Summary
נצרי adventitious יכולה להיגרם במקטעים internodal הוזמנתי למסיבה ללא טיפול phytohormone. כדי להעריך את הדינמיקה phytohormone במהלך היווצרות לירות adventitious, מדדנו אוקסין אנדוגני, ציטוקינין בקטעים internodal על-ידי LC-MS/MS.
Abstract
לירות adventitious צורה היא טכניקה חשוב התפשטות של הגידולים החקלאיים כלכלית ועל לרגנרציה של הצמחים הטרנסגניים. Phytohormone טיפול נדרש אינדוקציה של נצרי adventitious של רוב המינים. אם יורה adventitious יכולה להיגרם נקבעת על-ידי האיזון בין אוקסין ציטוקינין (CK) רמות. מאמץ רב נכנס לקביעת ריכוזים מיטביים ושילובים של phytohormones כל רקמה משמש explants, כל מיני צמחים. ב. הוא אדם חכם, עם זאת, יורה adventitious יכולה להיגרם במקטעים internodal תרבות בינוני ללא טיפול phytohormone. פעולה זו מאפשרת את פלסטיות הגלום הוזמנתי למסיבה עבור תאית התמיינות להערכה. לזירוז יורה adventitious, הוזמנתי למסיבה, אנחנו תרבותי מקטעים internodal ב 24 ° C תחת 15 µmol מ'−2 s− 1 של אור במחזור 14-h אור/10-h כהה. ללא phytohormone B5 בינוני פני השטח למוצק עם מסטיק gellan 0.2% למשך 5 שבועות. לחקור phytohormone dynamics במהלך היווצרות לירות adventitious, מדדנו אנדוגני חומצה אינדול-3-אצטית ואת הגרביים בתוך המקטעים באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית LC-MS/MS. שיטה זו מאפשרת ניתוח של חומצה אינדול-3-אצטית אנדוגני ורמות הגרביים בדרך פשוטה. ניתן להחיל אותה לחקור את הדינמיקה של אוקסין אנדוגני, CK במהלך organogenesis של מיני צמחים אחרים.
Introduction
Haberlandt גוטליב (1854-1945) הציע את הרעיון של "totipotency", על ידי הצמח אילו תאים יכולים לחלק, להבדיל, והפק צמחים שלמים גם לאחר בידול מוקדמת שלהם לתוך תאים מסוים סוגי שתילים בוגרים1. בתרבות רקמה, אם התחדשות הצמח יכולה להיגרם או לא נקבעת על ידי שילוב של ריכוז phytohormones exogenously יישומית במצע הגידול. Skoog ומילר מצא כי נצרי adventitious יכולים להיגרם מן קסם טבק באמצעי תרבות המכיל יחס גבוה של הגרביים כדי auxins, ואילו שורשים adventitious יכולים להיגרם על בינוני המכיל יחס נמוך2. מאז הממצאים, תרביות רקמה כבר בשימוש נרחב על התפשטות של הגידולים החקלאיים כלכלית ועל לרגנרציה של הצמחים הטרנסגניים3. נצרי adventitious יכולה להיגרם רקמות חוץ meristem apical לירות, כגון עלים, שורשים, פרקי הגבעולים. Phytohormone טיפול נדרש אינדוקציה של נצרי adventitious של רוב מיני צמחים. עם זאת, ריכוז אופטימלי ושילובים שונים על ידי מינים ובקרב רקמות משמש explants. כך, מאמץ רב נכנס לקביעת ריכוזים מיטביים של שילובים של phytohormones לניסויים.
Carapichea ipecacuanha (ברוט.) ל' אנדרסון (איפקאק) הוא צמח מרפא המכיל אלקלואידים כגון emetine ו- cephaeline, ובעיקר השורשים4. תמציות בסיס משמשים ומכייח, של כל ו של amoebicide5. למרות איפקאק גדל באופן טבעי הגשם הטרופיים של ברזיל, זה מסרבים להגדיר זרעים בתרבות, מקטינה שיעור הנביטה במהלך האחסון זרע ביפן, עם אקלים קר שלה6. במקום זאת, זה הופץ על ידי תרביות רקמה, אשר adventitious לירות7,השיטה היעילה ביותר8הוא היווצרות על פרקי הגבעולים. מעניין, יורה adventitious יכולה להיגרם במין זה ללא טיפול phytohormone8.
