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Ipecac की ठहराव संस्कृति के दौरान अंतर्जात Auxin और सायटोकायनिन का

Published: March 15, 2018 doi: 10.3791/56902
Automatic Translation
1, 1, 1
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

Summary

आकस्मिक शूटिंग phytohormone उपचार के बिना ipecac के एक नोडल खंडों पर प्रेरित किया जा सकता है । आकस्मिक गोली गठन के दौरान phytohormone गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, हम अंतर्जात auxin और सायटोकायनिन द्वारा नोडल क्षेत्रों में मापा जाता है-ms/

Abstract

आकस्मिक गोली गठन आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण फसलों के प्रचार के लिए और ट्रांसजेनिक पौधों के उत्थान के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है । Phytohormone उपचार ज्यादातर प्रजातियों में आकस्मिक शूटिंग के प्रेरण के लिए आवश्यक है । चाहे आकस्मिक शूटिंग प्रेरित किया जा सकता है auxin और सायटोकायनिन (CK) के स्तर के बीच संतुलन द्वारा निर्धारित होता है । बहुत प्रयास एक explants के रूप में और प्रत्येक संयंत्र प्रजातियों में इस्तेमाल किया ऊतक में इष्टतम सांद्रता और phytohormones के संयोजन के निर्धारण में चला जाता है । ipecac में, तथापि, आकस्मिक शूटिंग phytohormone उपचार के बिना संस्कृति माध्यम में एक नोडल खंडों पर प्रेरित किया जा सकता है । यह सेल भेदभाव के लिए ipecac के अंतर्निहित प्लास्टिक की अनुमति देता है मूल्यांकन किया जाएगा । ipecac में आकस्मिक की शूटिंग के लिए प्रेरित करने के लिए, हम 24 डिग्री सेल्सियस के तहत 15 µmol m− 2 s− 1 प्रकाश की एक 14-h लाइट/10-h अंधेरे चक्र phytohormone-मुक्त B5 मध्यम पर 5 सप्ताह के लिए 0.2% gellan गम के साथ जम में के रूप में प्रसंस्कृत । आकस्मिक गोली मार गठन के दौरान phytohormone गतिशीलता की जांच करने के लिए, हम अंतर्जात इण्डोल-3-एसिटिक एसिड और खंडों में तरल CKs द्वारा क्रोमैटोग्राफी-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री LC-ms/ इस विधि अंतर्जात इण्डोल-3-एसिटिक एसिड और CKs स्तर के एक सरल तरीके से विश्लेषण की अनुमति देता है । यह अंय प्रजातियों के पौधे में organogenesis के दौरान अंतर्जात auxin और CK की गतिशीलता की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) "totipotency" की अवधारणा का प्रस्ताव है, जिसके द्वारा संयंत्र कोशिकाओं को विभाजित कर सकते हैं, अंतर, और फिर भी पुनर्जीवित पूरे पौधों में विशिष्ट कोशिका प्रकार में अपने पहले भेदभाव के बाद परिपक्व पौधों1। ऊतक संस्कृति में, चाहे संयंत्र पुनर्जनन या प्रेरित किया जा सकता है नहीं संयोजन और विकास के माध्यम में लागू phytohormones exogenously की एकाग्रता से निर्धारित होता है । Skoog और मिलर पाया कि आकस्मिक शूटिंग संस्कृति मध्यम पर तंबाकू घट्टा से auxins को CKs के एक उच्च अनुपात युक्त प्रेरित किया जा सकता है, जबकि आकस्मिक जड़ों मध्यम एक कम अनुपात2युक्त पर प्रेरित किया जा सकता है । कि खोज के बाद से, ऊतक संस्कृति व्यापक रूप से आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण फसलों के प्रचार के लिए और ट्रांसजेनिक संयंत्रों के उत्थान के लिए इस्तेमाल किया गया है3। आकस्मिक गोली मारता है शिखर meristem के अलावा अंय ऊतकों से प्रेरित किया जा सकता है, ऐसे पत्तियों, जड़ों के रूप में, और नोड । Phytohormone उपचार सबसे संयंत्र प्रजातियों में आकस्मिक गोली मारता है की प्रेरण के लिए आवश्यक है । हालांकि, इष्टतम सांद्रता और संयोजन प्रजातियों और explants के रूप में इस्तेमाल किया ऊतकों के बीच से अलग है । इस प्रकार, बहुत प्रयास इष्टतम सांद्रता और प्रयोगों के लिए phytohormones के संयोजन का निर्धारण करने में चला जाता है ।

