Methodenartikel

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

DOI:

10.3791/56896

⸱

30. Januar 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Physical Chemistry, University of Freiburg, 2Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur dreifarbigen SmFRET Daten und deren Auswertung mit einem 3D-Ensemble Hidden-Markov-Modell zu erhalten. Mit diesem Ansatz können Wissenschaftler kinetische Informationen aus komplexen Protein Systeme, einschließlich der Kooperativität oder korrelierte Interaktionen extrahieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Einzelmolekül-Förster Resonance Energietransfer (SmFRET) ist eine weit verbreitete biophysikalische Technik, die Dynamik von Biomolekülen zu studieren geworden. Für viele molekulare Maschinen in einer Zelle Proteine zusammen mit Interaktionspartner in einem funktionalen Kreislauf, ihre Aufgabe zu erfüllen müssen. Die Verlängerung der Zweifarben-, Multi-Color SmFRET macht es möglich, gleichzeitig mehrere Interaktion oder Konformationsänderung Sonde. Dies gibt nicht nur eine neue Dimension für SmFRET Experimente, sondern es bietet auch die einzigartige Möglichkeit, die Abfolge der Ereignisse direkt zu studieren und korrelierte Interaktionen zu erkennen, bei der Verwendung einer immobilisierten Probe und eine Totalreflexion Fluoreszenz Mikroskop (TIRFM). Multi-Color SmFRET deshalb ein vielseitiges Werkzeug für die Untersuchung biomolekularer komplexe in einer quantitativen Weise und in einem zuvor unerreichbar Detail.

Hier zeigen wir wie die besonderen Herausforderungen der Multi-Color SmFRET Experimente an Proteinen zu überwinden. Wir präsentieren Ihnen ausführliche Protokolle für die Beschaffung der Daten und kinetische Informationen extrahieren. Dazu gehören Spur Auswahlkriterien, Trennung von Staat und die Rückgewinnung von staatlichen Bahnen aus dem verrauschten Daten mit Hilfe einer 3D Ensemble Hidden Markov Model (HMM). Im Vergleich zu anderen Methoden, ist die kinetische Informationen nicht aus wohnen Zeit Histogramme, sondern direkt aus der HMM wiederhergestellt. Die maximum-Likelihood-Rahmen ermöglicht es uns, die kinetische Modell kritisch zu bewerten und sinnvolle Unsicherheiten für die Tarife zu bieten.

Unsere Methode auf die Hitze-Schock-Protein 90 (Hsp90) anwenden, können wir die Nukleotid-Bindung und die globale Konformationsänderungen des Proteins zu entwirren. Dies ermöglicht uns die Kooperativität zwischen den zwei Nukleotid verbindliche Taschen von Hsp90 Dimer direkt zu beobachten.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viele Proteine erfüllen ihre Funktion in dynamische komplexe mit anderen Molekülen, vermittelt durch Konformationsänderungen und transiente Verbände auf ein breites Spektrum von zeitlichen1,2,3. Gekoppelt an eine externe Energiequelle (z. B. ATP) diese dynamische Interaktionen zu Direktionalität in einem funktionalen Kreislauf führen und letztlich nicht-Gleichgewichts-stationären in eine Zelle, die Voraussetzung für das Leben zu erhalten.

Um diese molekularen Maschinen zu verstehen, ist eine statische Beschreibung geführt durch strukturelle Studien nicht ausreichend. Darüber hinaus ist es wichtig, Kenntnisse der zugrunde liegenden kinetischen Modell haben und die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten bestimmen. Mehrere vorhandene Methoden können Forscher die Dynamik der binäre Interaktionen zwischen zwei Molekülen von Interesse, z. B. Oberflächenplasmonenresonanz, Entspannungsmethoden mit einer spektroskopischen Anzeige (z. B. Sprung oder gestoppt-Flow zu studieren Techniken) und magnetischen Kernresonanz. Ihre Anwendbarkeit ist jedoch in den meisten Fällen beschränkt auf einfache zwei-Staaten-Systeme (z. B. einer gebundenen und einer ungebundenen Zustand) durch die Mittelung in loser Schüttung Experimente. In Fällen wo mehrere Staaten oder Zwischenprodukte beteiligt sind, führen sie nur eine komplexe Mischung aus der Geschwindigkeitskonstanten. Einzelmolekül-Methoden wie optische oder magnetische Pinzette oder Zweifarben-SmFRET, d. h. eine Spenderin und einem Akzeptor Fluorophor, mit einer Oberfläche immobilisiert Probe können die Geschwindigkeitskonstanten für alle beobachteten Konformationsänderungen wiederherstellen. Allerdings geht es um Interaktionen beeinflussen mehr als eine Bindungsstelle, diese Methoden beschränkt bleiben und die Informationen über die mögliche Korrelation der beiden (oder mehr) Wechselwirkungen werden nur über indirekte Schlussfolgerungen aus einer Reihe von Experimenten.

Multi-Color-SmFRET4,5,6,7,8,9 bietet die Möglichkeit, das Zusammenspiel dieser Komponenten direkt in Echtzeit und unter studieren in der Nähe von physiologischen Bedingungen10. Dies erlaubt zum Beispiel die Konformation-abhängige Bindung eines Liganden oder ein anderes Protein8,9,11untersuchen. Das hier vorgestellte Gesamtkonzept ist benutzt von Interesse an bestimmten Positionen, ein Protein auf der Oberfläche der Messkammer zu befestigen und die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit auf ein Prisma-Typ TIRFM (für Details siehe 9 verfolgen beschriften , 12). die räumliche Nähe der verschiedenen Farbstoffe kann dann aus der Energieübertragung zwischen ihnen ermittelt werden. Kennzeichnung Strategien von Protein zu Protein (rezensiert in 13) abweichen und Richtlinien, um Artefakte in SmFRET Messungen zu vermeiden gibt es14.

