Summary
Die menschliche Haut wirkt als eine erste Verteidigungslinie gegen die Außenumgebung. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Diese isolierten Keratinozyten eignen sich zahlreiche Versuchsaufbauten und sind ein sehr geeignetes Modell für die Untersuchung der molekularer Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-.
Abstract
Die Hauptfunktion der Keratinozyten soll die strukturelle Integrität der Epidermis, eine mechanische Barriere für die Außenwelt erhalten bleibt. Darüber hinaus spielen die Keratinozyten eine wesentliche Rolle bei der Initiierung, Wartung und Regelung der epidermalen Immunantworten als Teil des angeborenen Immunsystems Reaktion auf Antigene Reize schnell und unspezifisch. Wir beschreiben hier, ein Protokoll für die Isolierung der primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen Haut und zeigen, dass diese Zellen auf Kalzium-induzierte terminal Differenzierung, gemessen durch eine erhöhte Expression von Differenzierung Marker Involucrin reagieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass die isolierte Keratinozyten, IL-1β-induzierte Aktivierung des intrazellulären Signalwege reagieren, wie durch die Aktivierung der p38 MAPK Weg gemessen. Zusammengenommen, beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen. Da die Keratinozyten die vorherrschenden Zelltyp in der Epidermis sind, eignet sich diese Methode zu molekulare Mechanismen in kutane Biologie in-vitro-Studie.
Introduction
Die Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers und dient als eine schützende Barriere gegen die Außenwelt. Die Haut besteht aus zwei Schichten: die Dermis und Epidermis, wo die Epidermis die äußerste Schicht der Haut bildet. Die am häufigsten vorkommenden Zelltyp in der Epidermis ist die Keratinozyten, bestehend aus mehr als 95 % der Zelle Masse1,2. Die Keratinozyten werden in verschiedenen Stadien der Differenzierung in der Epidermis und gliedern sich in basalen, abstehenden, körnige und verhornten Schichten, die bestimmte Phasen der Differenzierung3entsprechen. Die primäre Funktion der Keratinozyten soll die strukturelle Integrität der Epidermis, wodurch eine intakte Barriere nach außen zur Verfügung zu stellen.
Die Keratinozyten auch die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger in der Haut darstellen und daher eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunantwort4,5. Exposition der Keratinozyten auf äußere Reize führt zu einer Aktivierung der intrazellulären Signalwege und anschließend Produktion einer Reihe von verschiedenen Entzündungsmediatoren wie Zytokine, Chemokine und antimikrobielle Peptide. Diese Keratinozyten gewonnenen Proteinen beteiligt die entzündliche Reaktion durch die Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen wie dendritische Zellen, Neutrophilen und spezifische T-Zellen6,7. So weil Keratinozyten in vielen biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen, war das Grundprinzip hinter der hier vorgestellten Technik erzeugen eine in-Vitro -Modell, um die Haut Biologie zu studieren. Primären Keratinozyten Kulturen gewonnenen neonatale Vorhaut werden häufig verwendet, um Haut Biologie8,9zu studieren. Jedoch mit der hier beschriebenen Technik Keratinozyten aus beiden Geschlechtern ergeben sich wiederum eine höhere biologische Vielfalt der Zellen.
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Generierung von primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Haut, einschließlich Wartung und das Einfrieren der Keratinozyten. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die primären menschlichen Keratinozyten zu generieren, die als Modell kann, zur kutanen Biologie in-vitro-Studie verwendet werden.
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Protocol
Die Sammlung von Hautproben von gesunden Erwachsenen Probanden einer plastischen Operation erfordert Genehmigung durch die Ethik-Kommission in den Einrichtungen. Dieses Protokoll wurde von der regionalen ethischen Ausschuss der Region Midtjylland, Dänemark (M-20110027) genehmigt. Die hier beschriebene Methode leitet sich von ähnlichen Studien von Maciaq Et al. 10 und Liu und Karasek11.
1. Isolation von Keratinozyten aus der menschlichen Haut
- Beginnen, indem Sie die folgenden Lösungen: 50 mL Lösung von 0,25 % Trypsin und 0,1 % Glukose in DPBS. Mischung und Filter zu sterilisieren (0,2 µm) die Lösung. 10 mL RPMI-1640 + 2 % FBS Lösung, 50 mL des DPBS und Keratinozyten serumfreien Medium (KSFM) vorzubereiten. 500 mL KSFM KSFM Ergänzungen und 250 µL Gentamycin hinzufügen. Vorwärmen der Lösungen auf 37 ° C vor dem Gebrauch.
