Imaging netzhautgewebe kann einzellige Informationen liefern, die von den traditionellen biochemischen Methoden gesammelt werden kann nicht. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Netzhaut Scheiben von Zebrafisch für die konfokale Bildgebung. Fluoreszierende genetisch codierten Sensoren oder indikatorfarbstoffen erlaubt Visualisierung von zahlreichen biologischen Prozessen in verschiedenen retinalen Zelltypen.
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Methodenartikel
Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Netzhaut ist ein komplexes Gewebe, die initiiert und die ersten Schritte der Vision integriert. Funktionsstörung des retinalen Zellen ist ein Markenzeichen von vielen blendenden Krankheiten, und zukünftige Therapien abhängen, wie verschiedene Retinal grundlegende Verständnis, dass Zellen normal zu funktionieren. Gewinnung solcher Informationen mit biochemischen Methoden hat schwierig erwiesen, da Beiträge von bestimmten Zelltypen in der Netzhaut Zellmilieu vermindert werden. Live retinale Bildgebung bieten einen Überblick über zahlreiche biologische Prozesse auf subzellulärer Ebene, dank einer wachsenden Zahl von genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren. Jedoch wurde diese Technik bisher beschränkt, Kaulquappen und zebrafischlarven, die äußersten Netzhaut Schichten der isolierten Netzhaut oder niedriger Auflösung Bildgebung der Netzhaut mit lebenden Tieren. Hier präsentieren wir eine Methode zur Erzeugung von live ex Vivo retinalen Scheiben aus Erwachsenen Zebrafisch für live Imaging über konfokalen Mikroskopie. Dieses Präparat liefert Quere Scheiben mit allen Schichten der Netzhaut und die meisten Zelltypen sichtbar für die Durchführung von konfokalen bildgebender Untersuchungen mit Perfusion. Transgene Zebrafisch mit dem Ausdruck ihrer fluoreszierende Proteine oder Biosensoren in bestimmten retinalen Zelltypen oder Organellen sind einzellige Informationsextraktion aus eine intakte Netzhaut verwendet. Darüber hinaus können retinale Scheiben mit fluoreszierenden indikatorfarbstoffen, die Methode Vielseitigkeit hinzu geladen werden. Dieses Protokoll wurde entwickelt für imaging Ca2 + im Zebrafisch-Zapfen-Photorezeptoren, aber mit richtigen Marker könnte es um Ca2 + oder Metaboliten in Müller-Zellen, bipolar und horizontalen Zellen, Mikroglia, amakrinen Zellen oder Retinal Messen angepasst werden Ganglienzellen. Das retinale Pigmentepithel wird aus Scheiben entfernt, so ist diese Methode nicht geeignet für das Studium dieser Zelltyp. Mit etwas Übung ist es möglich, seriellen Scheiben von einem Tier für mehrere Experimente zu generieren. Diese anpassungsfähige Technik ist ein leistungsstarkes Tool für die Beantwortung vieler Fragen über retinale Zellbiologie, Ca2 +und Energie-Homöostase.
Einleitung
Der Zebrabärbling (Danio Rerio) hat in medizinischen und grundlegende wissenschaftliche Forschung1, aufgrund seiner geringen Größe, schnelle Entwicklung und vertebrate Organsysteme verbreitet werden. Die natürliche Transparenz des zebrafischlarven in Kombination mit bewährten Methoden für die Transgenese konnten detaillierte Visualisierung zellulärer Prozesse in ein lebendes Tier. Eine Reihe von genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren haben spezifische Zebrafisch Zellen zur Erkennung von Ca2 + 2, Wasserstoffperoxid3, apoptotischen Aktivierung4 un....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden von der University of Washington institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Vorbereitung der Tiere und Ausrüstung
Hinweis: Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist ein dunkles Blatt von der Außenseite der Netzhaut deren Pigmentierung kann Netzhaut Funktionen zu verschleiern und schädigen das Gewebe beim konfokale Ex Vivoimaging umgebende Gewebe. Bei Dunkelheit wird die RPE Zebrafisch Weg von der Netzhaut zurückgezogen; Dunkelheit anzupassen Fisch, zukünftige Entfernung des RPE von der Netzhaut vor dem Aufschneiden und Bildgebung zu erleichtern.
- Übertragen ....
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Ergebnisse
Stabile Positionierung und transversale Ausrichtung der Scheiben sind Schlüssel für erfolgreiche Bildbearbeitung mit Injektion oder Perfusion pharmakologischer Substanzen. Sorgfältig prüfen Sie und positionieren Sie Scheiben vor konfokale Bildgebung zu, wie notwendig, um sicherzustellen, dass alle Schichten der Netzhaut sind sichtbar (Abbildung 2A, Teil Ii). Wenn eine Scheibe gedreht wird leicht nach vorne (Abb. 2A, Slice-Iii), B.......
