Method Article

Erstellen eines strukturell realistische Finite-Elemente geometrischen Modells von einer Cardiomyocyte zur Untersuchung der Rolle von zellulären Architektur in Cardiomyocyte Systembiologie

DOI:

10.3791/56817

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April 18th, 2018

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1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode um ein räumlich detaillierte finite-Elemente-Modell der intrazellulären Architektur der Herzzellen von Elektronenmikroskopie und konfokalen Mikroskopie-Bilder zu erstellen. Die Kraft dieses räumlich detaillierte Modell zeigt anhand von Fallbeispielen in Kalzium Signal- und Bioenergetik.

Abstract

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Mit dem Aufkommen der dreidimensionalen (3D) imaging-Technologien wie die Elektronenstrahl-Tomographie hat Serien-Block-Face scanning Electron Microscopy und konfokale Mikroskopie, die wissenschaftliche Gemeinschaft beispiellosen Zugang zu großen Datenmengen bei Sub-Mikrometer Auflösung, die charakterisieren die architektonische Umgestaltung begleitet Veränderungen in der Cardiomyocyte Funktion in Gesundheit und Krankheit. Allerdings wurden diese Datasets für die Untersuchung der Rolle der zellulären Architektur Umbau in Cardiomyocyte Funktion genutzt. Dieses Protokoll dient, wie erstelle ich eine genaue finite-Elemente-Modell der eine Cardiomyocyte mit hochauflösende Elektronenmikroskopie und konfokalen Mikroskopie-Bildern zu skizzieren. Eine detaillierte und genaue Modell der zellulären Architektur hat erhebliches Potenzial zur erlauben neue Einblicke in Cardiomyocyte Biologie, mehr als Experimente allein sammeln können. Die Kraft dieses Verfahrens liegt in seiner Fähigkeit, Informationen aus zwei unterschiedlichen bildgebender Verfahren der Cardiomyocyte Ultrastruktur, eine einheitliche und detaillierte Modell von der Cardiomyocyte zu entwickeln rechnerisch zu verschmelzen. Dieses Protokoll beschreibt Schritte zur Integration von Elektron Tomographie und konfokalen Mikroskopie Bilder von erwachsenen männlichen Wistar (Name für eine bestimmte Rasse Albino Ratte) Ratte Kardiomyozyten, ein halb-sarkomers finite-Elemente-Modell von der Cardiomyocyte zu entwickeln. Das Verfahren erzeugt eine 3D finite-Elemente-Modell, das eine präzise, hochauflösende Darstellung enthält (in der Größenordnung von ~ 35 nm) der Verteilung der Myofibrillen und Mitochondrien und Ryanodin-Rezeptor-Cluster, die das notwendige Kalzium für Cardiomyocyte freigeben Kontraktion von sarcoplasmic Retikuläre Netzwerk (SR) in die Myofibril und cytosolischen Fach. Das Modell erzeugt hier wie eine Illustration nicht Details der quer-Röhrchen-Architektur oder die sarcoplasmic Retikuläre Netzwerk zu übernehmen und daher ein minimaler Modell von der Cardiomyocyte ist. Dennoch kann das Modell bereits im Simulations-basierte Untersuchungen über die Rolle der Zellstruktur in Kalzium Signalisierung und mitochondriale Bioenergetik, wird dargestellt und diskutiert anhand von zwei Fallbeispielen, die präsentiert werden nach angewendet werden die ausführliches Protokoll.

Introduction

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Erregung-Kontraktion Kupplung (ECC) im Herzen bezieht sich auf das wichtige und komplizierte Kopplung zwischen elektrischen Erregung der Cardiomyocyte Membran und die anschließende mechanische Kontraktion der Zelle bei jedem Herzschlag. Mathematische Modelle spielten eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung eines quantitativen Verständnis der vernetzten biochemischen Prozesse, die Regeln des Aktionspotentials1, zytosolischen Kalzium Signalisierung2, Bioenergetik3, und die anschließende Kontraktionskraft Generation. Solche Modelle haben auch erfolgreich vorausgesagt Änderungen an den Herzschlag bei einer oder mehrere dieser biochemischen Prozesse unterliegen Änderungen4,5. Die hoch organisiert Ultrastruktur von der Cardiomyocyte hat zunehmend erkannt worden, eine entscheidende Rolle in der normalen KONTRAKTILE Funktion der Zelle und das ganze Herz. In der Tat treten Änderungen der Morphologie und Organisation von Komponenten der kardialen Ultrastruktur parallel zu biochemischen Veränderungen bei Erkrankungen wie z. B. Hypertrophie6, Herzinsuffizienz7und Diabetische Kardiomyopathie8. Ob diese strukturellen Veränderungen sind leicht, adaptive oder pathologischen Reaktionen an die veränderten biochemische Bedingungen ist noch weitgehend unbekannt9. Die von Natur aus enge Kopplung zwischen Form und Funktion in der Biologie bedeutet, dass experimentelle Studien allein können nicht tiefere Einblicke als Korrelationen zwischen strukturellen Umgestaltung und Cardiomyocyte Funktion. Eine neue Generation von mathematischen Modellen, die die strukturelle Montage der subzellulären Komponenten, zusammen mit der gut untersuchten biochemischen Prozesse integrieren können sind notwendig, um eine umfassende, quantitativen Verständnis der Beziehung entwickeln zwischen Struktur, Biochemie und Kontraktionskraft in Herzmuskelzellen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die verwendet werden können, strukturell genau finite Elemente Modelle von Kardiomyozyten zu generieren, die für solche Untersuchungen verwendet werden kann.

