Summary
Zufällige Triebe können auf Internodien Segmente der Ipecacuanha ohne Phytohormon Behandlung induziert werden. Um Phytohormon Dynamik während zufällig schießen Bildung zu bewerten, haben wir endogenen Auxin und Cytokinin in Internodien Segmenten von LC-MS/MS gemessen.
Abstract
Zufällige Shooting Bildung ist eine wichtige Technik für die Ausbreitung der wirtschaftlich bedeutenden Kulturen und für die Regeneration von transgenen Pflanzen. Phytohormon Behandlung ist erforderlich für die Induktion von zufällige Aufnahmen bei den meisten Arten. Ob zufällig Triebe induziert werden können wird bestimmt durch das Gleichgewicht zwischen Auxin und Cytokinin (CK) Ebenen. Viel Aufwand geht in der Bestimmung der optimalen Konzentrationen und Kombinationen von Phytohormonen in jedem Gewebe als Explantaten verwendet und bei jedem Pflanzenarten. In Ipecac können jedoch zufällig Triebe auf Internodien Segmente in Kulturmedium ohne Phytohormon Behandlung induziert werden. Dies ermöglicht die inhärente Plastizität von Ipecac für Zelldifferenzierung ausgewertet werden. Um zufällige Triebe in Ipecac induzieren, kultivierten wir Internodien Segmente bei 24 ° C unter 15 µmol m−2 s−1 des Lichts in einem 14-h Licht/10-h dunklen Zyklus auf Phytohormon-freie B5 Medium verfestigt mit 0,2 % Gellan Gum für 5 Wochen. Um Phytohormon Dynamik während zufällig schießen Bildung zu untersuchen, haben wir gemessen endogenen Indol-3-acetic Acid und CKs in den Segmenten durch flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie LC-MS/MS. Diese Methode ermöglicht die Analyse der endogenen Indol-3-acetic Säure und CKs Ebenen auf einfache Weise. Es kann angewendet werden, um die Dynamik der endogenen Auxin und CK während der Organogenese in anderen Pflanzenarten zu untersuchen.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) vorgeschlagen, das Konzept der "Totipotenz", von welchem Werk Zellen teilen können, unterscheiden, und ganze Pflanzen auch nach deren vorherige Differenzierung in bestimmten Zelltypen reifen Pflanzen1zu regenerieren. In der Gewebekultur wird ob Pflanze Regeneration induziert werden kann durch die Kombination und Konzentration von EXOGEN angewandte Phytohormonen in das Wachstumsmedium bestimmt. Skoog und Miller gefunden, dass zufällige Aufnahmen von Tabak Kallus auf Nährmedium enthält ein hohes Verhältnis von CKs, Auxine, induziert werden konnte, während zufällige Wurzeln auf ein niedriges Verhältnis2-haltigem Medium induziert werden konnte. Seit dieser Feststellung hat Gewebekultur für die Ausbreitung der wirtschaftlich bedeutenden Kulturen und für die Regeneration von transgenen Pflanzen3verbreitet. Zufällige Triebe können von Gewebe als Shooting Sprossapikalmeristem Meristem, wie Blätter, Wurzeln und Internodien induziert werden. Phytohormon Behandlung ist erforderlich für die Induktion von zufällige Aufnahmen in den meisten Pflanzenarten. Allerdings unterscheiden sich die optimale Konzentrationen und Kombinationen nach Arten und unter Gewebe als Explantaten verwendet. So geht viel Aufwand in der Bestimmung der optimalen Konzentrationen und Kombinationen von Phytohormonen für Experimente.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Ipecac) ist eine Heilpflanze, die Alkaloide wie Emetine und Cephaeline, hauptsächlich in den Wurzeln4enthält. Wurzelextrakten dienen als schleimlösend, ein Brechmittel und eine Amoebicide5. Obwohl Ipecac natürlich in den tropischen Regenwäldern von Brasilien wächst, es ungern Samen in Kultur gesetzt, und die Keimrate verringert während der Lagerung der Samen in Japan mit seinen kälteren Klima6. Stattdessen ist es durch Gewebekultur fortgepflanzt, in denen zufällig schießen Formation auf Internodien ist die effizienteste Methode7,8. Interessanterweise können zufällige schießt in dieser Spezies ohne Phytohormon Behandlung8induziert werden.