נצרי adventitious נוצרות על האפידרמיס באזור הפסגה של מקטעי internodal ללא callusing, אך לא את הבסיס באזור9. הבדל זה מציין קוטביות רקמות בקטעים internodal, שהוא כנראה לפי תקנה phytohormonal. מערכת התרבות איפקאק מאפשר הזדמנות ייחודית לנתח את השינויים ברמות phytohormone אנדוגני במהלך היווצרות לירות adventitious. כאן אנו מציגים שלנו שיטה לניתוח של רמות אנדוגני של אחד אוקסין (חומצה אינדול-3-אצטית (רשות העתיקות)) ואת הגרביים ארבע (isopentenyl אדנין (iP), isopentenyl אדנין riboside (ריבית), טרנס-zeatin (ט ז), טרנס-zeatin riboside (תצרוכת)) בקטעים internodal באמצעות LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: איפקאק (ipecacuanha ג) שימש במחקר זה כי הוא מקל הניתוח של phytohormones אנדוגני.
1. צמיחה תנאים לזירוז יורה Adventitious הוזמנתי למסיבה
- להכין ללא phytohormone B5 בינוני להתאים ל- pH 5.710והוסיפו החניכיים gellan 0.2%. לחטא על-ידי autoclaving.
- שופכים 25 מ של המדיום בלוק לתוך צלחת פטרי סטריליות (90 מ"מ × 20 מ"מ).
- לחתוך קטעים internodal 8 מ מ של שתילי איפקאק באמצעות אזמל כירורגי עם להב מס 22 על מגש אקריליק סטרילי, ומניחים על המדיום (איור 1).
- תרבות ללא phytohormone B5 בינוני ב 24 ° C תחת 15 µmol מ'−2 s− 1 של אור במחזור 14-h אור/10-h כהה למשך 5 שבועות.
- לזהות אזורים אני (הפסגה) הרביעי (הבסיס) כל קטע (איור 1B). לספור את מספר יורה adventitious > 0.3 מ מ אורך בכל אזור תחת מיקרוסקופ פעם בשבוע.
2. מיצוי וטיהור של Phytohormones
- מכניסים כל אחד הצינורות מדגם 2-mL ארבע חרוז קריסטל 5 מ מ.
- חותכים את מקטעי אזורים אני הרביעי (לכל אורך ממ ב 2) באמצעות אזמל כירורגי על מגש אקריליק סטרילי.
- לאסוף שמונה מקטעים של כל אזור נפרד מדגם צינורות (10-30 מ"ג טריים משקל).
- שוקל, לאחר מכן להקפיא את הדגימות של חנקן נוזלי.
- לרסק את הדגימות קפוא באמצעות מהמגן המבוסס על חרוז.
- להשעות את הדגימות כתוש ב 1 מ"ל acetonitrile המכילות 500 pg של כל תקן פנימי של אוקסין ואת הגרביים (ד5- רשות העתיקות, d5- ט ז, ד5- תצרוכת, ד6- iP, ד6- ריבית) באמצעות מערבל מערבולת.
- להחזיק ב 4 ° C עבור 1 h ולאחר מכן צנטריפוגה-3,500 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את צניפה ב- 80% (v/v) acetonitrile המכיל חומצה אצטית 1% (v/v). צנטריפוגה שוב ב 3,500 × g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשלב את supernatants (מתוך שלבים 2.7 ו- 2.8) שפופרת זכוכית חד פעמיות.
- להוסיף 600 µL מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v) כל תגובת שיקוע משולב, והם מתאדים את acetonitrile באמצעות רכז ואקום.
- Equilibrate הידרופיליות-lipophilic-מאוזן מחסניות עמודה (HLB) על-ידי החלת 1 מ"ל כל של acetonitrile, מתנול מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).
- להחיל פתרון אחד מדגם מכל מחסנית HLB equilibrated.
- לשטוף את מכלי הדיו עם 1 מ"ל מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).
- Elute הורמונים כל עם 2 מ ל 80% (v/v) acetonitrile המכיל 1% (v/v) חומצה אצטית שפופרת זכוכית.