Da ein Spender-Farbstoff zu verschiedenen Akzeptor Farbstoffe in einem Multi-Color-SmFRET-Experiment Energie übertragen kann, ist die relative Position der alle Farbstoffe nicht Erregung einen Farbstoff allein15,16erreichbar. Aber in Kombination mit abwechselnden Laseranregung (ALEX17und bewertete in 18) bietet diese Methode alle räumlich-zeitliche Informationen bei unter einer Sekunde und Sub-Nanometer Auflösung.

Im Prinzip hochauflösende strukturelle Informationen erreicht werden kann, mithilfe der Inter Farbstoff Entfernungen berechnet aus der Kombination aller Fluoreszenz-Intensitäten in einem Multi-Color-SmFRET-Experiment mit ALEX. Aber, hier konzentrieren wir uns auf staatliche Identifizierung und Trennung sowie die Gewinnung von kinetische Modelle, wo Multi-Color SmFRET unerlässlich ist. Wenn "nur" Strukturaufklärung durch Triangulation gewünscht wird, kann eine Reihe einfacher Zweifarben-SmFRET-Experimente mit hohen Signal-Rausch-Verhältnis durchgeführten12,19.

Wir verwenden teilweise Fluoreszenz (figure-introduction-1) als Proxy für die Energieübertragung zwischen zwei Fluorophore7. Die PF errechnet sich aus der Fluoreszenzintensität analog zu der FRET-Effizienz eines zwei-Farben-Experiments:

figure-introduction-2

Wo, figure-introduction-3 ist die Intensität in Emission Kanal Em nach Anregung mit Farbe abund c ist der Akzeptor mit der längsten Wellenlänge. Erkennung-Kanäle stellen die gleiche Position in der Probenkammer aber erfassen unterschiedliche Spektralbereiche des Lichts Fluoreszenz dar. Der gleiche Bezeichner für Anregung und Emission werden in diesem Protokoll verwendet (z.B. "blau", "grün" und "rot").

Aufgrund experimenteller Mängel hängen die gemessenen Fluoreszenz-Intensitäten nicht nur auf die Energieübertragung, sondern auch von Fluorophor und Setup-Eigenschaften. Um die wahre Energieeffizienz der Übertragung zwischen zwei Fluorophore zu erhalten, müssen die gemessenen Intensitäten korrigiert werden. Die folgende Prozedur basiert auf Referenz9. Korrekturfaktoren für scheinbare Leckage (lk, d. h. der Nachweis von Photonen aus einem Fluorophor in einem Kanal für ein anderer Farbstoff bezeichnet) und scheinbare Gamma (ag, d. h. die Quantenausbeute der Fluoreszenz des Farbstoffes und die Nachweiseffizienz des Kanals) stammen aus Einzelmolekül-Spuren, die ein Akzeptor bleichen Veranstaltung zeigen.

Das Austreten von der Spender-Farbstoff in jeden möglichen Akzeptor-Kanal errechnet sich aus alle Datenpunkte in der aufgezeichneten Fluoreszenz Spuren wo der Akzeptor Farbstoff gebleicht aber der Spender ist noch fluoreszierende (figure-introduction-4):

figure-introduction-5

Der Median des Histogramms Leckage dient als scheinbare Leckage Faktor. Nach der Korrektur auf Dichtheit richtet sich der scheinbare Gammafaktor aus den gleichen Satz von Spuren. Es wird ermittelt, indem die Änderung der Fluoreszenz in den Akzeptor-Kanal durch die Änderung der Fluoreszenz in der Geber-Kanal beim Bleichen von der Akzeptor Farbstoff:

figure-introduction-6

Wobei c wieder die Erkennung Kanal für den Akzeptor mit der längsten Wellenlänge ist. Der Median der daraus resultierenden Verteilung wird als die scheinbare Korrekturfaktor verwendet.

Die korrigierten Intensitäten in jedem Kanal stammen von:

figure-introduction-7

PF wird dann entsprechend berechnet:

figure-introduction-8

Verschiedene Populationen können in der multi-dimensionalen Raum erstreckte sich von der PFs getrennt werden. Die Position und Breite der einzelnen Staaten wird durch Anpassung der Daten mit multi-dimensionalen Gaußsche Funktionen bestimmt. Anschließende Optimierung von einem globalen HMM basierend auf alle PF -Spuren bietet eine quantitative Beschreibung der beobachteten Kinetik. Selbst kleine Änderungen der Preise sind nachweisbar.

