Summary
De menselijke huid fungeert als een eerste lijn van verdediging tegen de externe omgeving. Presenteren we een methode voor het isoleren van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid. Deze geïsoleerde keratinocyten zijn nuttig in talrijke experimentele opstellingen en een zeer geschikt model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen in cutane biologie in vitro.
Abstract
De belangrijkste functie van keratinocyten is bedoeld als de structurele integriteit van de epidermis, waardoor het behoud van een mechanische barrière voor de buitenwereld. Bovendien, spelen keratinocyten een essentiële rol in de inleiding, het onderhoud en de regulering van epidermale immuunresponsen door die deel uitmaken van het aangeboren immuunsysteem reageert op antigene prikkels op een snelle en niet-specifieke wijze. Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid, en aantonen dat deze cellen op calcium-geïnduceerde terminal differentiatie, zoals gemeten door een verhoogde expressie van de differentiatie markering involucrin reageren. Bovendien laten we zien dat de geïsoleerde keratinocyten inspelen op IL-1β-geïnduceerde activering van intracellulaire signaalroutes zijn zoals gemeten door de activering van de p38 MAPK-pathway. Tezamen, beschrijven we een methode voor isolatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid. Omdat de keratinocyten de overheersende celtype in de opperhuid zijn, is deze methode handig om te bestuderen van de moleculaire mechanismen in cutane biologie in vitro.
Introduction
De huid is het grootste orgaan van het menselijk lichaam en dient als een beschermende barrière tegen de externe omgeving. De huid bestaat uit twee lagen: de dermis en de epidermis, waar de opperhuid de buitenste laag van de huid vormt. Het meest voorkomende celtype in de opperhuid is de keratinocyten bestaande uit meer dan 95% van de cel massa1,2. De keratinocyten worden onderhouden in verschillende stadia van differentiatie in de opperhuid en basale, stekelig, korrelig en cornified lagen die correspondeert met specifieke stadia van differentiatie3worden geordend. De primaire functie van keratinocyten is bedoeld als de structurele integriteit van de epidermis, waardoor het produceren van een intacte barrière tegen de buitenwereld.
De keratinocyten ook de eerste lijn van verdediging tegen ziekteverwekkers in de huid, en daarom een belangrijke rol spelen in het aangeboren immuun reactie4,5. Gasbedwelming met behulp van de keratinocyten externe prikkels leidt tot activering van intracellulaire signaalroutes en vervolgens, productie van een aantal verschillende inflammatoire mediatoren, met inbegrip van cytokines, chemokines en antimicrobiële peptiden. Deze Keratinocyt afkomstige eiwitten deelnemen aan de ontstekingsreactie door werven en immune cellen zoals dendritische cellen, neutrofielen en specifieke T-cellen-6,7te activeren. Omdat keratinocyten een cruciale rol in vele biologische processen spelen, was de grondgedachte achter de techniek gepresenteerd hier dus, voor het genereren van een in vitro model voor de studie van biologie van de huid. Primaire Keratinocyt culturen neonatale voorhuid verkregen worden vaak gebruikt voor het bestuderen van8,9van de biologie van de huid. Echter, met de hier beschreven techniek keratinocyten van beide geslachten zijn verkregen wat resulteert in een hogere biologische diversiteit van de cellen.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en de generatie van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid, met inbegrip van onderhoud en de bevriezing van de keratinocyten. Het algemene doel van deze methode is het genereren van primaire menselijke keratinocyten die kan worden gebruikt als een model voor cutane biologie in vitrostudie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De collectie van monsters van de huid van gezonde volwassen vrijwilligers ondergaan plastische chirurgie vereist de goedkeuring van de ethische Commissie in de gastinstellingen. Dit protocol is goedgekeurd door de regionale ethische commissie voor regio Midtjylland, Denemarken (M-20110027). De hier beschreven methode is afgeleid van soortgelijke studies door Maciaq et al. 10 en Liu en Karasek11.
1. isolatie van keratinocyten van menselijke huid
- Beginnen met het maken van de volgende oplossingen: 50 mL oplossing van 0,25% trypsine en 0,1% glucose in DPBS. Mix en filter steriliseren (0,2 µm) de oplossing. 10 mL van RPMI-1640 + 2%-oplossing voor FBS, 50 mL DPBS en Keratinocyt serumvrij medium (KSFM) voor te bereiden. KSFM supplementen en 250 µL van gentamycine toevoegen aan 500 mL KSFM. Vooraf warm de oplossingen tot 37 ° C vóór gebruik.
