Methodenartikel
In diesem Protokoll wird Baculovirus von Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid in Sf9 Zellen produziert und verstärkt in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR. Der Überstand wird durch Heparin Affinitätschromatographie gereinigt und weiter durch Ultrazentrifugation konzentriert. Dieses Protokoll eignet sich für die Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gen-Therapie Anwendung.
Baculovirus wurde traditionell für die Produktion von rekombinanten Proteinen und Impfstoff eingesetzt worden. Allerdings ist vor kurzem Baculovirus als vielversprechende Vektor für Gen-Therapie-Anwendung entstehen. Hier entsteht Baculovirus durch Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid DNA (Bacmid) in einer haftfesten Kultur Sf9 Zellen. Baculovirus wird anschließend in Sf9 Zellen in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR erweitert, bis das gewünschte Volumen erreicht ist. Es wird dann von der Kultur überstand mit Heparin Affinitätschromatographie gereinigt. Virus Überstand wird auf die Heparin-Spalte die Baculovirus Partikel im überstand aufgrund der Affinität von Heparin bindet, denn Baculovirus Glykoprotein umhüllen geladen. Die Spalte wird gewaschen, mit einem Puffer um Verunreinigungen zu entfernen und Baculovirus ist aus der Spalte mit einem hohem Salzgehalt Puffer eluiert. Das Eluat wird verdünnt, um eine isotonische Salzkonzentration und Baculovirus Partikel sind weitere Verwendung Ultrazentrifugation konzentriert. Mit dieser Methode können Baculovirus bis zu 500-fold mit einer 25 % Erholung der infektiöse Partikel konzentriert werden. Obwohl das hier beschriebene Protokoll die Herstellung und Reinigung von der Baculovirus aus Kulturen bis zu 1 L zeigt, die Methode kann in ein geschlossenes System SUSPENSIONSKULTUR, klinische Grade Vektor für Gen-Therapie-Anwendung zu produzieren Aufstockung werden.
Baculovirus dient in erster Linie für die Produktion von rekombinanten Proteinen und Impfstoffe in Lepidopteran Spodoptera Fugiperda (Sf) 9 Insektenzellen mittels rekombinanter Autographa Californica multicapsid nuklearen Polyhedrosis Virus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. vor kurzem, es erweist sich als eine vielversprechende Vektor für Gen-Therapie Anwendung5. Es ist bekannt, dass eine breite Host und Gewebe Tropismus, Ruhestrom und wuchernde Zellen infiziert ist apathogen und integriert nicht in die Host-C....
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Siehe Abbildung 1 zur Veranschaulichung einer Zusammenfassung des Protokolls.
1. Reinigung des Baculovirus Plasmid DNA
2. Herste....
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Das Protokoll dargestellt ist in einem Flussdiagramm (Abbildung 1). Schritte umfassen die Transiente Transfektion von Sf9 Zellen mit Bacmid DNA Baculovirus anhaftende Kultur in einer Platte, die spätere Verstärkung in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR, Nuklease Behandlung und Klärung durch Zentrifugation und Filtration herstellen, und die Reinigung mit der Heparin-Affinitätschromatographie gefolgt von Konzentration mit Ultrazentrifugation.
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Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die Herstellung von Baculovirus in Sf9 Zellen in SUSPENSIONSKULTUR und Reinigung des Baculovirus mit einem Heparin-Affinitätschromatographie. Die Parameter, die in diesem Protokoll verwendeten den Ertrag maximieren und minimieren die Inaktivierung von infektiösen Baculovirus. Das Protokoll zur Verfügung gestellt hier zeigt, dass eine deutlich verbesserte Regeneration Baculovirus Teilchen im Vergleich zu Rückforderungen von anderen9erreicht.
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Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.
Diese Arbeit wird teilweise unterstützt durch die Anschubfinanzierung von Cincinnati Children Research Foundation (CCRF) M.N und Innovative Core Grant (ICG) unterstützt durch die nationale Mitte für voran Translational Wissenschaft von den National Institutes of Health unter Award Nr. UL1 TR001425. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Akta Avant 150 | GE | Healthcare 28976337 | Chromatographie-System |
| POROS Heparin 50 & micro; m Säule | ThermoFisher | Scientific 4333414 | Heparinsäule |
| Ultrazentrifuge | Beckman-Coulter | Nicht-Katalogartikel | Konzentriert Viren bei hoher Geschwindigkeit |
| Polyallomer Ultrazentrifugenröhrchen | Beckman-Coulter | 326823 | Konzentriert Viren bei hoher Geschwindigkeit |
| MaxQ 8000 Orbitalschüttler Inkubator | ThermoFisher Scientific | Non-Katalog-Artikel | Schüttler für Suspensionskultur |
| 250 mL Erlenmeyerkolben | ThermoFisher Scientific | 238071 | Kolben für Suspensionskultur |
| 1 L Erlenmeyerkolben | ThermoFisher Scientific | 238072 | Kolben für Suspensionskultur |
| Mikroskop (Olympus CKX41) | Olympus | Nicht-Katalogartikel | Zellüberwachung und -zählung |
| Tischzentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Zur Klärung von Baculovirus-Überständen |
| 50 ml Konisches Röhrchen | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | Zur Entnahme von Baculovirus-Überständen |
| 6-Well-Platte | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Mit Gewebekulturen behandelte Platte |
| 10-cm-Platte | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Mit Gewebekulturen behandelte Platte |
| Stericup-HV, 0,45 &Mikro; m, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtrationseinheit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-zu-Bac Vektor Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus-Expressionssystem |
| DH10B-T1R Kompetente Zelle | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Kompetente Zelle für Bacmid |
| TE-Puffer | Inhouse-Fremdkatalogartikel | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0. | |
| Plasmid Maxiprep Kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | Für die Bacmidreinigung |
| Sf9 Zellen | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insektenzellen |
| Grace' s Insekten-Zellkulturmedium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfektionsmedium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Waschen von Zellen, Verdünnen von Proben |
| HyClone SFX-Insekten-Zellmedien | GE Healthcare | SH30278.02 | Serumfreies Insektenzell-Wachstumsmedium |
| Benzonase Nuklease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzym zum Abbau von DNA und RNA |
| Baculovirus-Plasmid (Bacmid) DNA | Inhouse-Nicht-Katalogartikel | Bacmid für die Baculovirus-Produktion | |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfektionsreagenz für Insektenzellen |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | stabilisiert Baculovirus |
| Kryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | Zur Lagerung von Baculovirus |
| HT1080 Zelllinie | ATCC | CCL-121 | Fibroblasten-Zelllinie |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Wachstum Medien für Zelllinien |
| Waschpuffer | Inhouse-Non-Catalog-Artikel | 20 mmol/l Phosphatpuffer mit 150 mmol/l Natriumchlorid | |
| Elutions-Puffer | Inhouse-Non-Catalog-Artikel | 20 mmol/l Phosphat-Puffer mit 1,5 mol/l Natriumchlorid | |
| Säulenreinigungspuffer | Inhouse-Non-Catalog-Artikel | 20 mmol/l Phosphatpuffer mit 2,0 mol/l Natriumchlorid | |
| Steriles Wasser | In-house | Nicht-Katalogartikel | Für Akta Avant Reinigung |
| Natriumhydroxid | Sigma-Aldrich | 1.09137 | Für Akta Avant Reinigung |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | Für Akta Avant Reinigung |
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