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Diskussion
Ex-Vivo Bildgebung frische Zebrafisch retinalen Scheiben erweist sich ein vielseitiges Werkzeug für das Studium Photorezeptor Biologie20,21,22und ist einzigartig, da es ermöglicht Analyse einzelner Zellen in eine Reife, voll differenzierte Netzhaut. Mit etwas Übung ist es möglich, mehrere Experimente mit Gewebe von Fischen, auch mit seriellen Scheiben aus dem gleichen Teil der Netzhaut. Zusätzlich zu den Herausforderung.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken Ralph Nelson und Daniel Possin für durchdachte Beratung bei der Entwicklung dieses Protokoll, und Eva Ma Ashley und George Gail Stanton zur Erzeugung von stabilen transgenen Zebrafisch-Linien. Die Arbeit wurde unterstützt durch NSF GRFP 2013158531, M.G., NIH NEI 5T32EY007031, W.C. und M.G. und EY026020, j.h. und S.B.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zebrafisch | University of Washington South Lake Union Aquatics Facility | Bestände werden als stabile transgene Linien im eigenen Haus aufbewahrt | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-090-843 | für Vaseline Spritze |
| 3-mL Slip Tip Spritze | Fisher Scientific | 14-823-436 | für Vaseline |
| Spritze 20g 3,8 cm Slip Tip | Nadel Fisher Scientific | 14-826-5B | für Vaseline Spritze |
| glatt 7 cm x 2,5 cm Objektträger | Fisher Scientific | 12-550-A3 | für Augenmuscheldissektion, Schnittkammer |
| Seche Vite Klarlack | Amazon | B00150LT40 | für Schnittkammer |
| 18 mm x 18 mm #1 Glasdeckgläser | Fisher Scientific | 12-542A | für bildgebende Leitern |
| geschmacksneutrales Zahnwachs | Amazon | B01K8WNL5A | für die Bildgebung von Leitern |
| mit doppelschneidiger Rasierklinge | Stoelting | 51427 | für das Schneiden |
| von Gewebeschneidemaschinen mit digitalem Mikrometer | Stoelting | 51415 | Schneiden von Geweben |
| - weiß gerasterte Mischzellulose, 13 mm Durchmesser, 0,45 &; Mikro; m Porengröße | EMD Millipore | HAWG01300 | Filterpapier zur Befestigung von Netzhäuten |
| 10 cm Petrischale | Fisher Scientific | FB0875712 | für Fischeuthanasie, Sezier, Bildgebung Leitermontage |
| 15 cm Applikatorstift aus Holz mit glatter Spitze | Fisher Scientific | 23-400-112 | für Drahtösen-Schlaufenwerkzeug |
| 30 g (0,25 mm Durchmesser) Wolframdraht | Fisher | Scientific AA10408G6 | für Drahtaugenschlaufenwerkzeug |
| D-Glukose | Sigma Aldrich | G8270 | Bestandteil der Nahrungsergänzungsmittel-Stammlösung |
| Natrium-L-Lactat | Sigma Aldrich | L7022 | Bestandteil der Nahrungsergänzungsmittel-Stammlösung |
| Natriumpyruvat | Sigma Aldrich | P2256 | Bestandteil der Nahrungsergänzungsmittel-Stammlösung |
| L-Glutamin | Sigma Aldrich | G3126 | Bestandteil der Nahrungsergänzungsmittel-Stammlösung |
| L-Glutathion, reduziert | Sigma Aldrich | G4251 | Bestandteil der Ergänzungsstoff-Stammlösung |
| L-Ascorbinsäure | Sigma Aldrich | A5960 | Bestandteil der Ergänzungs-Stammlösung |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Bestandteil der Ringer-Lösung |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | Bestandteil der Ringer-Lösung |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | Komponente der Ringer-Lösung |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | Komponente der Ringer-Lösung |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | Komponente der Ringer-Lösung |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Komponente der Ringer-Lösung |
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | Komponente aus Na+-frei Ringer-Lösung |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | Komponente aus Na+up-frei Ringer-Lösung |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | Bestandteil der Na+-freien Ringer-Lösung |
| 50 mL konisches Zentrifugenröhrchen | Denville Scientific | C1062-P | Behälter für Ringer-Lösung |
| Vannas Schere - 8 cm, abgewinkelte 5 mm Klingen | World Precision Instruments | 501790 | Mikroschere für die Augenmuschel-Dissektion |
| Schweizer Pinzette - #5, 11 cm, gerade, 0,06 x 0,07 mm Spitzen | World Precision Instruments | 504510 | Feine Pinzette zum Diszieren und Schneiden von Scheiben |
| Einschneidige | Rasierklingen Fisher Scientific | 12-640 | zum Dissektion und Trimmen der Augenmuschel Filterpapier |
| EMD Millipore Filterzange | Fisher Scientific | XX6200006P | Flachzange für das Handling von nassem Filterpapier |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | färbt lebende Zellkerne; Inkubieren 5 & Mikro; g/mL für 15 min bei Raumtemperatur |
| Propidiumiodid (PI) | Fisher Scientific | P3566 | färbt tote Zellkerne; inkubieren 5 & Mikro; g/mL für 20 min bei Raumtemperatur |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | färbt lebende Zellkerne; inkubiert 5 & Mikro; g/mL für 20 min bei Raumtemperatur |
| Tetramethylrhodamin, Methylester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | färbt funktionelle, negativ geladene Mitochondrien; inkubiert 1 nM für 30 min bei Raumtemperatur |
| Gewebeperfusionskammer | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | Bildgebungskammer für Injektion oder Perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Desoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluoreszierendes Glukoseanalogon, das Zebrafischen 30 Minuten vor der Euthanasie oral verabreicht |
| Konfokalmikroskop Olympus Laserscanning Konfokalmikroskop | Olympus | FV1000 | zur Visualisierung der Fluoreszenz von Schnitten mit Einzelzellauflösung |
| Carbonylcyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimentelles Reagenz, das die mitochondriale Atmung abliert; Schneiden bis zu einer Endkonzentration von 1 & Mikro behandeln; M |
| Miniatur-Aspirator-Positionierer | Cell MicroControls | FL-1 | für Perfusions-Perfusionsverteiler |
| , Gas-Bubbler-Verteiler, Durchflussventil, 60cc Spritzenhalter | Warner Instruments | diverse | für Perfusion |
Referenzen
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797(2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T.
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Nachdrucke und Genehmigungen