Zufällige Triebe bilden sich auf der Epidermis in der apikalen Region der Internodien Segmente ohne callusing, aber nicht in den basalen Region9. Dieser Unterschied zeigt Gewebe Polarität in der Internodien Segmente, die wahrscheinlich unter phytohormonal Regelung. Das Ipecac-Kultur-System ermöglicht eine einzigartige Gelegenheit, Änderungen im endogenen Phytohormon Ebenen während zufällig schießen Bildung zu analysieren. Hier stellen wir unsere Methode für die Analyse der endogenen Ebenen ein Auxin (Indol-3-acetic Acid (IAA)) und vier CKs (Isopentenyl Adenin (iP), Isopentenyl Adenin Riboside (iPR), Trans-Zeatin (tZ) und Trans-Zeatin Riboside (tZR)) in Internodien Segmente durch den Einsatz von LC-MS/MS.
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Protocol
Hinweis: Ipecac (C. Ipecacuanha) wurde in dieser Studie verwendet, weil es die Analyse der endogenen Phytohormone erleichtert.
(1) Wachstumsbedingungen induzieren zufällige Triebe von Ipecac
- Bereiten Sie Phytohormon-freie B5 Medium bis pH 5,710eingestellt zu, und 0,2 % Gellan Gum. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren.
- Gießen Sie 25 mL des Mediums autoklaviert in eine sterile Petrischale (90 mm × 20 mm).
- 8 mm Internodien Segmente von Ipecac Pflänzchen mit einem chirurgischen Skalpell mit Klinge Nr. 22 auf eine sterile Acrylplatte, und auf dem Medium (Abbildung 1).
- Kultur auf Phytohormon-freie B5 Medium bei 24 ° C unter 15 µmol m−2 s−1 des Lichts in einem 14-h Licht/10-h dunklen Zyklus für 5 Wochen.
- Regionen zu identifizieren ich (apikalen) bis IV (basal) in jedem Segment (Abbildung 1B). Die Anzahl der zufällige Triebe > 0,3 mm Länge in den einzelnen Regionen unter dem Mikroskop einmal pro Woche.
(2) Extraktion und Reinigung von Phytohormonen
- Setzen Sie eine 5 mm Zirkonia Perle in jeder der vier 2-mL-Probenröhrchen.
- Schneiden Sie die Segmente in Regionen I bis IV (je 2 mm in der Länge) mit einem chirurgischen Skalpell auf eine sterile Acrylplatte.
- Sammeln Sie acht Segmente der einzelnen Regionen in separaten Probenröhrchen (10-30 mg Frischgewicht).
- Wiegen, und dann Einfrieren der Proben in flüssigem Stickstoff.
- Die gefrorenen Proben unter Verwendung einer Perle-basierte Homogenisator zu vernichten.
- Aussetzen der zerkleinerten Proben in 1 mL Acetonitril mit 500 Pg der einzelnen internen Standards von Auxin und CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) mit einem Vortex-Mixer.
- Halten Sie bei 4 ° C für 1 h und Zentrifugieren bei 3.500 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie das Pellet in 80 % (V/V) Acetonitril mit Essigsäure 1 % (V/V). Zentrifuge wieder bei 3.500 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Kombinieren Sie die Überstände (aus Schritt 2.7 und 2.8) in einer Einweg-Glasröhre.
- Fügen Sie 600 µL Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure zu jeder kombinierten überstand und verdunsten das mit einer Vakuum-Konzentrator Acetonitril.
- Equilibrate hydrophilen lipophil-ausgewogen (HLB) Spalte Patronen durch die Anwendung von 1 mL Acetonitril, Methanol und Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure.
- Gelten Sie eine Beispiellösung pro äquilibriert HLB Patrone.
- Waschen Sie die Patronen mit 1 mL Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure.
- Eluieren Sie alle Hormone mit 2 mL 80 % (V/V) Acetonitril mit 1 % (V/V) Essigsäure in einer Glasröhre.