Hmm bieten eine Möglichkeit der Ableitung ein Zustandsmodell aus einer Sammlung von lauten Zeitspuren. Das System wird als in einem der eine Reihe von diskreten, versteckten Staaten an einem bestimmten Zeitpunkt und die tatsächliche Beobachtung (d. h. die Emission) ist eine probabilistische Funktion von diesem Status "verborgen"20. Bei TIRFM SmFRET Daten kann die Emission Wahrscheinlichkeiten bich pro Staat ich durch kontinuierliche "glockenförmig" Wahrscheinlichkeitsdichte Funktionen modelliert werden. Zu regelmäßigen Abständen diskreten Zeitpunkten können Übergänge von einem in einen anderen Staat nach dem Übergang Wahrscheinlichkeit auftreten, die Zeit-invariante und hängt nur von den aktuellen Zustand. Der Übergangsmatrix A enthält diesen Übergang Wahrscheinlichkeiten einerIj zwischen allen versteckten Staaten. Der Ausgangszustand Verteilung figure-introduction-9 gibt die bundeslandspezifischen Wahrscheinlichkeiten figure-introduction-10 für den ersten Zeitpunkt der Zeit spurlos. Mit einem Maximum-Likelihood-Ansatz, können dieser Parameter optimiert werden, um die Daten mit der vorwärts-rückwärts und Baum-Welch Algorithmen20,21am besten beschreiben. Daraus ergibt sich die maximum-Likelihood-Schätzer (MLE). Schließlich kann der Staat-Sequenz, die höchstwahrscheinlich die Flugbahn des Beobachtungen produziert mit dem Viterbi-Algorithmus abgeleitet werden. Im Gegensatz zu anderen HMM Analysen von SmFRET Daten24,25,26 verwenden wir keine HMM als eine bloße "Glättung" der Daten, sondern die kinetische Staatsmodell Extrakt aus dem Datensatz ohne die Notwendigkeit für den Einbau Verweilzeit Histogramme27. HMM die Auswertung erfolgt mit eigenen Skripten mit Igor Pro. Umsetzung des Kodex basiert auf Referenz21. Wir bieten eine Softwarekit und beispielhafte Daten auf unserer Webseite um Abschnitte 5 und 6 dieses Protokolls (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret) folgen. Vollständige Software ist auf Anfrage erhältlich.

Zeitpunkten in den Daten mit PF <-1 oder PF > 2 in jedem Kanal Erkennung sind die minimale Emission Wahrscheinlichkeit für alle Staaten (10-200) zugeordnet. Dies verhindert, dass künstliche Übergänge an diese Datenpunkte.

Die Passform des 3D PF Histogramms mit Gaußsche Funktionen werden die Parameter für die Emission Wahrscheinlichkeiten entnommen, wie im Schritt 5.7 beschrieben. Diese Parameter werden bei der Optimierung der HMM fest gehalten.

Des vorgestellten Ansatzes dienen der Ausgangszustand Verteilung Vektor und die Übergangsmatrix weltweit, das gesamte Ensemble der Spuren zu beschreiben. Sie werden aktualisiert, basierend auf alle N Moleküle aus dem Datensatz nach Verweis27.

Startparameter für den Anfangszustand Vertrieb aus 2D Projektionen des Histogramms PF (Schritt 5.3) ermittelt und die Übergangswahrscheinlichkeiten werden sich voraussichtlich auf 0,05 mit Ausnahme der Wahrscheinlichkeiten bleiben im gleichen Zustand, die solche ausgewählt werden dass die Wahrscheinlichkeit, einen bestimmten Zustand zu verlassen zur Einheit normalisiert.

Ein Wahrscheinlichkeit Profiler-Methode dient zur Konfidenzintervalle (CIs) für alle Übergang Preise21,22, dienen als sinnvolle Schätzungen für ihre Unsicherheit zu geben. Um die Grenzen der CI zu einem bestimmten Preis zu berechnen, ist die Wahrscheinlichkeit Übergang von Interesse auf einen anderen Wert als die MLE fixiert. Daraus ergibt sich die Test-Modell λ ". Eine Wahrscheinlichkeit-Verhältnis (LR) Test der Wahrscheinlichkeit figure-introduction-11 angesichts des Datensatzes erfolgt nach 0 :

figure-introduction-12

Das 95 %-Konfidenzintervall gebunden für der Parameter erreicht ist, überschreitet LR 3.841, das 95 %-Quantil der ein x2-Verteilung mit einem Freiheitsgrad22,23.

Die Macht der Methode wird unter Verwendung der Hsp90 demonstriert. Dieses reichliche Protein findet sich in Bakterien und Eukaryoten und ist Bestandteil der zellulären Stress-Reaktion-28. Es ist ein viel versprechendes Medikament Ziel in Krebs Behandlung29. Hsp90 ist ein Homodimer mit einem Nukleotid-Bindungstasche in die N-terminale Domäne von jeder Untereinheit30. Es kann Übergänge zwischen mindestens zwei weltweit unterschiedliche Konformationen, geschlossen und eine N-terminale offen, v-förmige Konformation19,31,32unterziehen. Die dimeres Natur Frage direkt die des Zusammenspiels zwischen die zwei Nukleotid-Bindungsstellen im Hsp90.

Im folgenden bieten wir eine Schritt für Schritt-Protokoll für die Datenerfassung und Analyse einer dreifarbigen SmFRET Experiment auf Hefe Hsp90 und Nukleotid. Die Konformation-abhängige Bindung von Eindringmittel beschrifteten AMP-PNP (AMP-PNP *, ein nicht-hydrolysierbare Analogon von ATP) wird analysiert. Die Anwendung des beschriebenen Verfahrens erlaubt der Studie der Nukleotid-Bindung und zur gleichen Zeit die Konformationsänderungen Hsp90 und zeigt damit die Kooperativität zwischen den zwei Nukleotid verbindliche Taschen von Hsp90.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Aufbau und Voraussetzungen