- Haut von gesunden Erwachsenen Probanden einer plastischen Operation zu sammeln. Die Hautproben verwendet sind ca. 10 cm x 15 cm, aber können in der Größe variieren. Halten Sie die Haut kühl unter Transport durch den Transport der Hautproben in einer Styropor-Box mit einem Kühlelement. Bei Bedarf kann die Hautprobe über Nacht bei 4 ° C gespeichert werden.
- Entfernen Sie Fett unter der Haut-Sektion mit sterilisierten Scheren, Skalpelle und Pinzetten.
- Schnalle aus Abschnitt Haut (ca. 10 cm x 15 cm) auf eine sterile Abdeckung oben auf einen Teller mit Nadeln. Zuerst reinigen Sie die Haut mit einem trockenen steriler Gaze-Pad. Dann reinigen Sie die Haut mit einem sterilen Tupfer mit 70 % Ethanol.
- Mit einem Fuß-Hobel, der obersten Hautschicht (Epidermis) des Abschnitts Haut schneiden Sie und legen Sie es in einem 9 cm Petrischale. Fügen Sie dann sofort 25 mL der DPBS/Trypsin/Glucose-Lösung (vorbereitet in Schritt 1.1) in der Petrischale. 30 min bei 37 ° c inkubieren
- Mit einer Pipette entfernen Sie die DPBS/Trypsin/Glukose-Lösung aus der Petrischale und 10 mL RPMI-1640 + 2 % FBS, die Trypsin zu inaktivieren.
- Mit zwei Pinzetten, lassen Sie jetzt die Epidermiszellen in das Medium durch sanft kratzen und rühren die epidermalen und dermalen Abteil des die Hautpartien.
- Filtern der epidermalen Zellsuspension durch einen Metallfilter (1 mm Lochgröße), und sammeln Sie in einem 50 mL-Tube. Hinzu kommt der übrigen Haut eine 50 mL-Tube mit 10 mL RPMI-1640 ohne FBS und Vortex für 10 S. Filter filtern die Aussetzung durch das Metall in ein 50 mL-Tube mit der epidermalen Zellsuspension. Einem Gesamtvolumen von 50 mL DPBS hinzufügen.
- Zentrifugieren der Zellsuspension für 10 min bei 450 X g bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der epidermalen Zelle Pellet in ca. 10 mL von 37 ° C KSFM abhängig von der Größe des Pellet-Zelle. Zählen Sie die Zellen mit dem Trypan blau Färbung Methode unter Mikroskop. Die Anzahl der Zellen aus einen 10 x 15 cm-Haut-Abschnitt ist ca. 50-100 x 106 Zellen. Übertragen Sie an jedem 75 cm2 Kultur Kolben, 8 x 106 Zellen zusammen mit 12 mL von 37 ° C KSFM. Schütteln Sie die Kulturflaschen um gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
- Inkubieren Sie die Keratinozyten in einem Inkubator 37 ° C mit 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2. Ändern Sie das Medium nach 2 Tagen und dreimal wöchentlich. Durchgang-Zellen, wenn die Kultur Zusammenfluss von 70-80 %, was ungefähr 2 Wochen je nach die Proliferationsrate der Keratinozyten dauert.
(2) Passagierung der Keratinozyten
- Erhitzen Sie die entsprechende Menge an Trypsin-EDTA-Lösung 0,05 % auf 37 ° C im Brutschrank. Verwenden Sie 4,5 mL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung für eine 75 cm2 Kultur Kolben.
- Entfernen Sie Mittel aus den Zellen zu, und fügen Sie 4,5 mL/75 cm2 Kultur Flasche 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen vorgewärmt. Legen Sie den Kultur-Kolben in den Inkubator (37 ° C) und nach ca. 5 min unter dem Mikroskop zu prüfen Sie, ob die Zellen lösen gestartet haben.
- Bei etwa 50 % der Zellen gelockert haben, schlagen Sie sanft den Kultur-Kolben gegen die Hand, die restlichen Zellen zu lösen. Fügen Sie dann um die Trypsin zu inaktivieren, 6 mL RPMI-1640 + 2 % FBS (37 ° C) in den 75 cm2 Kultur Kolben und übertragen Sie die Zellsuspension auf 50 mL Röhrchen.
- Spülen Sie die Kulturflaschen mit 3 mL RPMI 1640 + 2 % FBS und Hinzufügen der 50 mL-Tuben. Zentrifugieren Sie Zellen für 10 min bei 450 X g bei Raumtemperatur.
- Aufschwemmen der gebeizte Zellen in 10 mL KSFM (37 ° C). Zählen der Zellen und 3 x 106 Zellen auf ein 150 cm2 Kultur Fläschchen mit 20 mL KSFM (37 ° C) übertragen. Schütteln Sie den Kultur-Kolben um gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Einfrieren der Zellen, wenn die Kultur ist 80-90 % konfluierende, die dauert ca. 4-6 Tage je nach die Proliferationsrate der Keratinozyten (siehe Abschnitt 3, Einfrieren Protokoll unten). Erweitern Sie die Keratinozyten um entsprechende gefrorenen Vorräte zu generieren.