- Verdunsten Sie Acetonitril in das Eluat Extrakt in Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure mit einem Vakuum Konzentrator zu erhalten.
Hinweis: Nicht trocken Sie dies vollständig. - Equilibrate gemischt-Modus, starken Kationenaustausch (MCX) Spalte Patronen durch die Anwendung 1 mL Acetonitril, 1 mL Methanol, 0,5 mL 0,1 M HCl und 1 mL Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure.
- Gelten Sie eine Beispiellösung pro äquilibriert MCX Patrone.
- Waschen Sie die Patronen mit 1 mL Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure.
- Eluieren Sie IAA mit 2 mL 30 % (V/V) Acetonitril mit 1 % (V/V) Essigsäure in einer Glasröhre.
- Waschen Sie die Patronen mit 2 mL 80 % (V/V) Acetonitril mit Essigsäure 1 % (V/V).
- Waschen Sie die Patronen mit 2 mL Wasser und 1 mL Wasser, 5 % wässriger Ammoniak enthält.
- Die CKs mit 2 mL 60 % (V/V) Acetonitril mit 5 % wässriger Ammoniak in einer Glasröhre eluieren.
- Verdunstet das Lösungsmittel der einzelnen Hormon-Fraktionen mit einem Vakuum Konzentrator und Lagern bei-30 ° C bis die LC-MS/MS-Analyse.
(3) LC-MS/MS-Analyse der IAA und CKs
- Jedes Hormon-Extrakt in einem Rohr mit 600 µL Methanol auflösen und die Lösung zu einem Schraube Hals völligen Heilung Fläschchen zu übertragen. Verdunsten Sie das mit einer Vakuum-Konzentrator Lösungsmittel.
- Auflösen der IAA Bruch in 20 µL 30 % (V/V) Acetonitril und die CK-Brüche in 20 µL Wasser mit 1 % (V/V) Essigsäure in Schraube Hals völligen Heilung Fläschchen.
- Analysieren Sie die Proben im positiven Ionen-Modus auf eine Triple-Quadrupol-MS-System mit einer HPLC-Anlage ausgestattet.
Hinweis: Wir legen die HPLC-Bedingungen, wie in Tabelle 1aufgeführt.- Für die IAA Elution verwendet einen binären Gradienten von 5-50 % Lösungsmittel B mehr als 7 min, dann erhöhen durch 98 % Lösungsmittel B 1 min warten und dann für 2 min bei 5 % Lösungsmittel B durch Nest Injektion equilibrate.
- Für die CK-Elution verwendet eine binäre Gefälle von 2 % - 40 % Lösungsmittel B mehr als 5 min, 40-70 % Lösungsmittel B in 7 min, dann erhöhen, indem Sie 95 % Lösungsmittel B 1 min warten und dann für 2 min bei 2 % Lösungsmittel B durch equilibrate Injektion zu verschachteln.
- Festlegen die Elektrospray-Ionisation (ESI)-MS-Parameter der Ionenquelle wie in Tabelle 2aufgeführt.
- Verwenden Sie die mehrere Reaktion monitoring (MRM) Übergang zur Quantifizierung der einzelnen Analyten in Tabelle 3aufgeführten.
- Endogene IAA und CK-Ebene gegen eine Standardkurve des Verhältnisses der unbeschrifteten Deuterium-Label Standards zu quantifizieren.
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Representative Results
1St Woche hatte keine zufällige Triebe gebildet. Bei der 2Nd Woche erschienen kleine Triebe. Die Anzahl der schießt auf die 3rd und 4th Wochen erhöhte meist in den apikalen Regionen (I und II) (Abb. 2A). Inder 5 Woche die Zahl der Triebe war etwa 7 in Region ich und 5 in Region II (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu bildeten sich nur ein paar Triebe in Regionen III und IV.
Vor Kultur, die IAA war etwas höher in Region ich (4.1 Pg/mg, Frischgewicht (FW)) als in den Regionen II-IV (~ 2,5 Pg/mg FW; ( Abbildung 3). 1 WocheSt , IAA erhöht stark in der Region IV (11,4 Pg/mg FW) und in den Regionen I-III (1.5-2.2 Pg/mg FW) leicht zurückgegangen. In der Woche 2Nd die IAA-Ebene in Region IV sank auf ~ 4,4 Pg/mg FW, darauf hinweist, dass die IAA-Ansammlung in der basalen Region vorübergehend war. Von 5 Wochen von Kultur entstand ein Konzentrationsgradient IAA mit Ebenen aus Region ich auf Region IV erhöhen.