Carapichea ipecacuanha (Brot.) एल Andersson (ipecac) एक औषधीय संयंत्र है कि emetine और cephaeline जैसे उपक्षारों शामिल है, मुख्य रूप से जड़ों में4। रूट निष्कर्षों एक expectorant, एक उबकाई, और एक amoebicide5के रूप में उपयोग किया जाता है । हालांकि ipecac ब्राजील के उष्णकटिबंधीय वर्षावन में स्वाभाविक रूप से बढ़ता है, यह संस्कृति में बीज सेट अनिच्छुक है, और अंकुरण की दर जापान में बीज भंडारण के दौरान कम हो जाती है, इसके ठंडा जलवायु के साथ6। इसके बजाय, यह ऊतक संस्कृति, जिसमें आकस्मिक नोड पर गोली मार गठन के द्वारा प्रचारित है सबसे कुशल विधि7,8है । दिलचस्प है, आकस्मिक गोली मारता है phytohormone उपचार के बिना इस प्रजाति में प्रेरित किया जा सकता है8।

आकस्मिक शूटिंग callusing के बिना, लेकिन बेसल क्षेत्र में नहीं है शिखर क्षेत्र में एपिडर्मिस पर गठित कर रहे है9। यह अंतर एक नोडल सेगमेंट में ऊतक ध्रुवीकरण का संकेत देता है, जो संभवत: phytohormonal विनियमन के अंतर्गत है । ipecac संस्कृति प्रणाली आकस्मिक गोली गठन के दौरान अंतर्जात phytohormone स्तर में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक अनूठा अवसर की अनुमति देता है । यहां हम एक auxin के अंतर्जात स्तर के विश्लेषण के लिए हमारी विधि का परिचय (इण्डोल-3-एसिटिक एसिड (आईएए)) और चार CKs (isopentenyl adenine (आईपी), isopentenyl adenine riboside (आईपीआर), ट्रांस-zeatin (tZ), और ट्रांस-zeatin riboside (tZR)) नियंत्रण रेखा के उपयोग के माध्यम से एक नोडल खंडों में-ms/

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Protocol

नोट: Ipecac (C. ipecacuanha) का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था क्योंकि यह अंतर्जात phytohormones के विश्लेषण की सुविधा देता है ।

1. विकास की स्थिति Ipecac के आकस्मिक गोली मारता प्रेरित करने के लिए

  1. phytohormone-नि: शुल्क B5 माध्यम तैयार 5.710पीएच के लिए समायोजित, और 0.2% gellan गम जोड़ें. autoclaving द्वारा निष्फल ।
  2. एक बाँझ पेट्री डिश में autoclaved माध्यम के 25 मिलीलीटर डालो (90 मिमी × 20 मिमी).
  3. 8 मिमी एक बाँझ एक्रिलिक प्लेट पर एक ब्लेड नंबर 22 के साथ एक शल्य स्केलपेल का उपयोग कर ipecac plantlets के नोडल क्षेत्रों में कटौती, और मध्यम पर जगह (चित्रा 1).
  4. phytohormone पर संस्कृति-नि: शुल्क B5 मध्यम पर 24 डिग्री सेल्सियस के तहत 15 µmol m− 2 s− 1 प्रकाश की एक 14-h लाइट में 10-h अंधेरे चक्र के लिए 5 सप्ताह ।
  5. प्रत्येक खंड (चित्रा 1बी) में मैं (बेसल) के लिए क्षेत्रों मैं (शिखर) की पहचान करें । एक खुर्दबीन के नीचे प्रत्येक क्षेत्र में आकस्मिक शूटिंग > 0.3 mm लंबाई की संख्या गिनती सप्ताह में एक बार ।

