Summary
मानव त्वचा बाहरी पर्यावरण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करता है । हम वयस्क त्वचा से प्राथमिक मानव keratinocytes अलग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इन अलग keratinocytes कई प्रयोगात्मक setups में उपयोगी होते हैं, और एक अति उपयुक्त मॉडल है इन विट्रो मेंचर्म जीव विज्ञान में आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए।
Abstract
keratinocytes के मुख्य समारोह के लिए एपिडर्मिस की संरचनात्मक अखंडता प्रदान करना है, जिससे बाहर की दुनिया के लिए एक यांत्रिक बाधा बनाए रखने । इसके अलावा, keratinocytes दीक्षा, रखरखाव में एक अनिवार्य भूमिका निभाते हैं, और एपिडर्मल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विनियमन जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली का हिस्सा होने से एक तेजी से, विशिष्ट तरीके से प्रतिजनी उत्तेजनाओं का जवाब । यहां, हम वयस्क त्वचा से प्राथमिक मानव keratinocytes के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और प्रदर्शित करता है कि इन कोशिकाओं को कैल्शियम प्रेरित टर्मिनल भेदभाव का जवाब है, के रूप में भेदभाव मार्कर involucrin की वृद्धि की अभिव्यक्ति द्वारा मापा । इसके अलावा, हम बताते हैं कि अलग keratinocytes p38 MAPK मार्ग के सक्रियण द्वारा मापा के रूप में intracellular संकेतन रास्ते के IL-1β-प्रेरित सक्रियण के लिए उत्तरदायी हैं. एक साथ लिया, हम अलगाव और वयस्क त्वचा से प्राथमिक मानव keratinocytes के संवर्धन के लिए एक विधि का वर्णन । क्योंकि keratinocytes एपिडर्मिस में प्रमुख कोशिका प्रकार के होते हैं, इस विधि के लिए त्वचा संबंधी जीव विज्ञान में आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है इन विट्रो।
Introduction
त्वचा मानव शरीर का सबसे बड़ा अंग है और बाहरी वातावरण के खिलाफ एक सुरक्षात्मक अवरोध के रूप में कार्य करता है । त्वचा दो मुख्य परतों से बना है: dermis और एपिडर्मिस, जहां एपिडर्मिस त्वचा की बाहरी परत का गठन । एपिडर्मिस में सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिका प्रकार कोशिका द्रव्यमान1,2के ९५% से अधिक शामिल keratinocytes है । keratinocytes एपिडर्मिस में भेदभाव के विभिंन चरणों में बनाए रखा है और बेसल में आयोजित कर रहे हैं, रीढ़ की हड्डी, दानेदार, और cornified परतों है कि भेदभाव के विशिष्ट चरणों के अनुरूप3। keratinocytes के प्राथमिक कार्य के लिए एपिडर्मिस की संरचनात्मक अखंडता प्रदान करना है, जिससे बाहर की दुनिया के लिए एक बरकरार बाधा उत्पादन ।
keratinocytes भी त्वचा में रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इसलिए जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया4में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है,5। बाहरी उत्तेजनाओं के लिए keratinocytes के जोखिम intracellular संकेतन रास्ते के सक्रियण और बाद में, साइटोकिंस, chemokines, और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स सहित विभिन्न भड़काऊ मध्यस्थों की एक संख्या के उत्पादन की ओर जाता है । इन keratinocyte-व्युत्पन्न प्रोटीन की भर्ती और सक्रिय प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे वृक्ष कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल, और विशिष्ट टी कोशिकाओं6,7के द्वारा भड़काऊ प्रतिक्रिया में भाग लेते हैं । इस प्रकार, क्योंकि keratinocytes कई जैविक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, यहां प्रस्तुत तकनीक के पीछे तर्क को एक इन विट्रो मॉडल में उत्पंन करने के लिए त्वचा जीवविज्ञान का अध्ययन किया गया । प्राथमिक keratinocyte नवजात चमड़ी से प्राप्त संस्कृतियों अक्सर त्वचा जीवविज्ञान8,9अध्ययन किया जाता है । हालांकि, यहां वर्णित तकनीक के साथ, दोनों लिंगों से keratinocytes कोशिकाओं की एक उच्च जैव विविधता में जिसके परिणामस्वरूप प्राप्त कर रहे हैं ।