- להתנדף את acetonitrile, eluate כדי לקבל תמצית במים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v) באמצעות רכז ואקום.
הערה: לא יבש זה לחלוטין. - Equilibrate מחסניות העמודה מצב מעורב, חזק-קטיון (MCX) על-ידי החלת acetonitrile 1 מ"ל, 1 מ"ל מתנול, 0.5 מ"ל 0.1 M HCl ו 1 מ"ל מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).
- להחיל פתרון אחד מדגם מכל מחסנית MCX equilibrated.
- לשטוף את מכלי הדיו עם 1 מ"ל מים המכילים חומצה אצטית 1% (v/v).
- Elute רשות העתיקות עם 2 מ ל 30% (v/v) acetonitrile המכיל 1% (v/v) חומצה אצטית שפופרת זכוכית.
- לשטוף את מכלי הדיו עם 2 מ ל 80% (v/v) acetonitrile המכיל חומצה אצטית 1% (v/v).
- לשטוף את מכלי הדיו עם 2 מ"ל מים ו- 1 מ"ל מים המכילים אמוניה מימית 5%.
- Elute את הגרביים עם 2 מ ל 60% (v/v) acetonitrile המכילים אמוניה מימית 5% שפופרת זכוכית.
- להתאדות הממיס של כל שבר הורמון באמצעות רכז ואקום ולאחסן ב −30 ° C עד הניתוח LC-MS/MS.
3. LC-MS/MS ניתוח של רשות העתיקות ואת הגרביים
- להמיס כל תמצית הורמון בשפופרת עם 600 µL של מתנול ולהעביר את הפתרון בקבוקון התאוששות מוחלטת של הצוואר בורג. להתנדף הממס באמצעות רכז ואקום.
- להמיס את השבר רשות העתיקות ב 20 µL 30% (v/v) acetonitrile, ושברים CK במים 20 µL המכיל 1% (v/v) חומצה אצטית ב בורג הצוואר התאוששות מוחלטת בקבוקונים.
- לנתח את הדגימות במצב יון חיובי על מערכת MS טריפל-פאול מצויד עם מערכת HPLC.
הערה: אנו הגדרת התנאים HPLC כמפורט בטבלה1.- עבור • תנאי רשות העתיקות, להשתמש הדרגתי בינארי של 5% - 50% ממס B יותר מ 7 דקות, ואז להגדיל על ידי 98% ממס B להחזיק 1 דקות ו ואז equilibrate למשך 2 דקות ב 5% ממס B בזריקה הקן.
- לשימוש • תנאי CK, שיפוע בינארי של 2% - 40% ממס B מעל 5 דקות, 40-70% ממס B ב- 7 דקות, ואז להגדיל על ידי 95% ממס B להחזיק 1 דקות, ואז equilibrate למשך 2 דקות ב 2% ממס B על ידי לקנן הזרקה.
- הגדר את יינון ספקטרומטריית electrospray (ESI)-MS פרמטרים של יון מקור כמפורט בטבלה מס ' 2.
- השתמש התגובה מרובים ניטור (MRM) המעבר על כימות של כל analyte המופיעה בטבלה 3.
- לכמת רשות העתיקות אנדוגני ורמות CK מפני עיקול רגיל של היחס בין ללא תווית התווית על-ידי דאוטריום תקנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 בשבועst , יורה adventitious לא יצרו. השבוע 2nd , הופיע נצרי קטן. את 3rd ו 4 שבועותth , המספר יורה מוגברת בעיקר באזורי הפסגה (I ו- II) (איור 2א). בשבועה 5, המספר של נצרי היה כ- 7 בתוך אזור אני 5 באזור השני (איור 2B). לעומת זאת, רק כמה נצרי נוצרו באזורים III ו- IV.
לפני תרבות, רמת רשות העתיקות היה מעט גבוה יותר באזור אני (4.1 pg/mg, טרי במשקל (FW)) מאשר באזורים II-IV (~ 2.5 pg/mg FW; איור 3). בשבועst 1, רמת רשות העתיקות גדל באופן משמעותי האזור הרביעי (11.4 pg/mg FW) וירידה מעט ב אזורים I-III (1.5-2.2 pg/mg FW). בשבוע 2nd , רמת רשות העתיקות האזור הרביעי ירד ל ~ 4.4 pg/mg FW, המציין כי הצטברות רשות העתיקות באזור הבסיס היה ארעי. בגיל 5 שבועות של תרבות הגיח הדרגתי ריכוז רשות העתיקות, עם רמות הגדלת מאזור אני האזור הרביעי.