  1. Führen Sie die Multi-Color SmFRET Messungen auf ein Prisma-Typ TIRFM. Eine Beschreibung eines zwei-Farben-Setup wie eine Jupiter-Veröffentlichung gegeben ist,12verweisen.
    1. Ein Multi-Color-TIRFM zu konstruieren. Eine allgemeine Layout wird in 9erläutert.
    2. Verwendung umschaltbar, gepumpt Diode kontinuierliche Welle Festkörperlaser, die die Verwendung von mechanischen Rollläden in die Erregung Pfade unnötig machen.
    3. Beschäftigen Sie eine asymmetrische, längliche Prisma, die verhindert, dass die hintere Reflexion des Strahls Erregung von der Rückseite her das Ziel eingeben.
    4. Verwenden Sie 2-Zoll-achromatisch asphärische Fused-Silica-Objektive in der Erkennung-Pfade, die so viel Licht wie möglich zu sammeln und zu verhindern, dass Auto-Fluoreszenz und Verirrungen, z. B. Verzerrungen in Regionen außerhalb der Mitte des Bildes.
    5. Jeder Erkennung Pfad auf dem Chip der EMCCD mit einem separaten Objektiv zu konzentrieren. Dies ermöglicht optimale Fokussierung des Kanals Erkennung.
      Vorsicht: Klasse 3 b Laser werden in der TIRFM verwendet. Dies bedeutet, dass sie gefährlich sind, wenn das Auge direkt ausgesetzt ist, aber diffuse Reflexionen nicht schädlich sind. Einhaltung der Laser Sicherheitsvorkehrungen gemäß den Regierungsvorschriften der lokalen bevor das System betrieben wird.
  2. Die Korrekturfaktoren für Setup und Fluorophor Eigenschaften vorher mit DsDNA Proben zu bestimmen.
    1. Verwenden Sie eine hoch-FRET DsDNA-Probe für jede Farbe in Kombination mit den Akzeptor hat die längste Wellenlänge Erregung (für die vorgestellten Setup: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N Atto594-Atto647N). Stellen Sie sicher, dass die DNA mit Biotin zusätzlich geändert wird.
    2. Verdünnen die Probe 5 nM mit TNM Puffer (5 mM Tris pH 7.5, 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2) und 2 mM Trolox (verwenden Sie diesen Puffer auch für Messungen).
    3. Die DsDNA zu immobilisieren, wie für Hsp90 2.5 und 2.7 beschrieben.
    4. Berechnen Sie die Korrekturfaktoren für scheinbare Leckage (lk) und scheinbare Gamma (ag) vom Einzelmolekül-Spuren, die ein Akzeptor bleichen Ereignis zeigen.
  3. Konstruieren Sie eine Flow-Kammer, die ein Sandwich einer PEG/Biotin-PEG passivierte Quarz Folie ist, einen dünnen Film, der Kleber auf beiden Seiten und einem Deckglas ist. Detail-Protokolle für die Reinigung des Quarzes Folien und Passivierung finden Sie in der Referenz9.
    1. Nutzung (3 mm) Dicke Quarz gleitet, um geometrisch die Sammlung des Laserlichts verstreut an der Quarz-Glycerin-Quarz-Schnittstelle zwischen dem Prisma und der funktionalisierten Quarz-Folie zu verhindern.
    2. Verwenden Sie eine dünne (40 µm) Abdichtung Film, der mit Klebstoff auf der nicht klebenden Seite gesprüht wird. Die dünne Folie reduziert den Abstand zwischen der Oberfläche befestigt Moleküle und Ziel. Erhitzen auf 80 ° C und drücken Sie auf.
    3. Platzieren Sie ein Deckglas auf der Oberseite. Erhitzen auf 80 ° C und drücken Sie auf. Verwenden Sie einen Tropfen des Glycerins bei der Platzierung der Strömungsraum über das Prisma.
      Hinweis: Die Materialien des Prismas und die Quarz-Folien sowie dem Glycerin sind Index-abgestimmt.
  4. Hsp90 von Saccharomyces Cerevisiae in Form von zwei einzelnen Cystein Punkt Mutanten an den Positionen D61 oder Q385 auszudrücken. Fügen Sie eine C-terminale coiled-Coil Motiv um Dimer Dissoziation bei pikolomaren Konzentrationen zu vermeiden. Beschriften Sie der mutierten Proteine separat und tauschen Sie die Monomere um Heterodimere beschriftet mit Atto488 an Aminosäure Position 61 und Atto550 an der Aminosäure Position 3859zu erhalten.