Der letzte zehn Jahren erhebliche Fortschritte in der 3D-Elektronen-Mikroskopie10, konfokale11und Super-Auflösung Mikroskopie12 , die noch nie da gewesenen, hochauflösende Einblicke in die Nano-Maßstab und Mikromaßstab Montage der gesehen hat die subzelluläre Komponenten von der Cardiomyocyte. Vor kurzem wurden diese Datasets zur erzeugt Rechenmodelle Cardiomyocyte Ultrastruktur13,14,15,16. Diese Modelle verwenden eine gut etablierte engineering Simulationsmethode mit dem Namen der finite-Elemente-Methode17, finite-Elemente rechnerische Netze erstellen über die biochemischen Prozesse, die und Cardiomyocyte Kontraktionen simuliert werden können. Allerdings sind diese Modelle begrenzt durch die Auflösung und Details, die eine Methode der Mikroskopie in einem Bild-Dataset bereitstellen kann. Z. B. Elektronenmikroskopie Nanometer-Detailgenauigkeit der Zellstruktur erzeugen können, aber es ist schwierig, spezifische Proteine innerhalb des Bildes zu identifizieren, das Erstellen eines Modells notwendig wäre. Auf der anderen Seite bieten Höchstauflösung Lichtmikroskop kontrastreiche Bilder mit Auflösungen in der Größenordnung von 50 nm von nur ein paar molekularen Komponenten auswählen der Zelle. Nur durch die Integration von ergänzenden Informationen aus diesen bildgebenden Verfahren kann man die Empfindlichkeit der Funktion realistisch zu Veränderungen in der Struktur erkunden. Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie ist noch kein Routineeingriff und es würde immer noch die Einschränkung, dass nur eine begrenzte Anzahl von Komponenten kann in der Immunfluoreszenz-Ansicht gebeizt und mit der Elektronenmikroskopie Ansicht korreliert leiden.

Dieses Protokoll stellt einen neuartigen Ansatz18 , die verwendet statistische Methoden19 zu analysieren und rechnerisch Sicherung Lichtmikroskopie Informationen über die räumliche Verteilung von Ionenkanälen Elektronenmikroskopie-Informationen über andere Herz- Ultrastruktur Komponenten, wie z. B. Myofibrillen und Mitochondrien. Dadurch entsteht ein finite-Elemente-Modell, das mit biophysikalischen Modelle von biochemischen Prozessen verwendet werden kann, zur Untersuchung der Rolle von Cardiomyocyte subzellulären Organisation auf die biochemischen Prozesse, die Cardiomyocyte Kontraktion zu regulieren. Zum Beispiel dieses Protokoll könnte verwendet werden, um Modelle aus gesunden erstellen und Streptozocin-induzierte Diabetische kardialen Myozyten untersuchen die Auswirkungen der strukturellen Umgestaltung auf Herzmuskelzellen-Funktion, die in diabetischen Tier beobachtet wird Modelle8. Ein weiterer Vorteil des statistischen Charakters der die vorgestellte Methode ist auch im Protokoll dargestellt: die Methode kann mehrere Instanzen von finite-Elemente-Geometrien, die genau die experimentell beobachteten Schwankungen der Zellstruktur imitieren generieren.

Im Überblick, die Protokoll-Schritte umfassen: (i) Vorbereitung von Herzgewebe für Elektronenmikroskopie erzeugen 3D-Bilder mit ausreichender Auflösung und Kontrast; (Ii) Wiederaufbau und Segmentierung von 3D-Bild Stacks von Elektronenmikroskopie Daten mit Hilfe eines 3D Elektronenmikroskopie Wiederaufbau- und Bildanalyse-Software namens IMOD20; (Iii) Verwendung von iso2mesh21 , um ein finite-Elemente-Netz mit den segmentierten Daten als Eingabe zu erzeugen; (iv) unter Verwendung neuartiger Algorithmus und Codes, die Verteilung von Ionenkanälen auf das finite-Elemente-Netz abzubilden.

Die Prämisse des Ansatzes für jeden Schritt wird im Rahmen des Protokolls, und repräsentative Ergebnisse sind in den beigefügten Abbildungen zur Verfügung gestellt. Eine Übersicht ist skizziert angeben, wie die generierten räumlich detaillierte Modelle verwendet werden können, um die räumliche Dynamik von Calcium während ECC sowie mitochondriale Bioenergetik zu studieren. Einige der aktuellen Einschränkungen des Protokolls werden besprochen, sowie Neuentwicklungen, die unternommen werden, um sie zu überwinden und weiter ein quantitatives Verständnis der Rolle der Zellstruktur zu kardialen Systembiologie. Auch wird angesprochen, wie diese Methoden verallgemeinert werden könnten, um finite Elemente Modelle von anderen Zelltypen zu erstellen.

Benutzer dieses Protokolls können Schritt 1 und der Wiederaufbau Teil von Schritt 2 überspringen, wenn sie Zugang zu einer bereits vorhandenen Elektronenmikroskopie-Bildstapel haben. Benutzer, die beabsichtigen, ihre Daten in Zusammenarbeit mit erfahrenen Elektron Mikroskopiker erwerben möchten diskutieren und vergleichen Sie die Fixierung und Färbung Verfahren in Schritt 1 mit dem Experten um eine optimale Protokoll für den Erwerb zu bestimmen.