2. निष्कर्षण और Phytohormones की शुद्धि

  1. चार 2 मिलीलीटर नमूना ट्यूबों में से प्रत्येक में एक 5 मिमी zirconia मनका रखो ।
  2. क्षेत्र में मैं चतुर्थ (प्रत्येक 2 मिमी लंबाई में) एक बाँझ एक्रिलिक प्लेट पर एक शल्य स्केलपेल का उपयोग कर क्षेत्रों में कटौती ।
  3. अलग नमूना ट्यूबों में प्रत्येक क्षेत्र के आठ खंडों लीजिए (10-30 मिलीग्राम ताजा वजन).
  4. वजन, और फिर तरल नाइट्रोजन में नमूनों फ्रीज ।
  5. एक मनका आधारित homogenizer का उपयोग जमे हुए नमूनों क्रश ।
  6. auxin और CKs के प्रत्येक आंतरिक मानक के 500 स्नातकोत्तर युक्त 1 मिलीलीटर acetonitrile में कुचले गए नमूनों को निलंबित करना (d5-आईएए, डी5-tZ, d5-tZR, d6-iP, d6-आईपीआर) एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर ।
  7. 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो, तो कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,500 × जी पर केंद्रापसारक ।
  8. गोली धो में 80% (v/v) acetonitrile युक्त 1% (v/v) एसिटिक एसिड । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3,500 × g पर फिर से केंद्रापसारक । supernatants (कदम से 2.7 और 2.8) एक डिस्पोजेबल ग्लास ट्यूब में गठबंधन ।
  9. जोड़ें 600 µ l पानी से युक्त 1% (v/v) एसिटिक एसिड प्रत्येक संयुक्त supernatant के लिए, और acetonitrile एक निर्वात संकेंद्रक का उपयोग कर लुप्त हो जाना ।
  10. Equilibrate हाइड्रोफिलिक-lipophilic-संतुलित (HLB) कॉलम कारतूस 1 मिलीलीटर acetonitrile, मेथनॉल, और 1% (v/v) एसिटिक एसिड युक्त पानी की प्रत्येक लागू करने के द्वारा ।
  11. equilibrated HLB कारतूस प्रति एक नमूना समाधान लागू करें ।
  12. 1 मिलीलीटर पानी के साथ कारतूस धो 1% (v/वी) एसिटिक एसिड युक्त ।
  13. Elute 2 मिलीलीटर 80% के साथ सभी हार्मोन (v/v) acetonitrile युक्त 1% (v/v) एसिटिक एसिड एक ग्लास ट्यूब में ।
  14. eluate में acetonitrile के लिए 1% युक्त पानी में निकालने के लिए लुप्त हो जाना (v/v) एसिटिक एसिड एक वैक्यूम संकेंद्रक का उपयोग कर ।
    नोट: यह पूरी तरह से सूख नहीं है ।
  15. Equilibrate मिश्रित-मोड, मजबूत कटियन-विनिमय (एमसीएक्स) कॉलम कारतूस 1 मिलीलीटर acetonitrile, 1 मिलीलीटर मेथनॉल, 0.5 मिलीलीटर 0.1 मीटर एचसीएल, और 1 मिलीलीटर पानी 1% (v/v) एसिटिक एसिड युक्त लागू करके ।
  16. equilibrated एमसीएक्स कारतूस प्रति एक नमूना समाधान लागू करें ।
  17. 1 मिलीलीटर पानी के साथ कारतूस धो 1% (v/वी) एसिटिक एसिड युक्त ।
  18. Elute आईएए के साथ 2 मिलीलीटर 30% (v/v) acetonitrile युक्त 1% (v/v) एसिटिक एसिड एक ग्लास ट्यूब में ।
  19. 2 मिलीलीटर 80% (v/v) acetonitrile युक्त कारतूस धो 1% (v/v) एसिटिक एसिड ।
  20. 2 मिलीलीटर पानी और 1 मिलीलीटर पानी के साथ कारतूस धो 5% जलीय अमोनिया युक्त ।
  21. Elute 2 मिलीलीटर 60% के साथ CKs (v/v) acetonitrile एक ग्लास ट्यूब में 5% जलीय अमोनिया युक्त ।
  22. एक वैक्यूम ध्यानी का उपयोग कर प्रत्येक हार्मोन अंश के विलायक लुप्त हो जाना और − 30 ° c पर स्टोर जब तक नियंत्रण रेखा ms/