2. Messung

  1. Starten Sie die Kamerasoftware und die bildgebenden Parameter wie unten angegeben:
    1. Stellen Sie die Temperatur des Sensors Kühlung so niedrig wie möglich (-95 ° C mit externen Wasserkühlung) um die aktuellen Dunkelrauschen zu verringern.
    2. Verwenden Sie Kameraeinstellungen, die optimiert sind für die Einzelmolekül-Aufnahme: 3,3 µs vertikale Verschiebung Geschwindigkeit, normale vertikale Uhr Spannung, 17 MHz 16-Bit horizontale ausgelesen, Vorverstärkung Gain 3, der Elektronen-Vervielfacher 1.000 zu gewinnen.
    3. Die Auslösung des Erwerbs für "Externe" und die Belichtungszeit bis 70 Ms.-Rekord-Filme mit einer Länge von 750 Erwerb Zyklen festgelegt.
      Hinweis: Schalten Sie das Raumlicht, wenn die Kamera erwirbt, um Sättigung des EMCCD Sensors zu verhindern.
  2. Erstellen Sie einen Ordner auf der lokalen SSD für die Messung. In der Software Einstellungen zur < Auto-Save > Reiter, < automatisches Speichern > aktivieren, und wählen Sie Datei-Format "Tiff" für Film-Übernahme. Wählen Sie den Ordner auf der SSD als Auto-speichern-Standort.
  3. Starten Sie die Software, die Kontrollen der akusto-optischen durchstimmbare Filter (Aventurien), die Software, die steuert den Betrieb der Laser und die Trigger-Software, die die Laser, Aventurien, synchronisiert Fensterläden in der Erkennung Pfad und Kameras. Passen Sie die Leistung des Lasers mit Aventurien (ca. 3 mW vor dem Eintritt in das Prisma) und laden Sie die richtige auslösende Muster.
  4. Befestigen Sie die Probenhalterung mit dem Prisma und den Strömungsraum, befestigen Sie Schlauch, legen Sie den Zulauf-Schlauch in einem Microcentrifuge Cup und schließen Sie den Auslass-Schlauch an eine Spritzenpumpe. Der Saal mit ca. 150 µL Puffer spülen, richten Sie die Erregung Strahl und Fokus. Bleichen von fluoreszierenden Verunreinigungen auf der Oberfläche von langsam entlang der kompletten Erfassungsbereich der Folie mit einer Laserleistung von etwa 10 mW für alle Laser. Dies dauert etwa 1 h.
    Hinweis: soweit nicht anders angegeben, sind der verwendete Puffer 40 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 10 mM MgCl2.
  5. Spülen Sie rund 300 µL einer NeutrAvidin Lösung (0,25 mg/mL in Puffer) in die Kammer und 1 min. Flush aus ungebundenen NeutrAvidin mit Puffer und Flush ca. 300 µL einer BSA-Lösung (0,5 mg/mL in Puffer) durch die Kammer inkubieren.
    Hinweis: Dieser Block, die restliche Oberfläche Funktionalisierung Mängel durch unspezifische Adsorption der BSA an die Oberfläche.
  6. Die Probe durch das Laden der Strömungsraum mit ca. 150 µL der biotinylierte zu immobilisieren und beschriftet Hsp90 bei steigenden Konzentrationen (verdünnt in Puffer + 0,5 mg/mL BSA) bis eine ausreichende Oberfläche Dichte erreicht wird, was in der Regel der Fall ist bei einer Konzentration von 5-22:00. Ungebundene Protein mit etwa 300 µL Puffer + 0,5 mg/mL BSA auswaschen.
  7. Bündig in 150 µL 25 nM AMP-PNP * Puffer + 0,5 mg/mL BSA. Lassen Sie es 5 min inkubieren und wiederholen Sie diesen Schritt einmal um korrekte Nukleotid-Konzentration zu gewährleisten.
    Hinweis: Für Experimente im Beisein von zusätzlichen, unbeschriftete AMP-PNP, auch hinzufügen 250 µM AMP-PNP.
  8. Beginnen Sie mit der Datenerfassung. Für eine angemessene Menge an Daten zu erwerben ca. 20 Filme, die dauert ca. 1,5 h.
    1. Verschieben Sie die Position der Probenkammer senkrecht zu der Erregung Strahl mit einem Piezo-Stepper, das Sichtfeld zu ändern.
    2. Stellen Sie den Fokus mit der Z-Piezo, die die Höhe des Ziels steuert, wenn nötig. Dies sollte nicht erforderlich sein, allzu oft, wenn die Messkammer ohne Neigung montiert ist.
    3. Bereiten Sie die Aufzeichnung der Kameras durch die Kamerasoftware < nehmen Signal > Einpressen und starten Sie die Erregung/Erwerb Zyklen mit der < Start >-Taste in der Trigger-Software zu. Dies startet den Erwerb der Fluoreszenzintensität.
  9. Führen Sie eine Kanalregistrierung durch erste Filmaufnahme mit fluoreszierenden Perlen, die Fluoreszenzemission im Spektralbereich aller Kanäle der Erkennung des Setups zu zeigen. Dann erkennen Sie Perle Positionen in der Kalibrierung-Film zu, indem die hellsten Stellen suchen und bestimmen Sie, dass die zentrale Lage von einer Gaußschen Intensität Profil passen. Speichern Sie die Koordinaten der Perlen, die findet man in allen Kanälen und passen sowohl den Mapping-Offset in x- und y-Richtung mit einem 2D Polynom von Grad 39.