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Protocol

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Alle hier beschriebene Methoden sind genehmigt worden, von der University of Auckland-Tier-Ethik-Kommission und der University of California San Diego institutionelle Pflege der Tiere und Use Committee, wo das Gewebe Protokoll ursprünglich entwickelt wurde.

(1) experimentelle Vorbereitung

  1. Bereiten Sie Stammlösungen von 0,15 M und 0,3 M Natrium Cacodylate-Puffer bei pH 7.4 gemäß Tabelle 1.
  2. Bereiten Sie Glutaraldehyd Fixativ (2 % Paraformaldehyd (PFA) + 2,5 % Glutaraldehyd + 0,2 % Gerbsäure in 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer bei pH 7,4) in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten.
    1. 2 g PFA Pulver in 20 mL destilliertem Wasser bei 60 ° C auf einer Heizplatte unter ständigem Rühren auflösen.
    2. Fügen Sie 1 M NaOH Lösung, bis die Lösung klar ist.
    3. Warten Sie, bis die Temperatur der Lösung unter 40 ° C ist, dann fügen Sie 10 mL Glutaraldehyd und 20 mL 0,3 M Natrium Cacodylate.
    4. 0,2 g Gerbsäure und lösen Sie es in die Lösung.
    5. 50 mL 0,15 M Natrium Cacodylate hinzugeben.
    6. Speichern Sie drei oder vier 20 mL Fläschchen Funkeln Fixativ im Kühlschrank bei 4 ° C oder auf Eis, wenn am selben Tag verwendet.
  3. Bereiten Sie Tyrodes-Lösung mit 20 mM 2,3-Butanedione Monoxime (BDM), nach dem Rezept in Tabelle 1.
  4. Konstruieren Sie einen Langendorff Apparat in einem Laborabzug.
    1. Spannen Sie zwei 100 mL kunststoffspritze Röhren an zwei verschiedenen Retorte Ständen, etwa 70 cm hoch aus den Standfuß.
    2. Schließen Sie die kunststoffspritze Röhren und einen Anschluss-Schlauch mit 3 mm Innendurchmesser Rohr und ein drei-Wege-Hahn, wie in Abbildung 1dargestellt.
    3. Passen Sie eine 3 mm Außendurchmesser Kanüle an der Unterseite des Steckers Schläuche, wo das Herz zur Perfusion Fixierung gebunden wird.
  5. Füllen Sie die Spritze Rohre mit Tyrode Lösung und Fixativ Lösungen bei 37 ° C.
    1. Entfernen Sie indem man die Spritze Lösungen durch Luftblasen in den Schlauch.