- Huid van gezonde volwassen vrijwilligers ondergaan plastische chirurgie te verzamelen. De monsters van de huid gebruikt zijn ongeveer 10 cm x 15 cm, maar kunnen variëren in grootte. Houd de huid koel under vervoer door het gasmonster huid in een doos van de piepschuim met een koelelement. Indien nodig kan het monster van de huid worden achtergelaten bij 4 ° C's nachts.
- Verwijderen van vet uit onder de sectie van de huid met behulp van gesteriliseerde schaar, scalpels en pincet.
- Ontzetten uit het gedeelte van de huid (ongeveer 10 cm x 15 cm) op een steriele cover op de top van een plaat met behulp van naalden. Eerst Reinig de huid met een zeem droog gesteriliseerd gaas. Dan Reinig de huid met behulp van een pad met gesteriliseerd gaas met 70% ethanol.
- Met behulp van een voet planer, gesneden van de bovenste laag (opperhuid) van de sectie van de huid en zet het in een 9 cm petrischaal. Dan, voeg onmiddellijk 25 mL van de oplossing van de DPBS/trypsine/glucose (bereid in stap 1.1) aan de petrischaal. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Met behulp van een precisiepipet verwijderen van de DPBS/trypsine/glucose oplossing uit de petrischaal en voeg 10 mL van RPMI-1640 + 2% FBS voor inactivering van de trypsine.
- Met behulp van twee pincet, nu laat de epidermale cellen in het medium door voorzichtig afschrapen en schudden van de epidermale zowel de dermale compartiment van de secties van de huid.
- Filtreer de epidermale celsuspensie door een metalen filter (1 mm gat grootte), en verzamelen in een tube van 50 mL. De resterende huid secties toevoegen aan een tube van 50 mL met 10 mL RPMI-1640 zonder FBS en vortex voor 10 s. Filter de opschorting door de metaal filtreer in een tube van 50 mL, met de epidermale celsuspensie. DPBS toevoegen aan een totaal volume van 50 mL.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 450 x g bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet epidermale cellen in ongeveer 10 mL 37 ° C KSFM afhankelijk van de grootte van de cel-pellet. Met behulp van de Trypan blauw kleuring methode onder Microscoop cellen tellen. Het aantal cellen verkregen uit een 10 x 15 cm huid sectie is ongeveer 50-100 x 106 cellen. Overdragen aan elke 75 cm2 cultuur maatkolf, 8 x 106 cellen samen met 12 mL van 37 ° C KSFM. Voorzichtig schudden de kolven cultuur om te zorgen voor gelijkmatige verdeling van de cellen.
- Incubeer de keratinocyten in een incubator 37 ° C met 100% vochtigheid en 5% CO2. Het wijzigen van het medium na 2 dagen en drie keer wekelijks. Passage cellen wanneer de cultuur is 70-80% heuvels, die ongeveer 2 weken afhankelijk van de snelheid van de proliferatie van de keratinocyten duurt.
2. passaging van keratinocyten
- Verwarm de juiste hoeveelheid trypsine-EDTA-oplossing 0,05% tot 37 ° C in een broedstoof. Gebruik 4.5 mL trypsine-EDTA-oplossing 0,05% voor een 75 cm2 cultuur kolf.
- Medium verwijderen uit de cellen en voeg 4.5 mL/75 cm2 cultuur kolf vooraf opgewarmd trypsine-EDTA-oplossing 0,05% aan de cellen. Plaats de kolf van de cultuur in de incubator (37 ° C) en na ongeveer 5 min, controleren onder de Microscoop of de cellen zijn begonnen met het losmaken.
- Wanneer ongeveer 50% van de cellen hebben losgemaakt, zachtjes sloeg de kolf cultuur tegen de hand om de resterende cellen los te maken. Vervolgens om de inactivering van de trypsine, 6 mL RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) toevoegen aan de kolf van 75 cm2 cultuur en de celsuspensie overbrengen in 50 mL tubes.