לפני תרבות, היו רק מעקב רמות של רוב הגרביים (איור 3). בשבועst 1, רמת תצרוכת גדל 13.8 pg/mg FW באזור II, 18.1 pg/mg FW באזור השלישי. הרמות ואז ירד בהדרגה מעל 5 שבועות של תרבות. מצד שני, רמות ט ז, ה-iP וריבית השתנה רק במעט במהלך תרבות.
איור 1 : הכנה הוזמנתי למסיבה היווצרות לירות adventitious. (א) קטע internodal (8 מ מ אורך) נחתכת איפקאק מחדש על ספסל נקי. Internode (B) הראשון שימש היווצרות לירות adventitious. (ג) מקטעי מתורבתים על 25 מ ל ללא phytohormone B5 במדיום פטרי לזירוז יורה adventitious. סרגל קנה מידה = 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : חלוקת adventitious יורה בנוי על קטע internodal. (א) יורה Adventitious נוצר אחרי 0 עד 5 שבועות של תרבות. סרגל קנה מידה = 5 מ מ. (B) קטעים היו למחיצות לארבעה אזורים (I-IV), וספרתי מספר adventitious יורה בכל אזור היה בשבוע 5. הנתונים הם אמצעי ± SEM (n = 3). עשרה קטעים שימשו ניסוי. N.F. = לא נמצאו. דמות זו שונתה מ. Koike et al. 9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : הזמן-קורס ניתוח של רמות phytohormone בקטעים internodal. מקטעי הופרדו לארבעה אזורים (I-IV). אנדוגני רשות העתיקות ואת הגרביים (ט ז תצרוכת, iP, ריבית) בכל אזור היו לכמת על ידי LC-MS/MS. כי רמות ה-iP וריבית נמוכה מאוד, גרף מוגדלת הוכנס בתוך באותו התרשים. הנתונים הם אמצעי ± SEM (n = 3). מקטעי שמונה שימשו ניסוי. דמות זו שונתה מ. Koike et al. 9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| טור | רשות העתיקות: ACQUITY חוף סי18 φ2.1 × 100 1.7 מיקרומטר |
| הגרביים: Poroshell EC-סי18 φ2.1 × 50 2.7 מיקרומטר | |
| טמפרטורה | 40ºC |
| שלב ניידים | ת: ממס מזוקקים מים + 0.05% חומצה אצטית |
| הממס ב': acetonitrile + חומצה אצטית 0.05% | |
| קצב הזרימה | 0.35 ml/min |
| נפח הזרקה | 18 µl |
טבלה 1: HPLC במצב רשות העתיקות וניתוח CK.
| וילון גז (a.u.)* | 10 / 40 * * |
| התנגשות גז (a.u.)* | 5 / 3 * * |
| יון ספריי מתח (V) | 5500 |
| טמפרטורה (ºC) | 600 |
| יון מקור גז 1 (a.u.)* | 30 |
| יון מקור גז 2 (a.u.)* | 40 / 80 * * |
| רזולוציה | יחידה |
בטבלה 2: פרמטרים של יון מקור. * יחידות שרירותי. * * ניתוח ניתוח/CK רשות העתיקות. טבלה זו שונתה מ. Koike et al. 9
| רבעון 1 (מ/z) | Q3 (מ/z) | Declustering פוטנציאל (V) | הכניסה פוטנציאליים (V) | אנרגיית התנגשות (V) | |
| רשות העתיקות | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5- רשות העתיקות | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| ט ז | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5- ט ז | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| תצרוכת | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5- תצרוכת | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| ה-iP | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| ד6- iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| ריבית | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| ד6- ריבית | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
טבלה 3: מעברים MRM של רשות העתיקות ואת הגרביים בניתוח LC-MS/MS- טבלה זו שונתה מ. Koike et al. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי לזהות את ההפצה של phytohormones מעורב organogenesis, חשוב להשתמש בחומרים המפעל שבו organogenesis יכול להיות שנצפו על ללא phytohormone בינוני, כי כאשר phytohormones exogenously חלות explants להשראת יורה או שורשים, הם משפיעים על כל explant, ולכן קשה להעריך את פלסטיות הטבועה של צמחים תאית התמיינות, organogenesis. נצרי adventitious יכולה להיגרם על phytohormone ללא התקשורת תרבות מינים אחרים כגון ל' ציפורן caryophyllus 11Corrêa Aegle marmelos (ל')12, Pennell פשטה שרועה (ל')13, Celastrus paniculatus Willd. 14, Kalanchoë blossfeldiana Poelln. 15. אפשר היה ליישם את הפרוטוקול במינים אלו הצמח.