3. Auswahl der Einzelmolekül-Spuren

  1. Analyse der Daten erfolgt mit eigenen Skripten mit Igor Pro. Laden Sie alle notwendigen Skripte durch "iniTIRF.ipf" öffnen und wählen Sie den richtigen Typ des Experiments.
    Hinweis: im folgenden Schaltfläche "<" > gibt klickbare Elemente in das Menü oder das User-Interface. Funktionsaufrufe werden in Anführungszeichen, z.B. "Print"Hello World"" angezeigt. Diese Befehle können in der Befehlszeile von Igor Pro (ohne die umschließenden Anführungszeichen) eingefügt werden.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Parameter für die Erkennung-Kanal-Registrierung geladen werden.
  3. Drücken Sie zunächst die GUI < SmFRET neue | Analyse GUI >.
  4. Laden Sie die Filme (d. h. die Reihenfolge der Frames mit 512 x 512 Pixel gespeichert als 16-Bit TIFF-Stapel), die die Intensität in den jeweiligen Kanälen zu halten. Zu diesem Zweck der < Last Film >-Taste und Auswahl der Dateien aus den so genannten "master" und "Slave" Kameras einer nach dem anderen.
  5. Identifizieren Sie die Positionen der potenziellen Einzelmoleküle durch die Suche nach den hellsten Stellen in der Summe der ersten fünf Frames in einem bestimmten Erkennung-Kanal. Berechnen Sie die entsprechenden Positionen in anderen Erkennung-Kanäle aus der Kanalzuordnung. Um die Fluoreszenz-Intensität-Ablaufverfolgung zu erhalten, addieren Sie die Intensität der ein Pixel-Quadrat um die zentrale Position für jeden Frame. Tun Sie dies durch Drücken der Taste < finden Spuren > in der GUI.
    Hinweis: Die Seitenlänge des Quadrats (in Pixel) ergibt sich aus: 2 * < Summe Pxs > + 1.
  6. Berechnen Sie für jedes Molekül eine gemeinsame rohen Intensität Spur als die Summe von allen Spuren dieses Ortes mit der gleichen Farbe der Erregung. Bewerten Sie die Intensität Profil des Moleküls in allen Kanälen nach den folgenden Kriterien:
    1. Ein etwa flaches Plateau in der gemeinsamen roh Intensität und einem einzigen bleaching Schritt für alle Erregung Farben, Verhalten Verhalten in den entsprechenden Nachweis, Nachweis von rote Fluoreszenz (Angabe Bund zu einem gebundenen AMP-PNP *) mindestens einmal innerhalb der Trace und keine mehrfache Schritte in die rote Fluoreszenz, die das Vorhandensein von zwei AMP-PNP darauf hinweisen würden * ein Hsp90 Dimer verpflichtet.
  7. Die Fluoreszenz-Spuren des Spots zur weiteren Analyse zu speichern, wenn diese Kriterien erfüllt sind. Tun Sie dies, indem Sie die Ablaufverfolgung mit dem Cursor auswählen und drücken dann die Schaltfläche < speichern > in der "Chronik" Grafik. Manuell überprüfen Sie die Intensität Spuren in allen drei Kanälen der Erkennung nach blauen Anregung für etwa 200 Moleküle pro Film.

4. Berechnung der Spuren, die teilweise Fluoreszenz

  1. Angezeigt werden alle Spuren der Fluoreszenz-Intensität für eines der gespeicherten Moleküle. Verwenden Sie den Cursor in das Diagramm, um Zeitbereiche auszuwählen.
  2. Wählen Sie ein Zeitintervall, wo alle Fluorophore bereits gebleicht werden. Die mittlere Hintergrundintensität aus diesem Bereich berechnet und subtrahiert die Intensität Ablaufverfolgung in jedem Kanal. Tun Sie dies durch Drücken der Schaltfläche "< Hintergrund >".
  3. Wählen Sie den Bund Wirkungsgradbereich, wo zumindest sowohl die Farbstoffe an Hsp90 (Atto488 und Atto550) sind vorhanden. Stellen Sie sicher, Spuren ausschließen, die einen blinkenden Ereignis enthalten (siehe Abb. 3 b). Diese Veranstaltungen zeichnen sich durch ein Drop-in-Fluoreszenzintensität in einem Kanal ohne begleitende Erhöhung in einem anderen Kanal.
  4. Berechnen Sie die PF -Spuren. Tun Sie dies durch Drücken der Schaltfläche < PF berechnen >. Die vordefinierten Korrekturfaktoren für scheinbare Leckage (lk) und scheinbare Gamma (ag) gelten für die rohen Intensität um Foto-physische zu korrigieren und setup-Eigenschaften.

5. Bevölkerung Auswahl und 3D Histogramm Fitting

  1. Entfernen Sie Moleküle, die ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis in der PF -Spuren zeigen. Moleküle, die das Intervall [-1; 2] in PF Spur für mehr als 10 % der Rahmen überschreiten werden aus dem Datensatz entfernt. Tun Sie dies durch Ausführen von "RemoveTracesLowSNR()" aus dem Befehlsfenster.
  2. Gebinnten 2D Projektionen der PF Daten zu berechnen. Plot figure-protocol-1 über figure-protocol-2 und figure-protocol-3 über figure-protocol-4 im Bereich von [-0,5; 1,5] mit einer Auflösung von 100 x 100 Lagerplätzen. Dazu führen Sie Folgendes aus:
    1. "HistFret2D ("R_b","R_g", BinHist = 100)"
    2. "HistFret2D ("R_b","G_b", BinHist = 100); MoveWindow 553.5, 42,5, 1055.25, 508,25"
  3. Bestimmen der relativen Bevölkerung jedes unterscheidbar Staates in den 2D Projektionen.
    1. Bringen Sie die entsprechende Grafik nach vorne zu und führen Sie "panelHist2DCount()".
    2. Drücken Sie die Schaltfläche "< Init >" und zeichnen Sie ein Polygon freie Hand rund um den Gipfel.
    3. Klicken Sie auf < Anzahl >. Die Anzahl der Datenpunkte im Polygon und die Gesamtzahl der Datenpunkte in der Projektion werden im Befehlsfenster gedruckt.
  4. Bereiten Sie ein 3D Histogramm der PF Daten durch Ausführen von "HistFret3D ("G_b","R_b","R_g")".
  5. Das 3D Histogramm zu einem Integral von 1 zu normalisieren. Führen Sie die folgenden:
    1. "NewDataFolder/S fit0"
    2. "Duplikat/O:: Bund: Hist3D, Hist3D"
    3. "Variable/g Div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^ 3"
    4. "Hist3D / = Div; Print Div"
  6. Bieten Sie Ausgangsparameter für die 3D Gauß passen und bereiten die notwendigen Datenstrukturen.
    1. Führen Sie "Gauss3D_initParam(); Bearbeiten Sie W_coef_old."
    2. Fügen Sie am Ende des Vektors Parameter Zustand Populationen.
    3. Führen Sie "Gauss3D_prepareFit()."
      Hinweis: W_coef_old ist ein Vektor, der die ursprünglichen Parameter für die Fit hält. Pro Staat dadurch figure-protocol-5 und Bevölkerung, die am Ende des Vektors verkettet ist. Stellen Sie sicher, dass die Kovarianzmatrix symmetrisch ist.
  7. Passen Sie die Summe S 3D Gaußsche Funktionen auf das 3D PF -Histogramm mit S ist die Zahl der unterscheidbaren Staaten.
    1. Führen Sie "do3D()." Dies kann eine Stunde oder länger auf einem normalen Büro-PC, abhängig von der Qualität der ursprünglichen Parameter dauern.
    2. Führen Sie "postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); Bearbeiten Sie W_coef."
  8. Das Fit Ergebnis anzeigen. Verwenden Sie für jede der beiden 2D Projektionen die folgenden Befehle:
    1. "contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4)"
    2. "contourPF3D_colorize()"