Vor Kultur gab es nur Trace-Levels von den meisten CKs (Abbildung 3). 1St Woche stiegen die tZR 13,8 Pg/mg FW in Region II und 18.1 Pg/mg FW Region III. Das Niveau sank dann nach und nach mehr als 5 Wochen der Kultur. Auf der anderen Seite die Ebenen der tZ, iP und iPR nur geringfügig verändert während der Kultur.
Abbildung 1 : Vorbereitung von Ipecac für zufällige Shooting Bildung. (A) ist eine Internodien Segment (8 mm lang) aus regenerierten Ipecac auf einer sauberen Werkbank geschnitten. (B) die erste Internodium war für zufällige Shooting Bildung verwendet. (C) Segmente sind auf 25 mL Phytohormon-freie B5 Medium in Petrischalen induzieren zufällige Triebe kultiviert. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Verteilung der zufällige schießt auf ein Internodien Segment gebildet. (A) zufällige Triebe nach 0 bis 5 Wochen der Kultur gebildet. Maßstabsleiste = 5 mm. (B) Segmente wurden aufgeteilt in vier Regionen (I-IV) und die Anzahl der zufällige Aufnahmen in jeder Region wurde in Woche 5 gezählt. Daten sind Mittel ± SEM (n = 3). 10 Segmente wurden in jedem Experiment verwendet. NF = nicht gefunden. Diese Zahl wurde von Koike Et Al. modifiziert 9 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Zeitverlauf Analyse von Phytohormonen Ebenen in Internodien Segmenten. Segmente wurden in vier Regionen (I-IV) getrennt. Endogene IAA und CKs (tZ, tZR, iP und iPR) in jeder Region wurden durch LC-MS/MS quantifiziert. Da iP und iPR Ebenen sehr niedrig waren, wurde eine vergrößerte Grafik innerhalb der gleichen Grafik eingefügt. Daten sind Mittel ± SEM (n = 3). Acht Segmente wurden in jedem Experiment verwendet. Diese Zahl wurde von Koike Et Al. modifiziert 9 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Spalte | IAA: ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1,7 µm |
| CKs: Poroshell EG-C18 φ2.1 × 50 2,7 µm | |
| Temperatur | 40ºC |
| Die Mobile phase | Lösungsmittel A: destilliertes Wasser + 0,05 % Essigsäure |
| Lösungsmittel B: Acetonitril + 0,05 % Essigsäure | |
| Durchflussmenge | 0,35 ml/min |
| Injektionsvolumen | 18 µl |
Tabelle 1: HPLC Analyse IAA und CK Zustand.
| Vorhang-Gas (a.u.)* | 10 / 40 ** |
| Kollision Gas (a.u.)* | 5 / 3 ** |
| Ionen-Spray Spannung (V) | 5500 |
| Temperatur (º c) | 600 |
| Ionen-Quelle Gas 1 (a.u.)* | 30 |
| Ionen-Quelle Gas 2 (a.u.)* | 40 / 80 ** |
| Auflösung | Einheit |
Tabelle 2: Parameter der Ionenquelle. * willkürliche Einheiten. ** IAA-Analyse/CK-Analyse. Diese Tabelle wurde von Koike Et Al. modifiziert 9
| Q1 (m/Z) | Q3 (m/Z) | Declustering Potential (V) | Möglichen Eintritt (V) | Aufprallenergie (V) | |
| IAA | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5- tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| tZR | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5- tZR | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| iP | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| d6- iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| Rechte des geistigen Eigentums | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| d6- Rechte des geistigen Eigentums | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
Tabelle 3: MRM Übergänge der IAA und CKs in LC-MS/MS-Analyse. Diese Tabelle wurde von Koike Et Al. modifiziert 9
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Discussion
Ermittlung die Verteilung von Phytohormonen unbedingt beteiligt Organogenese verwenden Pflanzenmaterial in denen Organogenese auf Phytohormon-freies Medium beobachtet werden kann, weil wenn Phytohormone Explantaten zur Induktion exogen zugewiesen werden Triebe oder Wurzeln, beeinflussen sie das ganze Explant, macht es schwierig, die inhärente Plastizität der Pflanzen in Zell-Differenzierung und Organogenese zu bewerten. Zufällige Triebe können auf Phytohormon-freie Kulturmedien in andere Pflanzenarten wie Dianthus Caryophyllus L.11, Aegle Marmelos (L.) Corrêa12, Bacopa Monnieri (L.) Pennell13 induziert werden Celastrus Paniculatus Willd. 14und Kalanchoë Blossfeldiana Poelln. 15. wäre es möglich, das Protokoll in diese Pflanzenarten anzuwenden.
