Methodenartikel

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

DOI:

10.3791/56901

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26. Januar 2018

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1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von einzelnen Bakterienzelle Linien mit Bacillus Subtilis als Beispiel mikrofluidischen. Die Methode überwindet Mängel der traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie durch Beobachtung von Hunderten von Generationen der Zelle unter eng kontrollierbar und einheitliche Wachstumsbedingungen ermöglicht.

Zusammenfassung

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Mikrofluidische Technologie überwindet viele der Einschränkungen zu den traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie. Anders als Massen-Kultur bietet es eine einzellige Auflösung und lange Beobachtung Zeiten überspannt Hunderte von Generationen; im Gegensatz zu Agarose Pad-basierte Mikroskopie hat es einheitliche Wachstumsbedingungen, die streng kontrolliert werden können. Weil der kontinuierliche Fluss von Nährmedium der Zellen in einem mikrofluidischen Gerät aus unvorhersehbaren Schwankungen in der chemischen Umgebung verursacht durch Zellwachstum und Stoffwechsel, authentische Veränderungen der Genexpression und das Zellwachstum in Reaktion auf isoliert bestimmte Reize können sicher beobachtet werden. Bacillus Subtilis dient hier als ein Modell Bakterienarten, eine "Mutter-Maschine" zu demonstrieren-Methode für die zelluläre Analyse geben. Wir zeigen, wie Sie zu konstruieren und mikrofluidischen Gerät zu ergründen, mit Zellen zu laden, mikroskopische Bildgebung zu initiieren, und setzen Zellen auf einen Reiz durch den Wechsel von einem Wachstumsmedium zum anderen. Stress-responsive Reporter wird als Beispiel verwendet, um den Typ der Daten offenbaren, die mit dieser Methode erzielt werden können. Wir diskutieren auch kurz weitere Anwendungen dieser Methode für andere Arten von Experimenten, wie z. B. Analyse der bakteriellen Sporenbildung.

Einleitung

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Eines der auffälligsten Merkmale des Lebens auf der Erde ist seine große Widerstandsfähigkeit und Vielfalt. Ein zentrales Ziel der Molekularbiologie ist es, die Logik zu verstehen, mit der Zellen Gene und Proteine verwenden, um ihr Wachstum und ihre Fitness unter verschiedensten Umweltbedingungen zu maximieren. Um dieses Ziel zu erreichen, Wissenschaftler dürfen getrost zu beobachten wie einzelne Zellen wachsen, teilen und express ihre Gene unter einem gegebenen Satz von Bedingungen, unter Hinweis darauf, wie Zellen auf nachträgliche Änderungen in ihrer Umgebung reagieren. Traditionellen analytische Methoden in der Mikrobiologie haben jedoch technische Einschränkungen....

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Protokoll

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(1) PDMS Gerät Casting

  1. In einer staubfreien Umgebung PDMS Polymer und Härtemittel im Verhältnis 10:1 mischen und unter Vakuum für mindestens 10 Minuten entgasen.
  2. Legen Sie ein Silizium-Meister (oder eine Epoxid oder Polyurethan Nachbildung davon) auf ein Stück Alufolie ungebrochen in einem Polystyrol Petri-Platte. Den Teig entgast PDMS über den Master bis zu einer Tiefe von ca. 5 mm. Degas die Petri-Platte für mindestens 10 Minuten Nutzung eines sanften Luftstrom Oberfläche Bläschen zu brechen.
    Hinweis: Die Abmessungen des Gerätes zwei Ebenen werden zur Verfügung gestellt im zugehörigen CAD Datei5 (siehe ergänzend....

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Ergebnisse

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Erfolgreiche erste Zelle laden, wie Phasenkontrast-Mikroskopie bewertet vor dem Anbringen der mikrofluidischen Sanitär an das Gerät würde gelten, dass alle oder fast alle der mikrofluidischen Seitenarmen, enthält eine oder mehrere bakterielle Zellen ( Abbildung 3A). Optimale Beladung würde mehrere Zellen in jedem Kanal zeigen, aber Kanäle füllt sich dennoch mit Zellen durch Zellwachstum Gleichgewichtherstellung Zeitraum (Abb. 3 b.......