3. LC-ms/आईएए और CKs के एमएस विश्लेषण

  1. मेथनॉल के 600 µ l के साथ एक ट्यूब में प्रत्येक हार्मोन निकालने भंग और एक पेंच गर्दन कुल वसूली शीशी के लिए समाधान हस्तांतरण. एक वैक्यूम ध्यानी का उपयोग विलायक लुप्त हो जाना ।
  2. 20 µ एल 30% (v/v) acetonitrile में आईएए अंश भंग, और 20 µ एल पानी में CK अंश 1% (v/v) पेंच गर्दन कुल वसूली शीशियों में एसिटिक एसिड युक्त ।
  3. एक ट्रिपल-quadrupole एमएस प्रणाली एक HPLC प्रणाली से सुसज्जित पर सकारात्मक आयन मोड में नमूनों का विश्लेषण ।
    नोट: हम तालिका 1में सूचीबद्ध HPLC शर्तों को सेट करते हैं ।
    1. आईएए रेफरेंस के लिए, 5%-50% विलायक b के 7 मिनट पर बाइनरी ग्रैडिएंट का उपयोग करें, फिर 98% विलायक बी द्वारा वृद्धि और 1 मिनट के लिए पकड़, और फिर नेस्ट इंजेक्शन द्वारा 5% विलायक बी में 2 मिनट के लिए equilibrate ।
    2. CK रेफरेंस के लिए, 2% की बाइनरी ढाल का उपयोग करें-40% विलायक बी ओवर 5 मिनट, 40%-70% विलायक बी 7 मिनट में, तो 95% विलायक बी द्वारा वृद्धि और 1 मिनट के लिए पकड़, और फिर 2% पर 2 मिनट के लिए equilibrate नेस्ट इंजेक्शन द्वारा विलायक बी ।
    3. सेट electrospray ionization (ईएसआई)-आयन स्रोत के एमएस पैरामीटर के रूप में तालिका 2में सूचीबद्ध ।
  4. तालिका 3में सूचीबद्ध प्रत्येक analyte के ठहराव के लिए एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी (MRM) संक्रमण का उपयोग करें ।
  5. ड्यूटेरियम-लेबल मानकों के लिए unअंतर्जात के अनुपात के एक मानक वक्र के खिलाफ आईएए और CK स्तर को बढ़ाता है ।

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Representative Results

1सेंट सप्ताह में, कोई आकस्मिक शूटिंग का गठन किया था । 2nd सप्ताह में, छोटे शूट दिखाई दिया । 3rd और 4वें सप्ताह में, शूटिंग की संख्या ज्यादातर शिखर क्षेत्रों में वृद्धि हुई है (मैं और द्वितीय) (चित्रा 2ए) । 5वें सप्ताह में, शूटिंग की संख्या क्षेत्र में लगभग 7 था मैं और क्षेत्र द्वितीय में 5 (चित्रा 2बी) । इसके विपरीत, केवल कुछ शूटिंग क्षेत्रों III और चतुर्थ में गठन किया गया ।

संस्कृति से पहले, आईएए स्तर क्षेत्र में थोड़ा अधिक था मैं (4.1 स्नातकोत्तर/mg, ताजा वजन (अग्रेषित करें)) क्षेत्रों में द्वितीय-IV (~ 2.5 pg/ चित्र 3) । 1सेंट सप्ताह में, आईएए स्तर क्षेत्र चतुर्थ (11.4 स्नातकोत्तर/एमजी परिवार में बहुत बढ़ गया) और क्षेत्रों में थोड़ा कमी आई-III (1.5-2.2 स्नातकोत्तर/ 2एन डी सप्ताह में, क्षेत्र चतुर्थ में आईएए स्तर में कमी आई ~ 4.4 स्नातकोत्तर/एमजी परिवार कल्याण, यह दर्शाता है कि बेसल क्षेत्र में आईएए संचय क्षणिक था । संस्कृति के 5 हफ्तों के द्वारा, एक आईएए एकाग्रता ढाल उभरा, स्तर क्षेत्र से मैं चतुर्थ क्षेत्र में वृद्धि के साथ ।

