Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erhöhung der Chimäre Produktion ohne den Einsatz von neuen Geräten. Eine einfache Orientierung Änderung des Embryos zur Injektion kann erhöhen Sie die Anzahl der erzeugten Embryonen und potenziell reduzieren die Timeline Germline Übertragung.
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Methodenartikel
Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In dem Bemühen zur Steigerung der Effizienz bei der Erstellung von genetisch veränderten Mäusen über ES Zelle Methoden präsentieren wir Ihnen eine Anpassung an das aktuelle Protokoll der Blastozyste-Injektion. Hier berichten wir, dass eine einfache Drehung des Embryo und Injektion durch Trans-innere Zellmasse (TICM) der Anteil der chimeric Mäuse von 31 % bis 50 %, ohne zusätzliche Ausrüstung stieg oder Ausbildung weiter spezialisiert. 26 verschiedene Inzucht Klone und 35 insgesamt Klone wurden über einen Zeitraum von 9 Monaten injiziert. Es gab keinen signifikanten Unterschied in Schwangerschaftsrate oder Verwertungsquote von Embryonen zwischen traditionellen Injektionstechniken und TICM. Daher kann ohne jede große Veränderung in der Einspritzvorgang und eine einfache Positionierung der Blastozyste und Injektion durch das ICM, Freisetzung von ES-Zellen in den blastocöl Hohlraum möglicherweise die Menge der Chimären Produktion und anschließende verbessern Germline Übertragung.
Einleitung
Die Schaffung von genetisch gezielte Mäusen ist seit fast 25 Jahren ein langsamer Prozess, oft durch einen Engpass im Blastozysten ES Zell Mikroinjektion-Stadium für die Generation der Keimbahn Übertragung von Chimären behindert. Neue Zuführungen, darunter CRISPR/Cas91,2 targeting in ES-Zellen und Hochdurchsatz-ES Handy-Generation Konsortien wie KOMP, haben die Generation/Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten ES-Zellen verbessert. Die Generation der Keimbahn Chimären bleibt jedoch einen Engpass bei der Schaffung von genetisch veränderter Mäusen aus diesen ES Zellen3,
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Protokoll
Alle Arbeiten erfolgten im Rahmen des normalen Betriebs des NIEHS Knock Out Maus Core Facility. Alle Mäuse blieben auf einem 12:12 h Licht: Dunkel-Zyklus, und waren eine Diät von NIH-31 und Wasser ernähren ad libitum. Alle Versuche wurden im Einklang mit der Animal Care und Gebrauch von dem National Institute of Environmental Health Sciences durchgeführt.
(1) tierische Vorbereitung
- Züchten Spender Mäuse, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j weiblichen Mäusen bei 8-10 Wochen alt natürlich bis B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j männliche Mäuse zwischen 8 und 26 Wochen alt. Sichtkontrolle Stecker am nächsten Morgen (E0.5).
- Züchten Sie Empfä....
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Ergebnisse
Zell-Linie als des random-Effekts zu behandeln, wurde ein lineares Modell gemischte Effekte verwendet, zum Analysieren der Daten in der Software (z.B. SAS (Version 9.2)). Jede Analyse für die Anzahl der übertragenen Embryonen und die Zell-Linie gesteuert. Die zweite Analyse auch für die Anzahl der Welpen, die überlebt gesteuert.
Für diese Studie jedes ES Zelllinie und Klon wurde sowohl mit traditionellen injiziert und TICM Techn.......
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Diskussion
Es hat lange gedacht, dass jede Störung des ICM aktuellen Blastozyste Mikroinjektion Protokolle warnen noch dieser12,13zur Sterblichkeit, in der Tat führen könnte. Was wir hier gezeigt haben ist, die Mikroinjektion durch das ICM ist nicht schädlich für den Embryo und erhöht den Ertrag der Chimären.
Der genaue Mechanismus für diesen Effekt wurde nicht festgestellt. Allerdings sollte die mechanische Beeinträchtigung der ICM und der begle.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von der intramuralen Forschungsprogramm des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences [teilweise] unterstützt. Besonderen Dank an Shyamal Peddada für statistische Analysen. Wir wünschen auch Humphrey Yao, Gary Vogel und Yuki Arao zur Überprüfung dieser Handschrift, und Franco DeMayo für seine anhaltende Unterstützung und Beratung bedanken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ES Cell Injektionsnadel | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET Gerät | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | Lose sollten einzeln auf ES Cell Kompatibilität getestet werden. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Mikromanipulator | Leica | Mikromanipulator | |
| Mikroinjektor | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Mikroskop | Leica | DM IRB | |
| 4 Well-Schüssel | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm Schüssel | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Schweizer Webster-Mäuse | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injektionsschale | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
Referenzen
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W.
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Nachdrucke und Genehmigungen