यहां, हम और keratinocytes के रखरखाव और ठंड सहित वयस्क त्वचा से प्राथमिक मानव keratinocytes के अलगाव और पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि का समग्र लक्ष्य प्राथमिक मानव keratinocytes है कि एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है उत्पंन करने के लिए त्वचा विज्ञान इन विट्रो मेंजीवविज्ञान का अध्ययन है ।
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Protocol
स्वस्थ वयस्क से त्वचा के नमूनों के संग्रह प्लास्टिक सर्जरी के दौर से गुजर मेजबान संस्थानों में नैतिक समिति से अनुमोदन की आवश्यकता है । यह प्रोटोकॉल क्षेत्रीय एथिकल कमेटी ऑफ रीजन Midtjylland, डेनमार्क (एम-२०११००२७) द्वारा अनुमोदित किया गया था । विधि यहां वर्णित Maciaq एट अल द्वारा इसी तरह की पढ़ाई से व्युत्पंन है । १० औ लियू तथा Karasek११।
1. मानव त्वचा से Keratinocytes का अलगाव
- निम्न समाधान बनाने से प्रारंभ करें: ५० मिलीलीटर DPBS में ०.२५% trypsin और ०.१% ग्लूकोज का समाधान । मिश्रण और फिल्टर बंध्याकरण (०.२ µm) समाधान । RPMI के 10 मिलीलीटर-१६४० + 2% FBS समाधान, DPBS और keratinocyte सीरम मुक्त माध्यम (KSFM) के ५० मिलीलीटर तैयार करें । KSFM की खुराक और गेन्तमयसीं के २५० µ एल जोड़ें KSFM के ५०० मिलीलीटर । पूर्व उपयोग करने से पहले ३७ ° c के लिए समाधान गर्म ।
- स्वस्थ वयस्क स्वयंसेवकों से त्वचा ले लीजिए प्लास्टिक सर्जरी के दौर से गुजर । त्वचा के नमूनों का इस्तेमाल लगभग 10 सेमी x 15 सेमी कर रहे हैं, लेकिन आकार में भिंन हो सकते हैं । त्वचा के नमूनों में एक स्टायरोफोम एक ठंडा तत्व युक्त बॉक्स में परिवहन के द्वारा परिवहन के तहत शांत रखें । यदि आवश्यक हो, त्वचा का नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संग्रहित किया जा सकता है ।
- निष्फल कैंची, नश्तर, और संदंश का उपयोग कर त्वचा अनुभाग के नीचे से वसा निकालें ।
- सुई का उपयोग कर एक थाली के शीर्ष पर एक बाँझ कवर पर त्वचा अनुभाग (लगभग 10 सेमी x 15 सेमी) बाहर बकसुआ । सबसे पहले, एक सूखी निष्फल धुंध पैड के साथ त्वचा को साफ । तो ७०% इथेनॉल के साथ एक निष्फल धुंध पैड का उपयोग कर त्वचा साफ ।
- एक पैर planer का उपयोग करना, त्वचा अनुभाग के ऊपरी परत (एपिडर्मिस) के कट और एक 9 सेमी पेट्री डिश में डाल दिया । फिर, तुरंत जोड़ें DPBS/trypsin/ग्लूकोज समाधान (चरण १.१ में तैयार) के 25 मिलीलीटर पेट्री डिश के लिए । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
- एक पिपेट का उपयोग कर पेट्री डिश से DPBS/trypsin/ग्लूकोज समाधान निकालें और RPMI के 10 मिलीलीटर-१६४० + 2% FBS को निष्क्रिय करने के लिए जोड़ें ।
- दो संदंश का प्रयोग, अब एपिडर्मल कोशिकाओं को धीरे से परिमार्जन और दोनों एपिडर्मल और त्वचा वर्गों के चमड़े का डिब्बा आंदोलन द्वारा माध्यम में जारी है ।
- फ़िल्टर एपिडर्मल सेल निलंबन के माध्यम से एक धातु फ़िल्टर (1 mm छेद आकार), और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा । FBS और भंवर के बिना 10 एस RPMI-१६४० के 10 मिलीलीटर के लिए एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए शेष त्वचा वर्गों जोड़ें एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में धातु फिल्टर के माध्यम से निलंबन एपिडर्मल सेल निलंबन से युक्त । ५० मिलीलीटर की कुल मात्रा में DPBS जोड़ें ।
- कमरे के तापमान पर ४५० x g पर 10 मिनट के लिए सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और सेल गोली के आकार के आधार पर ३७ डिग्री सेल्सियस KSFM के लगभग 10 मिलीलीटर में एपिडर्मल सेल गोली reसस्पेंड । माइक्रोस्कोप के तहत Trypan ब्लू धुंधला विधि का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । एक 10 सेमी x 15 सेमी त्वचा अनुभाग से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या लगभग ५०-१०० x 106 कोशिकाओं है । प्रत्येक ७५ सेमी2 संस्कृति कुप्पी, 8 x 106 कोशिकाओं के साथ एक साथ स्थानांतरण ३७ डिग्री सेल्सियस KSFM के 12 मिलीलीटर । धीरे कोशिकाओं की वर्दी वितरण सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति कुप्पी हिला ।