संस्कृति से पहले, वहां केवल सबसे CKs के स्तर का पता लगाने थे (चित्रा 3) । 1सेंट सप्ताह में, tZR स्तर क्षेत्र द्वितीय में 13.8 स्नातकोत्तर/एमजी परिवार कल्याण के लिए वृद्धि हुई है और 18.1 स्नातकोत्तर/ स्तर तो संस्कृति के 5 सप्ताह से अधिक धीरे-धीरे कमी आई । दूसरी ओर, tZ, iP के स्तर, और आईपीआर संस्कृति के दौरान ही थोड़ा बदल गया ।

Figure 1
चित्र 1 : आकस्मिक शूट के गठन के लिए ipecac की तैयारी । (a) एक नोडल सेगमेंट (8 mm long) एक क्लीन बेंच पर पुनर्जीवित ipecac से कट जाता है । (B) प्रथम नोड का उपयोग आकस्मिक शूट के गठन के लिए किया गया था । (ग) सेगमेंट में आकस्मिक शूट को प्रेरित करने के लिए पेट्री व्यंजन में 25 मिलीलीटर phytohormone-मुक्त B5 मध्यम पर कल्चरित किया जाता है । स्केल बार = 1 सेमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : एक नोडल सेगमेंट पर गठित आकस्मिक शूट का वितरण. (क) आकस्मिक शूटिंग के बाद 0 से 5 सप्ताह संस्कृति का गठन । स्केल बार = 5 मिमी. (B) खंडों को चार क्षेत्रों (I-IV) में विभाजित किया गया था, और प्रत्येक क्षेत्र में आकस्मिक डालियों की संख्या 5 सप्ताह में गिनी जाती थी । डेटा का अर्थ है ± SEM (n = 3) । प्रत्येक प्रयोग में दस खंडों का प्रयोग किया गया । N.F. = नहीं मिला । यह आंकड़ा Koike एट अल से संशोधित किया गया है । 9 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 :-नोडल सेगमेंट में phytohormone स्तरों का समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण. खंडों को चार क्षेत्रों (I-IV) में विभाजित किया गया । अंतर्जात आईएए और CKs (tZ, tZR, आईपी, और आईपीआर) प्रत्येक क्षेत्र में quantified द्वारा LC-ms/ क्योंकि आईपी और आईपीआर का स्तर बहुत कम थे, एक ज़ूम ग्राफ एक ही ग्राफ के अंदर डाला गया था । डेटा का अर्थ है ± SEM (n = 3) । प्रत्येक प्रयोग में आठ खंडों का उपयोग किया गया । यह आंकड़ा Koike एट अल से संशोधित किया गया है । 9 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

स्तंभ आईएए: ACQUITY बेह C18 φ 2.1 × 100 1.7 µm
CKs: Poroshell ईसी-C18 φ 2.1 × 50 2.7 µm
तापमान 40 º c
मोबाइल फेज विलायक एक: आसुत जल + 0.05% एसिटिक एसिड
विलायक बी: acetonitrile + 0.05% एसिटिक एसिड
प्रवाह दर 0.35 मिलीलीटर/
इंजेक्शन की मात्रा 18 µ l

तालिका 1: आईएए और CK विश्लेषण में HPLC स्थिति ।

पर्दा गैस (a.u.) * 10/40 * *
टक्कर गैस (a.u.) * 5/3 * *
आयन स्प्रे वोल्टेज (वी) 5500
तापमान (º c) ६००
आयन स्रोत गैस 1 (a.u.) * 30
आयन स्रोत गैस 2 (a.u.) * 40/80 * *
संकल्प इकाई

तालिका 2: आयन स्रोत के मापदंडों । * मनमानी इकाइयां । * * आईएए विश्लेषण/ इस टेबल को Koike एट अल से संशोधित किया गया है । 9