Wir IAA, tZ, tZR, iP und iPR in Acetonitril extrahiert und durch Festphasen-Extraktion gereinigt. Die Originalmethode verwendet drei Arten von Patrone Spalten (HLB, MCX und schwaches Anion Exchange (Wachs)), weil alle Phytohormone gereinigte (einschließlich Gibberelline, Abscisic Säure, Jasmonsäure und Salicylsäure)16 sind. Die HLB-Spalte verwendet eine Polymere Reverse-Phase-Sorbens, MCX-Spalte verwendet das gleiche mit Kationenaustausch Gruppen und die Wachs-Spalte verwendet das gleiche mit schwachen Anion-Exchange-Gruppen. Die ursprüngliche Methode elutes CKs (basic) mit 60 % Acetonitril mit wässriger Ammoniak auf eine MCX-Spalte im zweiten Schritt, und dann IAA (sauren) mit 80 % Acetonitril mit 1 % Essigsäure auf einer Wachs-Spalte in der letzte Schritt. Da unser Fokus Auxin und CKs, die antagonistisch interagieren, um Pflanze Wachstum17zu regulieren, verwendet das vereinfachte Protokoll nur die Spalten HLB und MCX; IAA ist mit 30 % Acetonitril mit 1 % Essigsäure auf der HLB-Spalte im ersten Schritt eluiert. Es dauert zwei Tage von Probenvorbereitung LC-MS/MS-Analyse.
Das Acetonitril Lösungsmittel darf nicht austrocknen während Phytohormon Reinigung in den Spalten der Patrone. Wenn ja, Aufschwemmen der Probenmaterials in Acetonitril zu verhindern, dass die Phytohormone zu stecken, um das Glasrohr und verloren aus der Probe. In diesem Protokoll ist die Nachweisgrenze mit Ionenfallen MS-System ~ 10 Pg zur IAA und CKs von 10-30 mg frischem Gewebe. Um kleinere Mengen zu analysieren, wäre es notwendig, viel mehr von der Probe zu sammeln oder MS mit höherer Empfindlichkeit zu verwenden.
Phytohormon-Analyse ist ein wichtiges Verfahren für die Beurteilung von Wachstum und Entwicklung. Mit dieser Methode können wir möglicherweise bestimmen, das Timing von Auxin und CK Behandlung für zufällige Shooting Bildung in Pflanzenarten wo ist die optimale Kultur Bedingung noch unbekannt. Phytohormon Quantifizierung zunehmend an Bedeutung gewinnt, wird das hier beschriebene LC-MS/MS-Protokoll die Analyse von kleinen Proben mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung ermöglichen. Unsere Vereinfachung der bisherigen Methode erleichtert Reinigung und Analyse, und bringen hohe Vielseitigkeit und Reproduzierbarkeit. In Zukunft kann diese Methode angewendet werden, um die Dynamik der endogenen Auxin und CK während der Organogenese in anderen Pflanzenarten zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, Herr Akira Murakami der Abteilung für Angewandte Biowissenschaften, Toyo University und Herr Koudai Taniguchi Gunma Agricultural Technology Center für ihre technische Unterstützung. Wir sind auch Professor Shosaku Kashiwada und Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo University für ihre Anregungen dankbar. Diese Studie wurde teilweise durch das Forschungszentrum für Leben und Umweltwissenschaften, Toyo University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
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