(2) erwerben Sie Elektronenmikroskopie Daten von Cardiomyocyte Ultrastruktur

  1. Bereiten Sie das Tier auf Exzision und chemische Fixierung des Herzens.
    Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, Erwachsene männliche Wistar (Name für eine bestimmte Rasse Albino Ratte) Ratte Herzgewebe zu verarbeiten. Das Protokoll kann Änderungen verlangen, wenn das Herzgewebe artfremder bezogen wird.
    1. Betäuben Sie das Tier durch die Behandlung der Ratte (200-250 g durch das Körpergewicht) mit 0,5 mL 250 U/mL Heparin durch intraperitoneale Injektion. 10 min. warten Sie, dann behandeln Sie die Ratte mit intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (210 mg/kg Körpergewicht).
    2. Bestätigen Sie einen richtigen Grad der Narkose durch die Prüfung des Zehe Prise Reflexes.
    3. Das Tier durch zervikale Dislokation einschläfern.
    4. Ernte, die das Herz mit Dissektion Verfahren ähnlich wie zuvor veröffentlichte JoVE Artikel22,23, dann legen Sie es in Eiskalter Kochsalzlösung.
    5. Isolieren der Aorta ascendens und cannulate. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Kanüle direkt über das Semi-lunar Ventil sitzt in den Herzkranzgefäßen abzweigen. Binden Sie einen Faden fest um die Aorta ascendens.
    6. Verbinden Sie die Kanüle mit der Schwerkraft angetrieben Langendorff Apparat betrieben bei ~ 70 cm oberhalb des Bodens des Systems (Abbildung 1).
    7. Drehen Sie den Absperrhahn am Langendorff-System, das Herz mit Tyrodes-Lösung, einschließlich 20 mM BDM (Myosin-Hemmer) für 2 – 3 min. durchspülen.
    8. Drehen Sie den Absperrhahn zur Perfusion mit Fixativ von 2 % Paraformaldehyd, 2,5 % Glutaraldehyd und 0,2 % Gerbsäure in 0,15 M Natrium Cacodylate bei 37 ° C für 10 min beginnen. Im Erfolgsfall wird das Herz verwandeln hellbraun und werden steif und gummiartig.
    9. Mit einer Rasierklinge, Gewebe Blöcke von der linken Herzkammer (seitliche) kostenlos Wand zu sezieren und zu erhalten Gewebe blockiert ca. 1 mm3 in der Größe.
    10. Store die Proben in vorgekühlte 20 mL Funkeln Fläschchen mit der gleichen Fixativ auf Eis für 2 h speichern so viele Proben wie möglich in das Fläschchen und sicherzustellen, dass die Proben in die Lösung getaucht werden.
      Achtung: Es ist wichtig, die Proben erst nach dem 100 % Abtrocknung Schritt unten kalt zu halten.
  2. Weitere Fixierung und Färbung der Proben für Elektronenmikroskopie.
    1. 100 mL von 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer in ein Becherglas gießen und Abkühlen auf Eis.
    2. Bereiten Sie gleiche Volumina von 4 % Osmium ausgefällt und 0,3 M Natrium Cacodylate, gefolgt von dem Zusatz von 0,08 g Kaliumferrocyanid, eine Heavy-Metal-Fleck-Lösung mit 2 % Kaliumferrocyanid in 2 % Osmium ausgefällt und 0,15 M Natrium Cacodylate zu machen. Die Lösung auf Eis abkühlen.
    3. Das Fixiermittel, Pipette und ersetzen Sie es mit genügend kalt 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer zu Proben in das Fläschchen Tauchen. Legen Sie die Fläschchen für 5 min auf Eis.
    4. Wiederholen Sie Schritt 2.2.3 vier weitere Male mit 0,15 M Natrium Cacodylate, überschüssige Fixativ zu entfernen.
      Achtung: Verwenden Sie nicht glaspipetten, weil winzige Scherben in die Probe gelangen können und während Gewebe-Block Schnitt Diamant Messer ruinieren können. Es ist wichtig, alle Lösungen auf Eis Vorkühlen, bevor Sie sie zum Beispiel hinzufügen. Es ist auch wichtig, dass die Probe fallenden Lösung aller Zeiten bleibt (sehr kurze Zeiträume Teilschutz dauert nicht mehr als ein paar Sekunden können während der Lösung Austausch kurz toleriert werden). Beim Waschen oder Lösungen zu ersetzen, fügen Sie die neue Lösung schnell nach dem Entfernen der vorherigen Lösung hinzu. Halten Sie die Fläschchen funkeln auf dem Eis zwischen den Waschgängen. Beachten Sie, dass dieser Schritt ist nicht empfindlich, die Gewebe-Blöcke Zeit kann etwas länger, bei Bedarf gewaschen werden.
    5. Ersetzen Sie Natrium Cacodylate Puffer mit eiskalten Heavy-Metal-Fleck-Lösung zu, und speichern Sie es über Nacht auf dem Eis. Sicherzustellen Sie, dass die ferrocyanid gut vermischt ist, durch schütteln das Fläschchen mit der hand; die Lösung sollte schwarz werden.
      Achtung: Arbeiten Sie in der Dunstabzugshaube, wenn diesen Schritt durchführen, weil Osmium giftig ist.
    6. 4 % wässrige Uranyl (UA)-Acetat-Stammlösung (Tabelle 1), 2 % gleiche Volumina der Aktie UA Lösung mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen und auf Eis abkühlen.
    7. Ersetzen Sie Heavy-Metal-Fleck mit Eis gekühlt 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer zu, und lassen Sie die Probe für 5 min auf Eis zu brüten.
    8. Wiederholen Sie Schritt 2.2.7 vier weitere Male auf dem Eis keine überschüssige Heavy-Metal-Fleck-Lösung abwischen.
    9. Spülen Sie die Proben viermal, mit einer 2-Minuten-Wartezeit dazwischen in gereinigtem Wasser (bidestilliertem ist ausreichend).
    10. Gereinigtes Wasser zu ersetzen mit eiskalten 2 % UA und auch das Muster inkubieren 60-120 min auf Eis.
    11. Kühlen Sie fünf 20 mL Funkeln Fläschchen von Ethanol (genug, um Proben zu tauchen ab) auf dem Eis, die in der Dehydrierung Schritt verwendet werden. Die sechs Fläschchen haben zunehmende Prozentsätze von Ethanol in destilliertem Wasser: 20 %, 50 %, 70 %, 90 % und 100 %.
    12. Gießen Sie Aceton in ein anderes Fläschchen 20 mL funkeln und Cool auf dem Eis zusammen mit den Ethanol-Fläschchen.
    13. Spülen Sie Proben in gereinigtem Wasser viermal mit Wartezeiten von 2 min auf Eis, überschüssige UA zu waschen.
  3. Proben im Äthanol zu entwässern.
    1. Entwässern in kaltem Ethanol-Serie durch das sukzessive ersetzen-Lösung in das Probenfläschchen wie folgt auf Eis: 20 % Ethanol für 10 min; 50 % Ethanol für 10 min; 70 % Ethanol für 10 min; 90 % Ethanol für 10 min; dann zweimal in 100 % igem Ethanol für 10 Minuten.
    2. Übergang von Probe auf Raumtemperatur indem das endgültige 100 % Ethanol mit gekühlten Aceton und legen das Probenfläschchen auf einem Labortisch Raumtemperatur für 10 min.
    3. Führen Sie eine weitere 10 min Waschen in Aceton bei Raumtemperatur, Kondensation zu entfernen, zu beobachten in den Fläschchen ist. Während der Inkubation, Aceton/Harz-Lösungen bilden.
    4. Ersetzen Sie das Aceton in den Fläschchen mit 50: 50 reines Aceton und Epoxyd-Harz (mit Proportionen für Epoxid-Harz-Komponenten wie vom Hersteller angegeben). Verwenden Sie alle Komponenten aus der gleichen Charge. Lassen Sie die Harz gefüllten Probenfläschchen über Nacht auf einem Rotor.
  4. Proben in Harz einbetten.
    1. Ersetzen von 50: 50-Harz mit 75 % Harz (25 % Aceton) und 3 h, gefolgt von weiteren Inkubation/Infiltration in der 100 % Harz für 4 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Ersetzen Sie 100 % Harz mit frischen 100 % Harz zu, und lassen Sie die Probengefäße Übernachtung für tieferes Eindringen des Harzes in den Gewebeproben.
    3. Nehmen Sie Proben aus dem Fläschchen und legen Sie sie in Containern, die Ofen-freundlich sind und eine flache Basis; Aluminium oder Silberfolie Tassen backen kann zum Beispiel für diesen Zweck verwendet werden.
    4. Gießen Sie vorsichtig (um Verschiebung der Proben zu vermeiden) frisches Harz über die Proben (so einbetten Proben im Harz) und Harz und Proben in einem Ofen bei 60 ° C für 48 h polymerisieren.
  5. Neu richten Sie Harz Blöcke zu Bildzellen im Querschnitt aus.
    1. Erhalten Sie 1 µm dicken Messstrecken aus der Harz-Blöcke mit ein regungsloses mit einem Glas Messer Zelle Ausrichtung24zu beurteilen.
    2. Färben die dicken Testabschnitte für 20 s mit 1 % Toluol blau und 1 % Borax.
    3. Muskel Zelle Ausrichtung unter dem Hellfeld-Mikroskop zu untersuchen.
    4. Basierend auf der Ausrichtung abgeleitet aus den Bildern der gefärbten Messstrecken, neu auszurichten, längs oder schräg ausgerichtet (ähnlich wie Abbildung 2A) Harz-Blöcke, um sicherzustellen, dass das Glas Messer Zellen ausgesetzt sind, so dass sie im Querschnitt (geschnitten werden ähnlich wie Abbildung 2 b).
  6. Bild Gewebeschnitte mit Elektronenstrahl-Tomographie.
    1. Semi-dünne Abschnitte erhalten (~ 300 nm) des umorientiert Gewebes Blöcke mit einem Diamant Messer und übertragen die Abschnitte auf Kupfer Raster25.
    2. Färben Sie die Dicke Abschnitte mit 2 % UA und Sato Blei25.
    3. Kolloidale Goldpartikel auf beiden Seiten der Abschnitte25anwenden.
    4. Erhalten Sie Sätze von Einzel- oder Doppel-Mittellinie Tilt-Serie der projizierten Bilder von-70 ° bis + 70 °25.
  7. IMOD20 verwenden, um das 3D-Bild Stapel (eine Reihe von 2D Bildern, die 3D Informationen ein einzelnes Elektron Tomographie Abschnitts enthalten) rekonstruieren der Zelle. Im nächsten Schritt wird diese rekonstruierten Stapel segmentiert werden.