(3) Einfrieren von Keratinozyten
- Erhitzen Sie die entsprechende Menge an Trypsin-EDTA-Lösung 0,05 % auf 37 ° C im Brutschrank. Verwenden Sie 9 mL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung für ein 150 cm2 Kultur Kolben.
- Entfernen Sie Mittel aus den Zellen zu, und fügen Sie 9 mL/150 cm2 Kultur Flasche 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen vorgewärmt. Legen Sie den Kultur-Kolben in den Inkubator (37 ° C) und nach ca. 5 min unter dem Mikroskop zu prüfen Sie, ob die Zellen lösen gestartet haben.
- Bei etwa 50 % der Zellen gelockert haben, schlagen Sie sanft den Kultur-Kolben gegen die Hand um die verbleibenden Zellen zu lösen. Fügen Sie dann um die Trypsin zu inaktivieren, 12 mL RPMI-1640 + 2 % FBS (37 ° C) in den 150 cm2 Kultur Kolben und aspirieren der Zellsuspension auf 50 mL Röhrchen.
- Spülen Sie die Kulturflaschen mit 6 mL RPMI 1640 + 2 % FBS und Hinzufügen der 50 mL-Tuben. Zentrifugieren Sie die Rohre für 10 min bei 450 X g bei 4 ° C. Bereiten Sie eiskalte Zelle Medium (KSFM + 10 % DMSO) Einfrieren.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in KSFM + 10 % DMSO, zählen die Zellen und Zellen bei einer Dichte von 6 x 106 Zellen/mL mit standard langsam-Einfrieren Kryokonservierung Methoden12einfrieren.
- Die Keratinozyten in flüssigem Stickstoff (Dampfphase) erst unmittelbar vor Gebrauch zu speichern.
(4) Auftauen und Kultivierung gefrorenen Keratinozyten
- Tauen Sie schnell die entsprechenden gefrorenen Fläschchen in einem 37 ° C-Wasserbad. Verwenden Sie 70 % Ethanol, reinigen Sie die Außenseite der Cryoröhrchen. Die entsprechende Anzahl von Zellen (ca. 15.000 Zellen/cm2) auf einem Kultur-Kolben übertragen und sofort den Kultur-Kolben vorgewärmt Wachstumsmedium (KSFM) hinzufügen.
Jede Größe von Kulturflaschen kann je nach Aufbau des Experiments verwendet werden. - Verwenden Sie 5 mL Kulturmedium für eine 25 cm2 Kultur Kolben.
Hinweis: Unsere Daten haben gezeigt, dass durchschnittlich 95 % der Zellen isoliert von dem hier beschriebenen Protokoll positiv für die Keratinozyten-Marker-Cytokeratine-14-13 sind.
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Representative Results
Kalzium-induzierte Terminal Differenzierung
Menschlichen Keratinozyten unterziehen terminal Differenzierung bei der Behandlung mit Kalzium14,15,16. Primären menschlichen Keratinozyten waren isoliert und kultiviert wie im obigen Protokoll beschrieben. Bei ca. 50-60 % Zusammenfluss, die Zellen wurden mit Kalzium (1,2 mM) stimuliert oder Fahrzeug und Bilder der Zellen wurden am Tag 0, 1 und 2. Abbildung 1 zeigt die morphologischen Veränderungen der Keratinozyten nach Kalzium Stimulation beobachtet.
Der Ausdruck Involucrin ist erhöht bei Calcium Stimulation
Kultivierte menschlichen Keratinozyten wurden bis ca. 50-60 % Zusammenfluss, woraufhin die Zellen mit Kalzium (1,2 mM) oder ein Fahrzeug für 24 und 48 Stunden angeregt wurden, angebaut. Wir bewiesen, dass parallel zu der verstärkte Differenzierung der Zellen von den morphologischen Veränderungen der Keratinozyten beobachtet, die mRNA Expression von Differenzierung Marker Involucrin deutlich nach Kalzium Stimulation erhöht. Nach 24 und 48 h der Stimulation war Involucrin mRNA Ausdruck etwa 5,5-fache gestiegen und 3.5-fold, bzw. verglichen mit Fahrzeug (Abbildung 2).