חילוץ רשות העתיקות, ט ז, תצרוכת, iP וריבית ב- acetonitrile ואנו לטהר אותם על ידי מיצוי מוצק-פאזי. השיטה המקורית משתמשת בשלושה סוגים של מחסנית עמודות (HLB, MCX ו- exchange חלש אניון (שעווה)) כי כל phytohormones הם מטוהרים (כולל gibberellins, חומצה אבציסית, חומצה יסמונית, חומצה סליצילית)16. העמודה HLB משתמשת פולימריים הפוכה-שלב sorbent, העמודה MCX משתמש זהה עם קבוצות קטיון, ומשתמש העמודה שעווה זהה עם קבוצות אניון חלש-exchange. השיטה המקורית elutes הגרביים (בסיסי) עם 60% acetonitrile המכילים אמוניה מימית על עמודת MCX בשלב השני ולאחר מכן העתיקות (חומצי) עם 80% acetonitrile המכיל 1% חומצה אצטית על עמודה שעווה בשלב האחרון. ההתמקדות שלנו היא אוקסין, הגרביים, אשר אינטראקציה באנטגוניזם לווסת את גידול הצמח17, פרוטוקול מפושטת משתמשת רק את HLB ואת MCX העמודות; רשות העתיקות eluted עם 30% acetonitrile המכיל 1% חומצה אצטית על העמודה HLB בשלב הראשון. זה לוקח יומיים של הכנת הדוגמא LC-MS/MS לניתוח.
הממס acetonitrile אסור לייבש במהלך טיהור phytohormone העמודות מחסנית. אם כן, resuspend את הדגימה ב acetonitrile כדי למנוע את phytohormones דבקה את מבחנה ואיבד מדגם. ב פרוטוקול זה, מגבלת זיהוי עם מערכת MS-מלכודת היא ~ pg 10 רשות העתיקות ואת הגרביים רקמות טריים 10-30 מ"ג. כדי לנתח כמויות קטנות יותר, זה יהיה הכרחי כדי לאסוף דגימת הרבה יותר או להשתמש MS עם רגישות גבוהה יותר.
ניתוח phytohormone הוא טכניקה חשוב על ההערכה של צמיחה והתפתחות. באמצעות שיטה זו, אולי נוכל לקבוע את העיתוי של אוקסין וטיפול CK עבור לירות adventitious-צורה מיני צמחים שבו התנאי תרבות האופטימלי הוא עדיין לא ידוע. כימות phytohormone הופך יותר ויותר חשוב, פרוטוקול LC-MS/MS המתוארות כאן יאפשר הניתוח של דוגמאות קטנות עם רגישות גבוהה ורזולוציה. שלנו פישוט של שיטה קודמת להקל על טיהור וניתוח, והבא רב-תכליתיות הפארמצבטית. בעתיד, בשיטה זו ניתן להחיל כדי לחקור את הדינמיקה של אוקסין אנדוגני, CK במהלך organogenesis של מיני צמחים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה למורקאמי אקירה מר המחלקה של החיים יישומית באוניברסיטה Toyo, מר Koudai Taniguchi של מרכז טכנולוגיה לחקלאות גאנמה לסיוע טכני שלהם אנו אסירי תודה גם פרופסור Shosaku Kashiwada של ד ר Uma Maheswari מאיה לרר, Toyo האוניברסיטה לקבלת הצעות שלהם. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי המרכז לחקר החיים, מדעי הסביבה, אוניברסיטת Toyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
- Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