3. segment Myofibrillen und Mitochondrien Regionen aus dem EM 3D-Bild Dataset

  1. Führen Sie das IMOD Programm "3dmod".
  2. Innerhalb der grafischen Benutzeroberfläche von 3dmod geben Sie die Adresse der ".rec" oder ".mrc"-Datei, die enthält die 3D rekonstruiert Bild Dataset der Zelle (in Schritt 2.7 erzeugt) in das Textfeld mit der Bezeichnung "Image-Dateien:", dann drücken Sie "OK".
  3. Unter dem Menü "Datei", wählen Sie neues Modell, dann speichern Sie die Datei mit einem entsprechenden Namen mit der "Save-Modell als"... Menüpunkt unter "File".
    Hinweis: Ein Objekt in IMOD kann eine Sammlung von segmentierten Komponenten enthalten, aus denen sich das "Objekt". Standardmäßig enthält ein neues Modell ein neues Objekt mit der Id "#1".
  4. Wählen Sie unter Menü "Spezial" "Zeichenwerkzeuge". Dadurch wird eine neue Symbolleiste wie gezeigt in der Abbildung 3Ageöffnet.
    Hinweis: Es gibt verschiedene Tools, die verwendet werden können, um Konturen um die verschiedenen Organelle Grenzen zu erstellen. Weitere Informationen über Möglichkeiten zur Verwendung dieser Tools finden Sie in der IMOD20 Dokumentation.
  5. Wählen Sie die Option "Formen" im Menü "Zeichenwerkzeuge", und bewegen Sie die Maus über in das Bildfenster; eine kreisförmige Kontur zentriert auf den Mauszeiger wird angezeigt.
  6. Ziehen Sie durch gedrückt halten der mittleren Maustaste über einem Mitochondrium (dunklere Bereiche der Image-Dateien, wie durch Abgrenzungen mit grünen Höhenlinien in Abbildung 3A) den Umfang des Kreises Kontur in die Form seiner Grenze.
  7. Sobald die Konturierung der Mitochondrium Grenze abgeschlossen ist, lassen Sie die mittlere Taste und wiederholen Sie die Schritte 3.6 für jedes Mitochondrium in den Daten. Jede Kontur wird von IMOD als eine neue Kontur innerhalb des gleichen Objekts automatisch erkannt werden.
  8. Unter den "Edit | Objekt "-Menü, wählen Sie"Neu", um ein neues Objekt zu erstellen. Dies erhöht die Gesamtzahl der Objekte von einem automatisch und weisen Sie diese Zahl auf das neue Objekt.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 3.6 und 3.7 Myofibril Konturen zu segmentieren.
  10. Wiederholen Sie Schritt 3,8, gefolgt von 3,6, Schritt, die Zelle Grenze sowie zu segmentieren.
  11. Speichern Sie die Modelldatei im Menü "Datei".
  12. Führen Sie die folgenden Befehle in einem Befehlszeilenfenster konvertieren Sie jedes Objekt in eine binäre Maske gruppieren, wie in Abbildung 4A-Cdargestellt.
    1. Extrahieren Sie ein bestimmtes Objekt aus dem Modell "Imodextract Objekt Modelfile Outputmodelfile" wo "Objekt" die Anzahl der ist zu extrahierenden Objekt.
    2. Erstellen Sie eine Maske für das Objekt: Imodmop-Maske 255 Outputmodelfile Imagefile outputmask.mrc
    3. Konvertieren Sie die Datei in ein Tif-Stack: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. Erstellen Sie ein Finite-Elemente-Netz aus den segmentierten Komponenten