IL-1β-induzierte Phosphorylierung des p38 MAPK
Zu bestimmen, würden die isolierten menschlichen Keratinozyten reagiert auf Zytokin-induzierte Aktivierung des intrazellulären Signalwege, kultivierte Keratinozyten mit IL-1β stimuliert wurden (10 ng/mL) zu verschiedenen Zeitpunkten. Innerhalb von 5 min. führte IL-1β Stimulation für eine schnelle Aktivierung/Phosphorylierung des p38 MAPK, Western blotting bestimmt. Nach 1 h zurückgekehrt, IL-1β-induzierte p38 MAPK Phosphorylierung zu basalen Ebene (Abbildung 3). Nur die phosphorylierten Form der p38 MAPK wurde erhöht, wie IL-1β Stimulation keinen Einfluss auf die Gesamt-Protein-Ebene der p38 MAPK (Abbildung 3 hatte).
Abbildung 1 : Repräsentative Bilder der Kalzium-induzierte Differenzierung der Keratinozyten. Mit Fahrzeug (dH2O) oder Calcium (1,2 mM) für den angegebenen Zeitpunkten wurden kultivierte primären menschlichen Keratinozyten stimuliert. (A - E) Phasenbilder Kontrast von Keratinozyten an Tag 0 (A), Tag 1 (B und C) und 2. Tag (D und E) nach Kalzium-Stimulation. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Erhöhte mRNA Expression von Involucrin nach Kalzium Stimulation. Kalzium (1,2 mM) oder Fahrzeug (dH2O) wurde hinzugefügt, um gebildeten primären menschlichen Keratinozyten für den angegebenen Zeitpunkten (n = 3). RNA wurde isoliert und der Ausdruck der Differenzierung Marker Involucrin von qPCR analysiert. RPLP0 (ribosomale Protein große P0) mRNA Ausdruck diente zur Normalisierung. Ergebnisse stellen Mittelwert ± S.D. aus drei verschiedenen Experimenten. p < 0,05 verglichen mit Fahrzeug. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : IL-1β-induzierte Phosphorylierung des p38 MAPK. Kultivierte primären menschlichen Keratinozyten wurden angeregt, mit Fahrzeug (PBS + 0,15 % BSA) oder IL-1β (10 ng/mL) für den angegebenen Zeitpunkten. Protein-Extrakte wurden isoliert und Western Blot Analyse zur Messung der p38 MAPK phosphorylierten und total p38 MAPK. Gleicher Belastung wurde durch Inkubation mit einem Anti-β-Aktin-Antikörper überprüft. Daten aus einem repräsentativen Experiment aus drei werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier beschreiben wir, wie primären menschlichen Keratinozyten von Erwachsenen Haut leicht zu isolieren und sie in-vitro-Kultur. Dieses Modell kann nützlich sein für Forscher, die Interesse an einem Studium Haut-Krankheiten kann haben eine breite Anwendung für die Untersuchung der epidermalen Zelle Biologie
Einige der Vorteile von dem hier beschriebenen Protokoll ist, dass im Gegensatz zu Keratinozyten isoliert von Neugeborenen Vorhaut erhalten von Neugeborenen männlichen Beschneidung unterziehen, primären menschlichen Keratinozyten von erwachsenen Patienten isoliert von Männern und Frauen sind und jedem Alter ≥18 Jahre umfassen kann. Somit ist die biologische Vielfalt in diesen Zellen gegenüber Keratinozyten von Neugeborenen Vorhaut viel größer. Darüber hinaus können Patienten in der plastischen Chirurgie, wie Brustverkleinerung oder Gewichtsverlustchirurgie relativ große Stücke von Hautproben entnommen werden.
Wie oben erwähnt ist die Epidermis in verschiedenen Schichten, die die spezifischen Differenzierung Stufe der Keratinozyten organisiert. Um Haut Biologie zu studieren, ist das hier beschriebene Modell durch das Fehlen von einem dreidimensionalen Mikroumgebung begrenzt. Die verschiedenen Schichten der Epidermis, sowie die verschiedenen Zelltypen in der Haut vorhanden sind in diesem Modell nicht nachgeahmt. Um dies zu überwinden, menschliche Haut gleichwertigen Modellen eingesetzt werden, die aus einem mehrschichtigen Epithel bestehen, wo Keratinozyten bei Kontakt mit Luft-Flüssigkeit Schnittstelle zu unterscheiden und somit mehr eng imitiert die native Epidermis17, 18,19. Ein weiteres Modell, die erreicht werden kann, um Haut Biologie zu studieren ist der ex-Vivo Hautmodell, in denen Hautbiopsien in Kulturen in einem Luft-Flüssigkeit Interphase als zuvor beschriebenen20gehalten werden.
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Disclosures
. Der Autor hat keinen Interessenskonflikt.
Acknowledgments
Der Autor bedankt sich bei Annette Blak Rasmussen und Kristine Moeller für ihre technische Unterstützung
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
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