- Spoel de cultuur kolven met 3 mL RPMI 1640 + 2% FBS en toevoegen aan de 50 mL tubes. Centrifugeer cellen gedurende 10 minuten bij 450 x g bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de Ingehuld cellen in 10 mL KSFM (37 ° C). Cellen tellen en 3 x 106 cellen overbrengen in een maatkolf van 150 cm2 cultuur samen met 20 mL KSFM (37 ° C). Voorzichtig schudden de kolf cultuur om te zorgen voor gelijkmatige verdeling van de cellen. Bevriezen van de cellen wanneer de cultuur is 80-90% confluente, die duurt ongeveer 4-6 dagen afhankelijk van het tempo van de proliferatie van de keratinocyten (zie sectie 3, bevriezing protocol hieronder). Vouw de keratinocyten voor het genereren van de juiste bevroren voorraden.
3. de bevriezing van keratinocyten
- Verwarm de juiste hoeveelheid trypsine-EDTA-oplossing 0,05% tot 37 ° C in een broedstoof. Gebruik 9 mL trypsine-EDTA-oplossing 0,05% voor een kolf van 150 cm2 cultuur.
- Medium verwijderen uit de cellen en voeg 9 mL/150 cm2 cultuur kolf vooraf opgewarmd trypsine-EDTA-oplossing 0,05% aan de cellen. Plaats de kolf van de cultuur in de incubator (37 ° C) en na ongeveer 5 min, controleren onder de Microscoop of de cellen zijn begonnen met het losmaken.
- Wanneer ongeveer 50% van de cellen hebben losgemaakt, zachtjes sloeg de kolf cultuur tegen de hand om de resterende cellen los. Vervolgens om de inactivering van de trypsine, Voeg 12 mL RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) tot de 150 cm2 cultuur kolf en gecombineerd de celsuspensie 50 mL buizen.
- Spoel de cultuur kolven met 6 mL RPMI 1640 + 2% FBS en toevoegen aan de 50 mL tubes. Centrifugeer de buizen voor 10 min bij 450 x g bij 4 ° C. Ijskoude cel bevriezing medium (KSFM + 10% DMSO) voor te bereiden.
- Resuspendeer de pellet cel in KSFM + 10% DMSO, tellen de cellen en cellen bij een dichtheid van 6 x 106 cellen/mL met behulp van standaard slow-bevriezing cryopreservatie methoden12bevriezen.
- Bewaren de keratinocyten in vloeibare stikstof (damp fase) tot klaar voor gebruik.
4. ontdooien, en bevroren keratinocyten kweken
- Snel ontdooien de juiste bevroren flesjes in een waterbad 37 ° C. Hiermee kunt u dat 70% ethanol Reinig de buitenkant van de cryovial. Het juiste aantal cellen (ongeveer 15.000 cellen/cm2) overbrengen in een maatkolf van cultuur en onmiddellijk voorverwarmde groeimedium (KSFM) toe te voegen aan de maatkolf cultuur.
Elke grootte van cultuur kolven kan afhankelijk van de opzet van het experiment worden gebruikt. - Gebruik 5 mL gestolde voedingsbodem voor een 25 cm2 cultuur kolf.
Opmerking: Onze gegevens is gebleken dat gemiddeld 95% van de cellen geïsoleerd door het protocol hier beschreven positief voor de Keratinocyt-marker cytokeratine-1413 zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Calcium-geïnduceerde Terminal differentiatie
Menselijke keratinocyten ondergaan terminal differentiatie op een behandeling met calcium14,15,16. Primaire menselijke keratinocyten waren geïsoleerd en gekweekt zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Wanneer ongeveer 50-60% heuvels, de cellen werden gestimuleerd met calcium (1.2 mM) of voertuig en foto's van de cellen werden genomen op dag 0, 1 en 2. Figuur 1 toont de morfologische veranderingen van de keratinocyten waargenomen op calcium stimulatie.
De expressie van de Involucrin is verhoogd bij Calcium stimulatie
Gekweekte menselijke keratinocyten waren gegroeid tot ongeveer 50-60% heuvels waarna de cellen werden gestimuleerd met calcium (1.2 mM) of een voertuig voor 24 en 48 uur. We toonden aan dat parallel met de grotere differentiatie van de cellen zoals waargenomen door de morfologische veranderingen van de keratinocyten, de uitdrukking van mRNA van de differentiatie marker involucrin sterk verbeterd op calcium stimulatie. Na 24 en 48 h van stimulatie, was de involucrin mRNA uitdrukking steeg ongeveer 5.5-fold en 3.5-fold, respectievelijk, in vergelijking met voertuig (Figuur 2).