- १००% आर्द्रता और 5% CO2के साथ ३७ ° c मशीन में keratinocytes की मशीन । 2 दिन और तीन बार साप्ताहिक के बाद मध्यम बदलें । जब संस्कृति ७०-८०% धाराप्रवाह है, जो keratinocytes के प्रसार की दर के आधार पर लगभग 2 सप्ताह लगते है बीतने कोशिकाओं ।
2. Passaging का Keratinocytes
- एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए ०.०५% Trypsin-EDTA समाधान की उचित मात्रा में गर्मी । एक ७५ सेमी2 संस्कृति कुप्पी के लिए ०.०५% Trypsin-EDTA समाधान के ४.५ मिलीलीटर का उपयोग करें ।
- कोशिकाओं से मध्यम निकालें, और जोड़ें ४.५ एमएल/75 सेमी2 संस्कृति कुप्पी पूर्व गर्म ०.०५% Trypsin-EDTA कोशिकाओं को हल । मशीन (३७ डिग्री सेल्सियस) में संस्कृति कुप्पी प्लेस और लगभग 5 मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत जांच अगर कोशिकाओं ढीला शुरू कर दिया है ।
- जब कोशिकाओं के लगभग ५०% ढीला है, धीरे हाथ के खिलाफ संस्कृति कुप्पी हिट करने के लिए शेष कोशिकाओं ढीला । फिर, trypsin को निष्क्रिय करने के लिए, RPMI-१६४० + 2% FBS (३७ डिग्री सेल्सियस) के ७५ सेमी2 संस्कृति कुप्पी और सेल निलंबन के लिए ५० मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरण 6 मिलीलीटर जोड़ें ।
- RPMI १६४० + 2% FBS के 3 मिलीलीटर के साथ संस्कृति कुप्पी कुल्ला और ५० मिलीलीटर ट्यूबों में जोड़ें । कमरे के तापमान पर ४५० x g पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
- KSFM (३७ डिग्री सेल्सियस) के 10 मिलीलीटर में छर्रों कोशिकाओं को फिर से स्थगित । कोशिकाओं की गणना और KSFM (३७ डिग्री सेल्सियस) के 20 मिलीलीटर के साथ एक साथ एक १५० सेमी2 संस्कृति कुप्पी के लिए 3 एक्स 106 कोशिकाओं को हस्तांतरण. धीरे कोशिकाओं की वर्दी वितरण सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति कुप्पी हिला । जब संस्कृति ८०-९०% धाराप्रवाह है, जो लगभग keratinocytes के प्रसार की दर पर निर्भर करता है 4-6 दिनों लेता है कोशिकाओं फ्रीज (अनुभाग 3, ठंड प्रोटोकॉल नीचे देखें) । keratinocytes का विस्तार करने के लिए उपयुक्त जमे हुए स्टॉक उत्पंन करते हैं ।
3. Keratinocytes की जमने
- एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए ०.०५% Trypsin-EDTA समाधान की उचित मात्रा में गर्मी । एक १५० सेमी2 संस्कृति कुप्पी के लिए ०.०५% Trypsin-EDTA समाधान के 9 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
- कोशिकाओं से मध्यम निकालें, और 9 मिलीलीटर/150 सेमी2 संस्कृति कुप्पी पूर्व गर्म ०.०५% Trypsin-EDTA कोशिकाओं के लिए समाधान जोड़ें । मशीन (३७ डिग्री सेल्सियस) में संस्कृति कुप्पी प्लेस और लगभग 5 मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत जांच अगर कोशिकाओं ढीला शुरू कर दिया है ।
- जब कोशिकाओं के लगभग ५०% ढीला है, धीरे हाथ के खिलाफ संस्कृति कुप्पी मारा क्रम में शेष कोशिकाओं को ढीला करने के लिए । फिर, trypsin को निष्क्रिय करने के लिए, RPMI के 12 मिलीलीटर-१६४० + 2% FBS (३७ डिग्री सेल्सियस) १५० सेमी2 संस्कृति कुप्पी और महाप्राण सेल निलंबन करने के लिए ५० मिलीलीटर ट्यूबों जोड़ें ।
- RPMI १६४० के 6 मिलीलीटर के साथ संस्कृति कुप्पी कुल्ला + 2% FBS और ५० मिलीलीटर ट्यूबों में जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर ४५० x g पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों केंद्रापसारक । आइस-कोल्ड सेल फ्रीज मीडियम (KSFM + 10% DMSO) तैयार करें ।
- KSFM + 10% DMSO में सेल गोली reसस्पेंड, कोशिकाओं की गणना, और 6 x 106 कोशिकाओं के घनत्व पर फ्रीज कोशिकाओं/एमएल मानक धीमी ठंड cryopreservation तरीकों12का उपयोग कर ।