  1. Iso2mesh ist eine frei verfügbare MATLAB-Programm, TIFF Bild Stapel in volumetrischen tetraedrischen finite-Elemente-Netze zu konvertieren. Herunterladen und iso2mesh von iso2mesh.sourceforge.net die MATLAB-Pfad hinzuzufügen.
  2. Laden Sie die Source-Codes und Daten RyR Cluster auf dem Netz von Github Website https://github.com/CellSMB/RyR-simulator zu simulieren.
  3. Starten Sie die CardiacCellMeshGenerator MATLAB-Anwendung (Abbildung 5).
  4. Laden Sie die verschiedenen Organelle Komponente Masken in MATLAB mit den drei Tasten auf der linken oberen Seite des GUI.
  5. Erstellen Sie ein weiteres binäres Bild-Stapel, die Lücken zwischen den Myofibrillen und Mitochondrien wie in Abbildung 6Aabgrenzt.
    1. ImageJ zu öffnen.
    2. Mit Hilfe der Datei | Im Dialog, die Myofibrillen und Mitochondrien TIFF-Stapel ins Programm zu laden.
    3. Das Bild-Zusatz-Plugin zu initiieren, durch die Auswahl "Prozess | Rechner Plus ".
    4. Wählen Sie die Myofibril Bildstapel als i1, die Mitochondrien Stack als i2 Bild, und wählen Sie den Operator "Hinzufügen". Klicken Sie auf "OK".
    5. Nachdem ein neue Bild-Stack, das Ergebnis der 4.5.4 darstellt angezeigt wird, wählen Sie "Bearbeiten | Invert"um ein Bildstapel ähnlich wie Abbildung 6Azu produzieren.
  6. Laden Sie die Datei mit den binären Bildstapel der Lücken zwischen den Myofibrillen und Mitochondrien durch Drücken der Taste "RyRGapsFile" auf das CardiacCellMeshGenerator-Programm.
  7. Drücken Sie "Erzeugen Mesh" auf der grafischen Benutzeroberfläche. Dies löst die iso2mesh Befehl v2m mit der Option "Cgalmesh", einem Tetraedernetz ähnlich wie Abbildung 4Ezu generieren. Drei Dateien werden am Ende dieses Schrittes: eine .ele-Datei, eine .face-Datei und eine .node-Datei, die die Liste der Knoten, aus denen sich die Elemente, die Knoten, aus denen sich die Gesichter und die Koordinaten der Knoten enthält , beziehungsweise.

5. mathematisch Karte die räumlich unterschiedliche Dichte von Ionenkanälen von Interesse auf der Finite-Elemente-Netz.