Q1 (m/ Q3 (m/z) संभावित (V) क्लस्टरिंग प्रवेश क्षमता (V) टक्कर ऊर्जा (V)
आईएए 176 130 26 6.5 21
d5-आईएए 181 134 36 4.0 23
tz 220 136 36 5.0 23
d5-tZ 225 137 31 5.0 21
tZR 352 220 41 5.5 23
d5-tZR 357 225 51 5.0 21
ip 204 136 31 9.0 19
डी6-iP 210 137 31 5.5 21
आईपीआर 336 204 31 5.0 21
डी6-आईपीआर 342 210 36 5.5 21

तालिका 3: आईएए और CKs के MRM संक्रमणों में नियंत्रण रेखा-ms/एमएस विश्लेषण । इस टेबल को Koike एट अल से संशोधित किया गया है । 9

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Discussion

organogenesis में शामिल phytohormones के वितरण की पहचान करने के लिए, पादप सामग्रियों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जिसमें organogenesis को phytohormone-मुक्त माध्यम पर मनाया जा सकता है, क्योंकि जब phytohormones उत्प्रेरण के लिए exogenously के लिए explants लागू किया जाता है गोली मारता है या जड़ें, वे पूरे explant को प्रभावित, यह मुश्किल सेल भेदभाव और organogenesis में पौधों की अंतर्निहित प्लास्टिक का मूल्यांकन करने के लिए बना । आकस्मिक शूटिंग phytohormone-मुक्त संस्कृति मीडिया पर प्रेरित किया जा सकता है जैसे कि Dianthus caryophyllus l.11, Aegle marmelos (एल.) Corrêa12, Bacopa monnieri (एल.) Pennell13, Celastrus paniculatus होगा । 14, व Kalanchoë blossfeldiana Poelln. 15. इन पादप प्रजातियों में प्रोटोकॉल लागू करना संभव होगा ।

हम acetonitrile में आईएए, tZ, tZR, आईपी, और आईपीआर निकाले और ठोस चरण निष्कर्षण द्वारा उंहें शुद्ध । मूल विधि कारतूस कॉलम के तीन प्रकार (HLB, एमसीएक्स, और कमजोर आयनों एक्सचेंज (मोम) का उपयोग करता है) क्योंकि सभी phytohormones (gibberellins, abscisic एसिड, jasmonic एसिड, और चिरायता एसिड सहित) शुद्ध कर रहे है16। HLB स्तंभ एक पॉलिमर रिवर्स चरण sorbent का उपयोग करता है, एमसीएक्स स्तंभ कटियन-विनिमय समूहों के साथ एक ही उपयोग करता है, और मोम स्तंभ कमजोर आयनों के साथ ही उपयोग करता है-विनिमय समूहों. मूल विधि elutes CKs (बेसिक) के साथ 60% acetonitrile दूसरे चरण में एक एमसीएक्स कॉलम पर जलीय अमोनिया युक्त, और फिर 80% acetonitrile के साथ आईएए (अम्लीय) पिछले चरण में एक मोम स्तंभ पर 1% एसिटिक एसिड युक्त. जैसा कि हमारा ध्यान auxin और CKs है, जो संयंत्र वृद्धि को विनियमित करने के लिए antagonistically को17आदान प्रदान करते हैं, सरलीकृत प्रोटोकॉल केवल HLB और एमसीएक्स के स्तंभों का उपयोग करता है; आईएए 30% acetonitrile के साथ eluted है जिसमें पहले चरण में HLB कॉलम पर 1% एसिटिक एसिड होता है । यह नमूना तैयारी से नियंत्रण रेखा से दो दिन लगते है एमएस/

acetonitrile विलायक कारतूस कॉलम में phytohormone शुद्धि के दौरान बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए । यदि यह करता है, acetonitrile में नमूना reसस्पेंड करने के लिए कांच ट्यूब अटक बनने से phytohormones को रोकने के लिए और नमूने से खो दिया है । इस प्रोटोकॉल में, आयन के साथ पता लगाने की सीमा-जाल एमएस सिस्टम है ~ 10 आईएए और CKs के लिए 10-30 मिलीग्राम ताजा ऊतकों से स्नातकोत्तर । छोटी मात्रा का विश्लेषण करने के लिए, यह बहुत अधिक नमूना इकट्ठा करने के लिए या उच्च संवेदनशीलता के साथ एमएस का उपयोग करने के लिए आवश्यक होगा ।

