Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

Zusammenfassung

Ein standard Western Blot-Protokoll wurde für die Analyse möglichst wenige 500 Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen optimiert. Optimierung beinhaltet sorgfältige Handhabung von die Zellprobe, Begrenzung der Transfers zwischen Röhren und direkt Lyse der Zellen im Probenpuffer Laemmli.

Zusammenfassung

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind selten, mit der Maus Knochenmark enthält nur ~ 25.000 phänotypischen lange term repopulating HSCs. Ein Western Blot Protokoll wurde optimiert und eignet sich für die Analyse einer kleinen Zahl von Hsz (500-15.000 Zellen). Phänotypische HSCs wurden gereinigt, genau gezählt und direkt in Laemmli Probenpuffer lysiert. Lysates mit gleicher Anzahl von Zellen analysiert wurden durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE), und der Fleck war vorbereitet und nach standard Western Blot-Protokolle bearbeitet. Mithilfe dieses Protokolls 2.000-5.000 HSCs routinemäßig analysiert werden können, und in einigen Fällen Daten erhalten Sie von nur 500 Zellen, im Vergleich zu den 20.000 bis 40.000 Zellen in den meisten Publikationen berichtet. Dieses Protokoll sollte generell für andere hämatopoetischen Zellen, und ermöglicht die routinemäßige Analyse einer kleinen Zahl von Zellen unter Verwendung von standard-Labor-Verfahren.

Einleitung

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind selbst erneuernde Zellen, die zu allen Blut Linien führen können. Sie sind relativ seltene Zellen im Knochenmark, biochemische Analysen schwierig zu rendern. Geeignet für die Analyse von seltenen Zellen, wie Durchflusszytometrie, Ansätze wurden äußerst nützlich zur Quantifizierung der relativer Mengen der Zelle oberflächenmarker und intrazelluläre Proteine. Aber die Analyse von intrazellulären Proteinen erfordert den Einsatz von Zelle Permeabilisierung Verfahren zur Antikörper-Zugriff zu ermöglichen, und nicht alle Zelle Oberfläche Epitope überleben diese Verfahren^1,2. ....

Protokoll

Alle Verfahren müssen im Einklang mit institutionellen Tiernutzung und Pflege-Richtlinien durchgeführt werden. Das Verfahren wurde entwickelt für die Analyse von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSCs und HPs), aber für die Analyse von anderen Zellpopulationen angepasst werden kann.

1. Flow Cytometry Isolation der murinen HSCs und HPs

1. Murine Knochenmarkzellen zu ernten, wie in der Literatur⁶beschrieben.
   Hinweis: In die in Abbildung 1 und Abbildung 2dargestellten Daten, Knochenmark von Mäusen C57BL/6J geerntet wurde.
2. ....

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse von 500-2.000 gereinigten HSCs und HPs sind in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt. Das β-Aktin-Signal in Abbildung 1 kann aus so wenig wie 500 HSCs erkannt werden und HPs gereinigt aus dem Knochenmark von einem einzigen Mausklick. Beachten Sie, dass die Lysates in 1,5 mm Brunnen laden ein viel stärkeres Signal von 500 HPs als laden in 3,0 mm Brunnen produziert.

Diskussion

Western Blot ist ein verbreitetes Verfahren zur Erkennung von spezifischen Proteinen und die Aktivierung der Signalwege in Geweben oder Zellen. Durch die Einführung von kleinen Anpassungen zu einem häufig verwendeten Verfahren, konnten wir routinemäßig 15 verschiedene Proteine (Table of Materials) in 15.000 HSCs und in einigen Fällen in so wenig wie 500 HSCs erkennen. The Most wichtige Schritte in diesem Protokoll sind: (1) genau zählen die Zellen, 2) minimieren die Anzahl der Transfers zwischen Röhren u.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis-Lösung	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1,5M Tris-HCl pH8,8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1,0M Tris-HCl pH6,8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammoniumpersulfat	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
Mini-Protean 3 Kamm	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfersystem	Bio-Rad	1704155EDU	Transfer
PowerPac HC Netzteil	Bio-Rad	1645052EDU	Elektrophorese
Imaging System	Bio-Rad	1708195	Signaldetektion
4x Laemmli Probenpuffer	Bio-Rad	1610747EDU	Probenvorbereitung
10x Tris/Glycin/SDS Elektrophoresepuffer	Bio-Rad	1610732EDU	Elektrophorese
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	Probenvorbereitung
RTA Mini PVDF Transfer Kit, für 40 blots	Bio-Rad		1704272 Transfer
Protease-Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	Probenvorbereitung
Phosphatase-Inhibitor Cocktails	Gold Biotechnology	GB-450-1	Probenvorbereitung
EIF4G	Zellsignalisierung	2469	WB-Antikörper, validiert in 1000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): Abb2
p-Rps6	Zellsignalisierung	4858	WB Antikörper, validiert in 1000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): Abb2
Aktin (HRP konjugiert)	abcam	ab49900	WB Antikörper, validiert in 500 Zellen Antikörperkonzentration: 1:5000 Referenz (Abbildung): Abb1, Abb2
LC-3	Abcam	ab48394	WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. 5)
S6	Cell Signaling	2317	WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. 4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: Referenz 1:1000 (Abbildung): ref5 (Abb4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb4)
HSP90	Zellsignalisierung	4877	WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. 5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. S1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. S1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. S1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB-Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. S1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:1000 < br / > Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. S1)
Aktin	Santa Cruz	sc-47778	WB Antikörper, validiert in 15000 Zellen Antikörperkonzentration: 1:3000 Referenz (Abbildung): ref5 (Abb. 4)
	Miltenyi Biotec	130-090-858	Reinigung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen
LS-Säulen	Miltenyi Biotec	130-041-305	Reinigung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen
SCF	PeproTech	250-03	Phosphorylierungsstimulation
APC-Cy7 c-kit Antikörper	ThermoFisher	A15423	Zellsortierung
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	Küvettensortierung
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	Küvettensortierung
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	Küvettensortierung
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	Küvettensortierung
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	Küvettensortierung
Abstandsplatten mit 1,0 mm integriert Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	Membran blockierendes
Serum	Atlanta Biologicals	A12450	Medium Supplement
Zellzähler	Invitrogen	AMQAF1000	Zellzählung
Hämozytometer	ThermoFisher	S17040
Zellzählflim	Denville Scientific	E3012	Signaldetektion
medizinischer Filmprozessor	Konica	SRC-101A	Signaldetektion
Supersignal West Femto Substrat mit maximaler Empfindlichkeit	Therom Scientific	34096	Signaldetektion
Allegra X-15R Zentrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	Probe Vorbereitung
BLUEstain Proteinleiter	Gold Biotechnology	P007-500	Elektrophorese
Zellsortierer	BD	FACSAria II	Probenvorbereitung
Incublock	Denville Scientific	I0510	Elektrophorese