  1. Generieren Sie die notwendigen Eingaben für RyR-Simulator durch Drücken der Taste beschriftet generieren RyR-Simulator-Eingänge auf der grafischen Benutzeroberfläche.
    Hinweis: Die Schaltfläche löst eine Funktion generateRyRsimulatorInputs.m, die die folgende Informationen aus Schritt 4 verwendet, um die Eingänge zu generieren:
    (1) OutDir: der Ort, um Output-Dateien, die für RyR Cluster Simulation notwendig sind.
    (2) Imres: die Pixel-Auflösung in den drei Richtungen der Bild-Stacks.
    (3) Myofibril_file: die Datei mit den binären Bildstapel wie in Abbildung 4 b.
    (4) Sarcolemma_file: die Datei mit den binären Bildstapel wie in Abbildung 4A.
    (5) Ryrgaps_file: die Datei mit den binären Bildstapel wie in Abbildung 5A.
    1. Nachdem diese Funktion ausgeführt wird, überprüfen Sie, ob die folgenden Dateien in dem Verzeichnis angegeben als OutDir Pfad erstellt wurden:
    • d_axial_micron.txt, die axialen Abstand zwischen der Position der Z-Scheibe und der Rest der Pixel im Bildstapel darstellt.
    • d_radial_micron.txt, die die euklidische Entfernung (ausgenommen die axiale Komponente) von jedem Pixel im Satz möglicher RyR Cluster Standorte auf die Pixel auf der Z-Scheibe-Ebene darstellt.
    • W_micron.txt, die die Liste der Raumkoordinaten aller verfügbaren Positionen darstellt, denn RyR Cluster anwesend zu sein.
    • Die restlichen 3 Dateien in den Ordner enthalten das Suffix "_pixel" anstatt "_micron" zu bezeichnen, dass die Werte innerhalb dieser Dateien in Pixel Koordinaten Form geschrieben worden sein.
  2. RyR Cluster Ausschüttungen auf die binäre Bildstapel der Myofibrillen zu simulieren.
    1. Drücken Sie die Schaltfläche "Open RyR-Simulator in R", R-Programm zu initiieren.
    2. Auf dem R-gui, wählen Sie "Datei | Öffnen"und suchen Sie die Datei"Settings. R"innerhalb des Pakets RyR-Simulator (RyR-Simulator/Quelle/Einstellungen. (R).
    3. Auch öffnen Sie die Datei Ryr-Simulator-Parallel. R (befindet sich im RyR-Simulator/Quelle/Ryr-Simulator-Parallel. (R). Umgebungen wie Rstudio (https://www.rstudio.com) oder eine einfache Kommandozeilen-Schnittstelle verwendet werden können, z.B. mit dem R64-Befehl in eine Schale oder Befehl Fenster.
    4. Ändern Sie die Parameter in den Einstellungen. R-Datei siehe unten:
      1. Die Adresse des Ordners, die Dateien in 5.1.2 für ein experimentell gewonnenen konfokale Bildstapel RyR Cluster und Myofibrillen enthält Path2 gesetzt.
        Hinweis: Die Github Repository Ordner Eingabe-Dateien/Meister-Cell / bereits enthält Dateien, die erstellt wurden für eine zuvor gesammelten Bildstapel.
      2. Legen Sie Path4 auf eine Adresse des Ordners Speicherort der Dateien, die in Schritt 5.1.2 generiert wurden.
      3. Sollwert Path3 in einen Ordner, wo der Benutzer die simulierten RyR Cluster Standorte gerettet werden will.
      4. Satz N, die Anzahl der RyR Cluster im Modell (in der Regel im Bereich von 200 bis 300) simuliert werden.
      5. Etol, eine Einstellung, die Differenz zwischen der experimentell gemessenen räumlichen Verteilung von RyR Clustern und das Modell simuliert räumliche Verteilung von RyR Clustern Toleranz festgelegt.
      6. Legen Sie NumIter, die Anzahl der Versuche beschränken, mit denen die RyR-Simulator um ein simulierte RyR Cluster Muster zu finden, die den Etol Wert gerecht wird.
        Hinweis: Werte für Etol und NumIter, typische Werte in den Einstellungen festgelegt wurden. R-Datei.
      7. Legen NumPatterns die Anzahl verschiedener RyR Cluster Muster, die die Benutzer simulieren möchte (es ist in der Regel nützliche Praxis 99 Patterns für statistische Vertrauen zu simulieren).
      8. Set NumCores ermöglichen die Verwendung von mehreren CPU Threads (Kerne) für schnellere Parallelverarbeitung mit R, die Punkt-Muster zu simulieren.
    5. Überprüfen Sie, ob die folgenden Pakete installiert sind mit dem Paketinstaller gui in R: Schnee, DoSNOW, Doparallel, Foreach, Iteratoren und Rgl.
    6. Führen Sie den Simulator durch Eingabe des folgenden Befehls im Befehlsfenster R: Quelle ("Pfad zur Ryr-Simulator-Parallel. R', Chdir = TRUE)
      Hinweis: Die Ausgabe des Programms RyR-Simulator ist eine Liste von .txt-Dateien (eine NumPatterns-Datei wird generiert werden), die Koordinate Listen in N Zeilen enthalten und 3 Spalten, die die x-, y- und Z-Koordinaten der N darstellen simuliert RyR Cluster.
  3. Punkte als räumliche Dichte auf ein Rechenmodell mit der CardiacCellMeshGenerator Karte.
    1. Durch Auswahl der Schaltfläche mit der Beschriftung "Select RyR Punktedatei", wählen Sie eine simulierte RyR Cluster Verteilung Textdatei von denen, die durch RyR-Simulator ausgegeben wurden.
    2. Führen Sie "RyR Dichte Mapper" auf dem GUI in MATLAB. Dies wird die räumlichen Positionen der simulierten RyR Cluster in der txt-Datei in Schritt 5.3.1 auf der finite-Elemente-Netz zuordnen, die im Schritt mit einer Methode namens eine sphärische Kernel Intensität Schätzer Methode264,8 generiert wurde.