- keratinocytes तरल नाइट्रोजन (वाष्प चरण) में उपयोग करने के लिए तैयार जब तक स्टोर ।
4. गल और संवर्धन जम Keratinocytes
- तेजी से एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान उपयुक्त जमे हुए शीशियों गल । cryovial के बाहर साफ करने के लिए ७०% इथेनॉल का उपयोग करें । कोशिकाओं की उचित संख्या (लगभग १५,००० कोशिकाओं/cm2) एक संस्कृति कुप्पी करने के लिए स्थानांतरण और तुरंत संस्कृति कुप्पी के लिए पूर्व उष्ण विकास मध्यम (KSFM) जोड़ें ।
संस्कृति कुप्पी के किसी भी आकार प्रयोग के सेटअप के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है । - एक 25 सेमी2 संस्कृति कुप्पी के लिए 5 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम का प्रयोग करें ।
नोट: हमारे डेटा का प्रदर्शन किया है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल से अलग कोशिकाओं के औसत ९५% पर keratinocyte-मार्कर cytokeratine-1413के लिए सकारात्मक हैं.
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Representative Results
कैल्शियम प्रेरित टर्मिनल भेदभाव
मानव keratinocytes कैल्शियम के साथ उपचार पर टर्मिनल भेदभाव से गुजरना14,15,16. प्राथमिक मानव keratinocytes अलग और संस्कृति के रूप में उपर्युक्त प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया । जब लगभग ५०-६०% धाराप्रवाह, कोशिकाओं कैल्शियम (१.२ मिमी) या वाहन और कोशिकाओं की तस्वीरें 0, 1, और 2 दिन पर ले जाया गया के साथ उत्तेजित थे । चित्रा 1 कैल्शियम उत्तेजना पर मनाया keratinocytes के रूपात्मक परिवर्तन से पता चलता है ।
कैल्शियम उत्तेजना पर Involucrin की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है
कल्चरल ह्यूमन keratinocytes लगभग ५० तक उगाए जाते थे-६०% धाराप्रवाह जिसके बाद कोशिकाओं को कैल्शियम के साथ उत्तेजित किया गया (१.२ मिमी) या एक वाहन के लिए 24 और ४८ एच. हम का प्रदर्शन किया है कि समानांतर में कोशिकाओं की वृद्धि हुई भेदभाव के रूप में keratinocytes के रूपात्मक परिवर्तन द्वारा मनाया, भेदभाव मार्कर involucrin की mRNA अभिव्यक्ति कैल्शियम उत्तेजना पर काफी बढ़ गई । उत्तेजना के 24 और ४८ एच के बाद, involucrin mRNA अभिव्यक्ति लगभग ५.५ गुना बढ़ गया था और ३.५ गुना, क्रमशः, वाहन (चित्रा 2) के साथ तुलना में ।
p38 MAPK के आईएल-1β-प्रेरित फास्फारिलीकरण
अलग मानव keratinocytes intracellular संकेतन रास्ते के cytokine प्रेरित सक्रियण के लिए उत्तरदायी थे निर्धारित करने के लिए, संस्कृतिपूर्ण keratinocytes IL-1β के साथ उत्तेजित थे (10 एनजी/एमएल) विभिन्न समय अंक के लिए. 5 मिनट के भीतर, IL-1β उत्तेजना एक तेजी से सक्रियण के लिए नेतृत्व/p38 MAPK के फास्फारिलीकरण, के रूप में पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित । 1 ज के बाद, IL-1β-प्रेरित p38 MAPK फास्फारिलीकरण बेसल स्तर (चित्रा 3) को लौट आया था । केवल p38 MAPK के phosphorylated फार्म बढ़ गया था, के रूप में IL-1β उत्तेजना p38 MAPK (चित्रा 3) के कुल प्रोटीन स्तर पर कोई प्रभाव नहीं था ।
चित्र 1 : keratinocytes के कैल्शियम प्रेरित भेदभाव के प्रतिनिधि छवियां । प्रसंस्कृत प्राथमिक मानव keratinocytes वाहन (डीएच2O) या कैल्शियम (१.२ mM) के साथ संकेत दिया समय अंक के लिए प्रेरित किया गया । (A-E) चरण 0 (ए), दिन 1 (बी और सी), और दिन 2 (डी और ई) के बाद कैल्शियम उत्तेजना पर keratinocytes के विपरीत छवियां । स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 2 : कैल्शियम उत्तेजना पर involucrin की वृद्धि हुई mRNA अभिव्यक्ति. कैल्शियम (१.२ मिमी) या वाहन (डीएच2O) को इंगित समय बिंदुओं (n = 3) के लिए कल्चरल प्राथमिक मानव keratinocytes में जोड़ा गया था । आरएनए पृथक और भेदभाव मार्कर involucrin की अभिव्यक्ति qPCR द्वारा विश्लेषण किया गया था । RPLP0 (राइबोसोमल प्रोटीन बड़े P0) mRNA अभिव्यक्ति सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था । परिणाम तीन विभिंन प्रयोगों से मतलब ± S.D. प्रतिनिधित्व करते हैं । * वाहन के साथ तुलना मेंp & #60; ०.