IL-1β-geïnduceerde fosforylatie van p38 MAPK
Om te bepalen als de geïsoleerde menselijke keratinocyten inspelen op cytokine-geïnduceerde activering van intracellulaire signaalroutes, gekweekte keratinocyten werden gestimuleerd met IL-1β (10 ng/mL) voor verschillende tijdstippen. Binnen 5 min, IL-1β stimulatie geleid tot een snelle activering/fosforylatie van p38 MAPK, zoals bepaald door het westelijke bevlekken. Na 1 h, IL-1β-geïnduceerde p38 MAPK fosforylering had keerde terug naar basale niveau (Figuur 3). Alleen de gefosforyleerd vorm van p38 MAPK was verhoogd, zoals stimulatie van de IL-1β had geen effect op het niveau van de totale proteïne van p38 MAPK (Figuur 3).
Figuur 1 : Representatief beelden van calcium-geïnduceerde differentiatie van keratinocyten. Gekweekte primaire menselijke keratinocyten werden gestimuleerd met voertuig (dH2van O) of calcium (1.2 mM) voor de aangegeven tijdstippen. (A - E) Fase contrast beelden van keratinocyten op dag 0 (A), dag 1 (B en C), en dag 2 (D en E) na calcium stimulatie. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Verhoogd van mRNA uitdrukking van involucrin bij calcium stimulatie. Calcium (1.2 mM) of voertuig (dH2van O) is aan gekweekte primaire menselijke keratinocyten voor de aangegeven tijd punten toegevoegd (n = 3). RNA werd geïsoleerd en de uitdrukking van de differentiatie marker involucrin geanalyseerd door qPCR. RPLP0 (Ribosomal eiwit grote P0) mRNA uitdrukking werd gebruikt voor normalisatie. Resultaten zijn gemiddelde ± S.D. van drie verschillende experimenten. p < 0.05 vergeleken met voertuig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : IL-1β-geïnduceerde fosforylatie van p38 MAPK. Gekweekte primaire menselijke keratinocyten werden gestimuleerd met voertuig (PBS + 0,15% BSA) of IL-1β (10 ng/mL) voor de aangegeven tijdstippen. Eiwithoudende extracten werden geïsoleerd en westelijke bevlekkende analyse die worden gebruikt voor het meten van de gefosforyleerd niveau van p38 MAPK en totale p38 MAPK. Gelijke laden werd gecontroleerd door incubatie met een anti-β-actine antilichaam. Gegevens uit één vertegenwoordiger experiment uit drie worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier hoe gemakkelijk het isoleren van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid, en hoe ze in vitrocultuur. Dit model kan een globale aanvraag voor onderzoek van epidermale celbiologie, en nuttig kan zijn voor onderzoekers ook geïnteresseerd in de studie van cutane ziekten.
Enkele van de voordelen van het protocol hier beschreven is dat in tegenstelling tot de keratinocyten geïsoleerd van neonatale voorhuid verkregen van de pasgeboren mannetjes besnijdenis ondergaat, primaire menselijke keratinocyten van volwassen patiënten geïsoleerd van zowel mannen als vrouwen en elke leeftijd 18 jaar kan bevatten. De biologische diversiteit is dus veel groter in deze cellen ten opzichte van keratinocyten van neonatale voorhuid. Bovendien kunnen relatief grote stukken van huid monsters worden verkregen uit patiënten ondergaan plastische chirurgie, zoals vermindering van de borstoperatie of chirurgie van het gewichtsverlies.
Zoals hierboven vermeld is de epidermis georganiseerd in verschillende lagen die overeenkomt met de specifieke differentiatie fase van de keratinocyten. Om de studie van biologie van de huid, wordt de hier beschreven model beperkt door het ontbreken van een driedimensionale communicatie. De verschillende lagen van de opperhuid, alsmede de verschillende soorten cellen in de huid aanwezig zijn niet geïmiteerd in dit model. Om dit te verhelpen, gelijkwaardige modellen van de menselijke huid kunnen worden gebruikt, die bestaan uit een meerdere lagen epitheel waar keratinocyten onderscheiden bij blootstelling aan een lucht-vloeistof-interface, en dus meer nauw het nabootsen van de inheemse epidermis17, 18,19. Een ander model, die kan worden verkregen om de studie van biologie van de huid is de ex vivo huidmodel, waar huid biopten worden gehouden in culturen op een lucht-liquid interfase als eerder beschreven20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. De auteur heeft geen conflict van belang.
Acknowledgments
De auteur wil Annette Blak Rasmussen en Kristine Moeller bedanken voor hun technische ondersteuning
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J.
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A.
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G.
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