      Hinweis: Die Ausgabe von diesem Schritt ist eine Datei mit der Erweiterung .txt, die eine Liste von Werten für die numerische Dichte des ionenkanals pro Volumeneinheit sphärische bei jedem Rechennetz Knoten enthält.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abb. 2 bis Abb. 7 bieten repräsentative Ergebnisse mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll: (i) visualisieren und Neuausrichtung der Gewebe Blöcke für Cross-Sectional Elektronenmikroskopie Ansichten; (Ii) erzeugen einen Bildstapel 3D Elektronenmikroskopie; (Iii) Segmentierung subzellulären Ultrastruktur für Organellen von Interesse; (iv) Generierung eines finite-Elemente-Netzes mit iso2mesh; (V) simulieren eine realistische...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das obige Protokoll beschreibt wichtige Schritte, um ein neuartiges finite-Elemente geometrischen Modell des Cardiomyocyte Ultrastruktur erzeugen. Die Methode ermöglicht rechnerische Verschmelzung der verschiedenen Mikroskopie (oder andere Daten grundsätzlich) Modalitäten eine umfassendere Computermodell der Cardiomyocyte Dynamik entwickeln, die Details der räumlichen Zellarchitektur enthält. Derzeit gibt es kein anderes Protokoll zur Verfügung, um ein solches Modell für eine Cardiomyocyte zu erstellen.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Royal Society von New Zealand Marsden schnell starten Grant 11-UOA-184, Human Frontiers Science Programm Research Grant RGP0027/2013 und die australische Forschung Rat Discovery Project Grant DP170101358 unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
NatriumchloridSigma-Aldrich746398
CalciumchloridSigma-AldrichC8106
MagnesiumchloridSigma-AldrichM2393
NatriumbicarbonatSigma-AldrichS5761
KaliumchloridSigma-AldrichP5405
DextroseSigma-AldrichD9434
NatriumhydroxidSigma-AldrichS8045
ProbenecidSigma-AldrichP8761
2,3-Butandion-MonoximSigma-AldrichB0753
25% Glutaraldehyd EM Grade (500 ml Flasche)Merck354400-500ML
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
GerbsäureSigma-Aldrich403040-500G100 g
NatriumcacodylatSigma-AldrichC0250
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-AldrichP4593
OsmiumtetroxidSigma-Aldrich75632-10 ml4% in Wasser, 5 ml Flasche (oder 10 ml Flasche auch erhältlich)
UranylacetatEM Sciences2240025g Flasche
KaliumferrocyanidMerck Millipore104973
ToluolblauSigma-AldrichT3260
BoraxSigma-AldrichS9640auch als Natriumborat bezeichnet
EthanolSigma-Aldrich792780Auf unterschiedliche Prozentsätze verdünnt mit reines Wasser
AcetonEM SciencesRT10017
Resin KitEM Sciences14040ACM Durcupan funktioniert gut
SalzsäureSigma-AldrichH98921Normallösung
Ausrüstung
UltramikrotomLeicaEM UC7
Transmissionselektronen MikroskopThermoFisher ScientificTecnai F30http://www.leica-microsystems.com/
RetortenständerProscitechT752
TubingBioStrategy75831-346für Langendorff-Perfusionsapparate, 3 mm Durchmesser wird empfohlen, ist aber nicht zwingend erforderlich
StopcocksSDRQP13813für Langendorff-Schläuche; Produkt ist nur ein Beispiel, der Benutzer kann beliebige auswählen
RetortenständerklemmenProscitechT715
KunststoffspritzenSDRQPC1108für Lösungen an Langendorff-Apparaten
Kanülen-Seidennaht, 7-0TeleFlex15B051000zum Binden des Herzens an Langendorff-Apparaturen
Kanüleaus Stahlnadel mit 3 mm Außendurchmesser
Gummi-PetrischalematteProscitechH068zur Verwendung als Schneidebrett bei der Dissektion mit festem Herzen
RasierklingenProscitechL056zum Schneiden von festen Herzen in kleine Blöcke für die EM-Verarbeitung
GlasflaschenBioStrategy89000-236zur Lagerung von Lösungen bei der Gewebefixierung und -verarbeitung für EM-Becher
BioStrategy213-0477zur vorübergehenden Lagerung von Lösungen und während der Perfusion
SzintillationsfläschchenBioStrategy548-2170für Gewebeproben während der EM-Verarbeitung
DissektionskitProscitechT161für die Dissektion von Tieren
SpritzenfilterProscitechWS3-02225Sfür die Aufreinigung von Uranylacetat
Aluminium/Silberfolien-BackförmchenAus jedem Backwarenlager
Dupont Diamond MesserDie VersionBioStrategy 102680-780mit 35-Grad-Winkel erzeugt die besten Schnitte.
Kolloidales GoldBBI SolutionsEM. GC1515 nm kolloidales Gold
EM-Mesh-GitterProscitechGCU150eine Vielzahl von Größen kann getestet werden: GCU150h, GCU200h zum Beispiel
Entsorgungspipetten aus KunststoffProscitechLCH20am besten für die Verwendung von Einwegartikeln aus Kunststoff, insbesondere bei der Arbeit mit Harz
Software
SerialEMTomographie-Erfassungan der Universität von Boulder
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMODUniversity of BoulderBildausrichtung und Segmentierung
iso2meshverfügbar bei http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji oder ähnliche BildverarbeitungssoftwareImageJFiji ist Just Image Jbei https://fiji.sc verfügbar für die Manipulation von Binärbildern Stacks
RyR-Simulator Codes/DatenCellSMB Gruppeverfügbar bei https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGeneratorCellSMB Gruppekommt mit RyR-Simulator unter dem Ordner "gui-version"
R-statistics softwareR-projectDownload von https://www.r-project.org
spatstatR-projectinstall via R program
rglR-projectinstall via R program
doparallelR-projectinstall via R program
foreachR-projectinstall via R program
doSNOWR-projectinstall via R program iterators
iteratorsR-projectinstall via R program
in EM-Qualität R-project install via R program

References

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