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Diskussion

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Diese Mikrofluidik-Protokoll ist flexibel, dass viele der Schritte zur Optimierung ihrer Nutzung mit einer bestimmten Art oder Sorte oder für einen bestimmten Zweck geändert werden können. In diesem Protokoll haben wir Änderungen an der ursprünglichen "Mutter-Maschine" Konzept4 zur Optimierung ihrer Nutzung mit B. Subtilisgemacht. Oft bilden die Schützengräben, in denen die Zellen beschränkt sind, eine einschichtige Funktion während in dieses Protokoll verwenden wir Zweischicht-Zelle Gräb.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Dieses Projekt wurde gefördert durch die National Institutes of Health unter GM018568. Dieses Protokoll wurde teilweise in der Mitte für Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied von der nationalen Nanotechnologie abgestimmte Infrastruktur Netzwerk (NNCI), durchgeführt, die von der National Science Foundation unter NSF Award Nr. 1541959 unterstützt wird. CNS ist Teil der Harvard University. Vielen Dank gebührt Thomas Norman und Nathan Herrn für ihre Arbeit bei der Konzeption und Herstellung der Mastervorlage für die Geräte gezeigt, hier und in den Aufbau der ursprünglichen Version des Geräts verwendet. Wir auch vielen Johan Paulsson für seine wertvolle gemeinsame Beratung....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Sylgard 184 Silikonelastomer KitDow Corning(240)4019862Dies wird im Protokoll als PDMS bezeichnet. Es gibt 2 Komponenten, die in einem Verhältnis von 10:1 gemischt werden:
0,75 mm Biopsie-StanzeWorld Precision Instruments504529
22 x 40 mm Nr. 1,5 DeckglasVWR48393 172
Plasma Etch PE-50Plasma Etch Inc.PE-50Instrument zur Verklebung von PDMS mit Glas mittels Sauerstoffplasmabehandlung
Tygon flexibler Schlauch ID 0,02", OD 0,06"Saint-Gobain PPL Corp.AAD04103Für den Hauptteil des Schlauches, z.B. an den Nadeln befestigt
Silikonschlauch, 0,04" ID, 0,085" ODHelixMark Standard Silikonschlauch60-795-05Für Quetschventile und Y-Übergang Anschluss
Rinderserum AlbuminSigma-AldrichA7906-100GWird als Passivierungsmittel
verwendet ART Gel Pipettenspitzen (P200)Molecular BioProducts2155Zur Beladung des Gerätes mit Medium und Küvetten
Acrodisc 32-mm-Spritzenvorsatzfilter mit 5-μ m Supor MembranPall Life Sciences4560Zum Filtern von Kulturen vor dem Laden
von 21-ga-stumpfen Nadeln, 1"McMaster-Carr75165A681
Y-Anschluss mit Widerhaken der Serie 200, 1/16" ID-Schlauch, PolypropylenNordson MedicalY210-6005Unternehmen ist AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E inverses MikroskopNikonDieses Gerät wurde vom Hersteller abgekündigt und durch das Ti 2 E ersetzt.
LB LennoxSigma-AldrichL3022
Microfuge 18Beckman Coulter367160
Bacillus subtilis Stamm NCIB3610Bacillus Genetic Stock Center3A1Wildtyp-Elternstamm, modifiziert für die Verwendung in den in diesem Protokoll gezeigten Experimenten
SchwerkraftkonvektionsofenVWR414005-106zum Aushärten von PDMS und Backen montiert Geräte
Scotch-Weld Epoxy Kit3M2216 B/Akann verwendet werden, um einen Siliziumwafer mit einer Aluminium-Trägerplatte zu verbinden
Scotch Magic Tape, 3/4" Breite3Mzum Reinigen von Staub von PDMS-Geräten und zum Platzieren von Merkmalen zur Erhöhung der Sichtbarkeit (im Protokoll als "Büroband" oder "Klebeband" bezeichnet)
StereomikroskopNikonSMZ800Nhier als Beispiel aufgeführt; Nahezu jedes Stereomikroskop eignet sich für
IsopropylalkoholSigma-AldrichW292907Zur Reinigung von Deckglas
Spritzenpumpe, 6-KanalNew Era Pump Systems Inc.NE-1600
KimwipesKimberly-Clark34120eine Marke für staubfreie Tücher
Das

Referenzen

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  1. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
  2. Young, J. W., et al.

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Schlagwörter

Mikrofluidik BauteilEinzelzellanalyseMother MachinePDMS BondingSpritzenpumpeFluoreszenzreporterbakterielle SporulationPhasenkontrastZelllinie

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