(6) kinetische Analyse mit 3D Ensemble HMM

  1. Bereiten Sie ein Ensemble HMM ausgeführt, um die kinetische Informationen extrahieren. Ein HMM ist von aller Moleküle im Dataset optimiert. Verwenden Sie die Informationen, die im vorherigen Schritt, um die Position und Breite der einzelnen Staaten im 3D-Raum PF definieren.
    1. HMM-User-Interface zu initialisieren (< HMM | Init HMM >), und wählen Sie die entsprechende Anzahl von Staaten (im Falle von Hsp90 Daten bedeutet dies < NumStates > = 5), Anzahl der Dimensionen des Eingangssignals (< NumDims > = 3), und die Art der Eingabe (< Eingabetyp > = "Bund 3D Bgr").
  2. Die Parameter des HMM zu optimieren, indem man die Software, die die Wahrscheinlichkeit, dass die HMM konvergieren (Ausführen von "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1),-14)") bis die Änderung in der Übergangsmatrix im Vergleich zu der vorherigen Iteration unterhalb einer Schwelle (10-14fällt für die Summe der absoluten Veränderung für jede Übergang Wahrscheinlichkeit). Daraus ergibt sich die MLE für die Übergangswahrscheinlichkeiten in etwa eine Stunde auf einem normalen Büro-PC.
  3. Wiederholen Sie die Bevölkerung Auswahl, Gaußsche Anpassung und die HMM-Optimierung für Teilmengen von Daten (z. B. 75 % von den vollständigen Datensatz). Wenn von verschiedenen Experimenten den vollständigen Datensatz zusammengeführt wurde, wiederholen Sie die Optimierung auch für jede der einzelnen Experimente. Analyse von Teilmengen ermöglicht, um die Unsicherheit der Bevölkerung manuelle Auswahl und die Variabilität innerhalb des Datensatzes zu schätzen.
  4. Berechnen Sie das CI für die Übergangswahrscheinlichkeiten, die über die Heterogenität des Datensatzes und der Präzision der HMM berichten.
    1. Erhalten Sie eine grobe Schätzung der CI Grenzen durch Ausführen von "cd $(Wurzel: path3Dimport +"HMM"); loop_getCI_estimate_limits()."
    2. Berechnen Sie die genauen Grenzen des CI, indem Sie ausführen:
    3. "loop_getCI_HMM_converge(1)"
    4. "CIresults_conv_new()"
    5. "cd:: HMM_CIresult; reportCI_conv()"
    6. "cd:: Cmp_CI_conv; CI_plot2 ("HMM", DoAppend = 0) "
  5. Kondensieren Sie die kinetische Informationen um die Interpretation zu erleichtern.
    1. Sammeln Sie Informationen über die Zeit, dass eine beschriftete Nukleotid Hsp90 verpflichtet bleibt. Zu diesem Zweck, Zusammenbruch der Staaten, die an AMP-PNP gebunden sind * (d. h. S1, S2 und S3, siehe auch Abbildung 2) und das Wohnen Zeit Histogramm zu kompilieren. Führen Sie "cd $(Wurzel: path3Dimport +"HMM"); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) ", S0 und S4 und S1, S2und S3Staaten, wohnt der verbindet.
    2. Der Viterbi Weg für jeden Zustand des Interesses der Verweilzeiten entziehen und das daraus resultierende wohnen Zeit Histogramm für verschiedenen experimentellen Bedingungen zu vergleichen. Führen Sie "Plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)."
    3. Ausblenden Sie für ein detaillierteres Bild Staaten, die verschiedene PF aber funktional identisch mit die weiteren Datenanalyse, z. B.im Falle einer dreifarbigen Experiment mit beschrifteten Hsp90 und Nukleotid, Staaten S2 und S zu erleichtern 3 können reduziert werden. Führen Sie "collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})."

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi-Color SmFRET Messungen ermöglichen die unmittelbare Erfassung der Korrelation zwischen zwei oder mehr ausgeprägte Interaktion Standorte. Dies macht die Technik einzigartig, Mehrkomponenten-Systeme, wie Proteinkomplexe zu untersuchen. Wir konzentrieren uns auf die Präsentation einer dreifarbigen SmFRET Experiment hier dient als ein anschauliches Beispiel.