Phytohormone विश्लेषण संयंत्र के विकास और विकास के मूल्यांकन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है । इस विधि का प्रयोग, हम संयंत्र प्रजातियों में जहां इष्टतम संस्कृति हालत अभी भी अज्ञात है आकस्मिक गोली मार गठन के लिए auxin और CK उपचार के समय का निर्धारण करने में सक्षम हो सकता है । के रूप में phytohormone ठहराव तेजी से महत्वपूर्ण हो जाता है, नियंत्रण रेखा ms/एमएस प्रोटोकॉल यहां वर्णित उच्च संवेदनशीलता और संकल्प के साथ छोटे नमूनों के विश्लेषण में सक्षम हो जाएगा । हमारे एक पिछले विधि के सरलीकरण शुद्धि और विश्लेषण की सुविधा होगी, और उच्च बहुमुखी प्रतिभा और reproducibility लाने के लिए । भविष्य में, इस विधि अंतर्जात auxin की गतिशीलता की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है और organogenesis के दौरान अन्य प्रजातियों के पौधों में CK.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

हम एप्लाइड Toyo विभाग के श्री अकीरा मुराकामी के लिए आभारी हैं, और उनकी तकनीकी सहायता के लिए Gunma कृषि प्रौद्योगिकी केंद्र के श्री Koudai तानिगुची के. हम उनके सुझावों के लिए प्रोफेसर Shosaku Kashiwada और डॉ उमा Maheswari राजगोपालन, Toyo विश्वविद्यालय के भी आभारी हैं । इस अध्ययन के भाग में जीवन और पर्यावरण विज्ञान, Toyo विश्वविद्यालय के लिए अनुसंधान केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[2H5]indole-3-acetic acid Olchemlm Ltd 031 1531 Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin Olchemlm Ltd 030 0301 Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin riboside Olchemlm Ltd 030 0311 Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenine Olchemlm Ltd 030 0161 Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenosine Olchemlm Ltd 030 0171 Internal standard for LC-MS/MS
indole-3-acetic acid Wako 098 00181 standard for LC-MS/MS
trans-zeatin SIGMA-ALDRICH Z0876 5MG standard for LC-MS/MS
trans-zeatin riboside Wako 262 01081 standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenine SIGMA-ALDRICH D7674 1G standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenosine ACROS ORGANICS 22648 1000 standard for LC-MS/MS
acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv MERCK 1.00029.1000 solvent for LC-MS/MS
Water for chromatography LiChrosolv MERCK 1.15333.1000 solvent for LC-MS/MS
HPLC SHIMADZU Prominence
MS Sciex 3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 cc Waters WAT094225 cartridge column
Oasis MCX 30 mg/1 cc Waters 186000252 cartridge column
screw neck total recovery vial Waters 186002805
blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum Waters 186000274
Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm Waters 186002350 UPLC column
Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm Agilent 699775-902 UPLC column
Digital microscope Leica DHS1000
TissueLyser II QIAGEN 85300
Surgical blade Feather No. 22
Scalpel handle Feather No. 4
Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap Thermo Fisher Scientific SPD111/RVT4104 vacuum concentrartor
Disposable glass tobe (13x100 mm) IWAKI 9832-1310
Sterile petri dish INA OPTICA I-90-20

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 133 आकस्मिक शूट auxin Carapichea ipecacuanha सायटोकायनिन LC-ms/ms phytohormone-मुक्त माध्यम संयंत्र पुनर्जनन
Ipecac की ठहराव संस्कृति के दौरान अंतर्जात Auxin और सायटोकायनिन का
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Koike, I., Shimomura, K., Umehara,… More

Koike, I., Shimomura, K., Umehara, M. Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac. J. Vis. Exp. (133), e56902, doi:10.3791/56902 (2018).

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