०५ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : IL-1β-प्रेरित फास्फारिलीकरण के p38 MAPK । संस्कृतिपूर्ण प्राथमिक मानव keratinocytes वाहन (पंजाबियों + ०.१५% BSA) या IL-1β (10 एनजी/एमएल) के साथ संकेत दिया समय अंक के लिए प्रेरित किया गया । प्रोटीन अर्क अलग-थलग और वेस्टर्न सोख्ता एनालिसिस को p38 MAPK और टोटल p38 MAPK के phosphorylated लेवल को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया । समान लोडिंग एक विरोधी β-actin एंटीबॉडी के साथ मशीन द्वारा सत्यापित किया गया था । तीन में से एक प्रतिनिधि प्रयोग से डेटा दिखाया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां, हम वर्णन कैसे आसानी से वयस्क त्वचा से प्राथमिक मानव keratinocytes अलग करने के लिए, और कैसे उंहें संस्कृति के लिए इन विट्रो में। इस मॉडल एपिडर्मल सेल जीव विज्ञान की जांच के लिए एक व्यापक अनुप्रयोग हो सकता है, और त्वचा रोगों के अध्ययन में रुचि शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लाभों में से कुछ है कि इसके विपरीत नवजात चमड़ी से अलग खतना के दौर से गुजर keratinocytes से पृथक करने के लिए, वयस्क रोगियों से प्राथमिक मानव keratinocytes दोनों पुरुषों और महिलाओं से अलग कर रहे हैं और किसी भी उम्र ≥ 18 साल शामिल कर सकते हैं । इस प्रकार, जैविक विविधता नवजात चमड़ी से keratinocytes के साथ तुलना में इन कोशिकाओं में बहुत बड़ा है । इसके अलावा, त्वचा के नमूनों की अपेक्षाकृत बड़े टुकड़े प्लास्टिक सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त किया जा सकता है, ऐसे स्तन में कमी सर्जरी या वजन घटाने सर्जरी ।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है एपिडर्मिस अलग परतों में keratinocytes के विशिष्ट विभेद चरण के लिए इसी में आयोजित की जाती है । आदेश में त्वचा जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए, मॉडल यहां वर्णित एक तीन आयामी microenvironment की कमी से सीमित है । एपिडर्मिस के विभिंन परतों के रूप में अच्छी तरह से त्वचा में मौजूद विभिंन कोशिका प्रकार के इस मॉडल में नकल उतारा नहीं कर रहे हैं । इस पर काबू पाने के लिए, मानव त्वचा के समकक्ष मॉडलों का इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक multilayered उपकला से मिलकर बनता है, जहां keratinocytes एक हवा तरल इंटरफेस के लिए जोखिम पर अंतर है, और इस प्रकार, और अधिक निकटता देशी एपिडर्मिस नकल उतारने17, 18,19. एक और मॉडल है जो आदेश में त्वचा जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है पूर्व vivo त्वचा मॉडल है, जिसमें त्वचा बायोप्सी संस्कृतियों में एक हवाई तरल चरण में रखा जाता है के रूप में पहले20वर्णित है ।
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Disclosures
. लेखक के पास हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक को उनके तकनीकी समर्थन के लिए Annette बलैक Rasmussen और Kristine Moeller शुक्रिया अदा करना चाहता है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | - |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | - |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | - | - | Forceps from any company can be used |
| Scissors | - | - | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | - | - | - |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | - | - | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | - |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | - |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
References
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