Die allgemeine Workflow der Methode ist in Abbil...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren die Versuchsdurchführung um dreifarbigen SmFRET Daten für ein komplexes Protein-System und eine schrittweise Beschreibung der Analyse dieser Messungen zu erhalten. Dieser Ansatz bietet die einzigartige Möglichkeit, die Korrelation zwischen mehreren Websites Interaktion oder Konformationsänderungen direkt zu beurteilen.

Um geeignete Multi-Color Einzelmolekül-Daten auf Proteine zu erhalten ist es wichtig, reproduzierbare Messungen mit einem niedrigen Geräuschpegel. Dies kann err...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (INST 39/969-1) und des European Research Council durch die ERC-Grant Agreement n. 681891 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Setup
vibrationsgedämpfter optischer Tisch   Newport, Irvine, CA, USARS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1196625
LasersteuergerätCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1234465Scientific Remote
asphärische TeleskoplinsenThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAd=25,4mm, f=50mm und f=100mm
CF ex1AHF analysentechnik AG, Tü bingen, DeutschlandZET 473/10Cleanup Filter Anregung
CF ex2AHF analysentechnik AG, Tü bingen, DeutschlandZET 532/10Cleanup Filter Anregung
CF ex3AHF analysentechnik AG, Tü Bingen, DeutschlandZET 594/10Cleanup Filter Anregung
CF ex4Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAFL635-10Cleanup Filter Anregung
DM ex1AHF analysentechnik AG, Tü Bingen, DeutschlandZQ594RDCdichroitische Spiegelanregung
DM ex2AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Deutschland570DCXRdichroitische Spiegelanregung
DM ex3AHF analysentechnik AG, Tü Bingen, DeutschlandZQ491RDCdichroitische Spiegelanregung
AOTFnC-VisAA Opto-Electronic, Orsay, Frankreich
λ/4 PlatteThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAAQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100xNikon Instruments Inc, Melville, NY, USAHigh-NA Objektiv
Piezo Focus Positioner MIPOS 250 CAPpiezosystem jena GmbH, Jena, DeutschlandPiezo Controller NV 40/1 CLE
Piezo StepperNewport, Irvine, CA, USAPZA12PZC200-KT NanoPZ Aktuator Kit
achromatische asphärische LinsenQioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Gö ttingen, DeutschlandG322-304-000d=50mm, f=200mm
verstellbarer optischer SchlitzOwis GmbH, Staufen i. Br., Deutschland27.160.1212max. Öffnung 12 x 12 mm
DM det1AHF analysentechnik AG, Tü bingen, DeutschlandT 600 LPXRdichroitischer Spiegel detektion
DM det2AHF analysentechnik AG, Tü bingen, DeutschlandH 560 LPXR superflachedichroitische Spiegeldetektion
DM det3AHF analysentechnik AG, Tü bingen, DeutschlandHC BS R635dichroitischer Spiegel detektion
BP det1AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Deutschland525/40 BrightLine HCBandpassfilter-Detektion
BP det2AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Deutschland586/20 BrightLine HCBandpassfilter-Detektion
BP det3AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Deutschland631/36 BrightLine HCBandpassfilter-Detektion
BP det4AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Deutschland700/75 ETBandpass-Bandpassfilter-Detektion
optische Shutter-DetektionVincent Associates, Rochester, NY, USAUniblitz VS25S2T0 
EMCCD iXon Ultra 897Andor Technology Ltd, Belfast, Nordirland
digitale I/O-Karte, PCIe-6535National Instruments, Austin, Texas, USA
SpritzenpumpeHarvard Apparatus, Holliston, MA, USAPHD22/2000
Name<>Unternehmen>KatalognummerKommentare
>Strömungskammer
quartz DiasG. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USASpectrosil2000, h=3mm
TEGADERM Folie3M Deutschland GmbH, Neuss, Deutschland1626W10 x 12cm
Sprühkleber3M Deutschland GmbH, Neuss, DeutschlandFotohalterung 050777
glycerolCarl Zeiss AG, Oberkochen, DeutschlandImmersol G
ImmersionsölOLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, DeutschlandIMMOIL-F30CC
PrismaVogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, DeutschlandSuprasil1
Aluminium-Prismenhalterspeziell angefertigte
hohle StellschraubenThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAmit kundenspezifischer Bohrung
Tygon S3 E-3603 SchlauchneoLab Migge GmbH, Heidelberg, Deutschland2-4450ACF00001
PTFE-SchlauchBohlender GmbH, Grü nsfeld, DeutschlandS1810-08
NameCompanyKatalognummerComments
>Sample
Hefe Hsp90 D61C, Q385C_biotinUniProt ID P02829
Maleimidderivate von Atto488, Atto550ATTO-TEC GmbH, Siegen, Deutschland
AMP-PNP*Jena Bioscience, Jena, Deutschlandγ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
FluosphärenThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAF8764aminmodifiziert, 0,2 μ m, gelb-grün fluoreszierend
Name<>Unternehmen<>KatalognummerKommentare
>Software
Andor SolisAndor Technology Ltd, Belfast, NordirlandVersion 4.30
LabVIEWNational Instruments, Austin, Texas, USAVersion 2012, 32bit; diverse Hardware Steuerung
MDS SteuerungssoftwareAA Opto-Electronic, Orsay, FrankreichVersion 2.03a
Coherent ConnectionCoherent Inc, Santa Clara, CA, USAVersion 3
Igor ProWaveMetrics Inc, Portland, OR, USAVersion 6.37

Referenzen

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