra B1-B12), sekundær antistoff fra D1 (brønner fra D1-D12), og til slutt luminol:peroxide XDR fra J1 (brønner fra J1-J12). I 2syklus, alt er det samme som første syklus, bortsett fra det tar primære antistoff fra C1 (brønner fra C1-C12). Dette tallet er endret med tillatelse fra Aspinall-O'Dea et al. 20152. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Påvisning av fosforylert og total Mitogen-Activated Protein Kinase (ERK 1/2) proteiner cIEF analysen og tradisjonelle immunoblot analysen. (A) Representant electropherogram for pERK1/2 og proteiner i HUVECs behandlet ±VEGFA etterfulgt av cIEF analysen, analysert for pERK1/2 antistoffer. Blå linje (unstimulated) og rød linje (stimulert). Topper viser det annerledes phosphorylated pERK/2 isoformene atskilt på grunnlag av sine isoelectric poeng. Rammemargen viser endogene kontrollen HSP70 kjøre parallelt med samme lysate. (B) representant electropherogram viser ERK1/2 ± VEGFA-stimulert lysate. Rammemargen viser endogene kontrollen HSP70 som ble kjørt i parallell. For electropherogram, 50 µg/mL lysate konsentrasjoner ble brukt, som tilsvarer 20 ng totale proteiner i av kapillær. (C) konvensjonelle immunoblotting for pERK1/2 og ERK1/2 proteiner på ±VEGFA (50 ng/mL) stimulert HUVEC celle lysate. 10 µg total lysate per kjørefelt ble brukt for immunoblotting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Figur S1: stadier av resultat analyse
(A) vise resultatene fra en kapillær interesse. (B) Redigere/legge til ulike parametere i filen analysen. (C) Det er mulig å legge peak navn til toppene før du eksporterer dataene for videre analyse. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Følsomhet og oppløsning av proteiner er avgjørende for proteomic forskning på biologiske prøver. Det er stor verdi i å kunne oppdage proteiner som finnes i mengder i celler. cIEF kan tilby bedre følsomhet og oppløsning for påvisning av proteiner og deres isoformene4.
Denne teknologien har blitt brukt i mange proteomic forskning rapporter5,6,7. Likevel er flere begrensninger forbundet med det, som det faktum at ikke alle primære antistoffer kan gi et signal selv om de fungerer fint i konvensjonell immunoblots. Det er ennå, ingen liste over godkjente antistoffer vist å fungere i cIEF, siden denne teknikken er ganske nytt. Til slutt ikke kan maskinen håndtere færre enn 12 prøver eller mer enn 96 prøver samtidig.
cIEF er en alternativ teknikk for konvensjonelle immunoblotting, men det kan ikke gi samme resultater. cIEF har vist seg å være langt bedre enn konvensjonelle immunoblotting følsomhet og oppløsning. Videre er cIEF høy gjennomstrømning, robust, automatiske, robotisert, og svært følsom, gir signaler fra færre enn 25 celler avhengig av protein analysert1. Det er kvantitative og svært reproduserbare, som håndtering er minimert. Gjenkjenning av ulike protein isoformene lignende størrelser kan enkelt løses. Dermed kan samme antistoffer gi kvantitativ informasjon om fosforylert og unphosphorylated protein skjemaer fra nanogram mengder utvalg4. Selv om både konvensjonell immunoblot og cIEF avhengige av antistoff basert chemiluminescent oppdagelsen, det er noen viktige forskjeller, som i konvensjonelle immunoblotting, skilles proteiner basert på deres molekylvekt mens i cIEF, separasjon er basert på protein tillegget. Til slutt, proteiner er denaturert i immunoblot, mens de blir bevart i sin opprinnelige tilstand i cIEF. Dette siste punktet er anledningen hvorfor det samme antistoffet kanskje eller kanskje ikke arbeide i begge metoder.
Mange forskjellige studier har vist anvendelse av cIEF å studere protein fosforylering fra menneskelige pasientprøvene3, menneskelige kolon kreft prøver4,8, musen tumor vev9eller ulike linjer 10. Bruk av denne metoden kan fremme rask fremgang i proteomic forskning på mange felt som medisiner, diagnose, biomarkers oppdagelsen og signalering studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Forfatteren Takk Prof Lena Claesson-walisisk, Uppsala universitet, Sverige om hennes støtte for å utvikle dette prosjektet. I tillegg forfatteren Takk Ross Smith og Lena Claesson-walisisk, Uppsala universitet for kritisk lesing og forslag til å forbedre manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O'Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
