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Methodenartikel

Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden

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DOI:

10.3791/57020

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11. Mai 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben das Kapsid Protein von Hepatitis E Virus als Theranostik Nanopartikel (HEVNP) entwickelt. HEVNP montiert selbst in einen stabilen ikosaedrischen Käfig in Schleimhaut Lieferung. Hier beschreiben wir die Änderung des HEVNPs für Tumor gezielt durch Mutationen Oberfläche ausgesetzt Rückstände, Cysteine, die synthetische Liganden konjugieren, die Tumorzellen gezielt zu binden.

Zusammenfassung

Virusähnliche Partikel (untersuchten) wurden zur als darin ausländische Epitope Anzeige und/oder kleine Moleküle bei der Erkennung und Behandlung von verschiedenen Krankheiten zu liefern. Diese Anwendung basiert auf gentechnische Veränderung, Selbstmontage und Cystein Konjugation erfüllen die Tumor-targeting Anwendung der rekombinanten untersuchten. verglichen mit genetischen Modifikation allein, chemische Konjugation von fremden Peptiden, untersuchten bietet eine erheblichen Vorteil, weil es eine Vielzahl von Einrichtungen wie synthetische Peptide oder Oligosaccharide, um an die Oberfläche des untersuchten eine flexibel und moduliert und ohne Änderung der Assemblée VLP konjugiert werden können.

Hier zeigen wir wie das Hepatitis E Virus Nanopartikel (HEVNP), eine modularisierte Theranostik-Kapsel als multifunktionale Anlieferung Träger verwenden. Aufgaben des HEVNPs gehören Gewebe-targeting, Bildgebung und therapeutische Lieferung. Basierend auf den etablierten Strukturforschung HEVNP, wurden die strukturell unabhängige und Oberfläche ausgesetzt Rückstände für Cystein Ersatz als Konjugation Standorte für Maleimide verbunden chemische Gruppen über Thiol-selektive Verbindungen ausgewählt. Eine besondere Cystein-modifizierte HEVNP (Cys Ersatz von Asparagin bei 573 aa (HEVNP - 573C)) war konjugiert, eine Brust Krebs Zelle-spezifische Liganden, LXY30 und beschriftet mit Nah-Infrarot (NIR) Fluoreszenz-Farbstoff (Cy5.5), Rendern den Tumor gezielt HEVNPs als effektive diagnostische Kapseln (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Ähnliche technische Strategien können mit anderen makromolekulare Komplexe mit bekannten Atomstrukturen eingesetzt werden, Anwendungsmöglichkeiten im Theranostik Lieferung zu erkunden.

Einleitung

Die Entwicklung der nanogrösse Vektoren in therapeutische und diagnostische Lieferung, bekannt als Nanotheranostics, hat viel von der Biomedizin vom generalisierten Behandlungen gegen gezielte Bereitstellung1verschoben. Gezielte Nanotheranostic Lieferung integriert nanogrösse Vektoren (Nanopartikel) mit Theranostik Moleküle stabil Theranostik-Moleküle zu einem bestimmten erkranktem Gewebe oder biochemischen Weg2,3,4 direkt . Nanomedizin ist an die Spitze der gezielte Bereitstellung gekommen, weil optimal dimensionierte Nanopartikel haben die Fähigkeit zur Auflage von Theranostik Moleküle stabilisieren und selektiv Ziel Zelle Oberfläche Moleküle präsentiert auf krankem Gewebe. Viele Nanotheranostic Plattformen leiden noch unter passive Zelle Aufnahme, vorzeitigen Abbau, Toxizität und unzureichende Verbindung mit Theranostik Moleküle. Untersuchten überwinden viele dieser Hindernisse in gezielte Bereitstellung. Sie dienten als darin zu ausländischen Epitope Anzeige und/oder kleine Moleküle liefern: eine Therapie, die gegen viele Krankheiten1eingesetzt werden kann. Diese Anwendung beruht hauptsächlich auf dem Gelände des Self-assembly sowie die Leichtigkeit der genetischen Veränderungen, die entworfene Anwendung für die gegebenen VLP zu erfüllen. Im Vergleich zu Gentechnik, chemische Konjugation von ausländischen Peptide, VLP zeigt einen deutlichen Vorteil, da es eine Vielzahl von Einrichtungen wie Peptide oder Oligosaccharide, um an der Oberfläche des untersuchten in einer modulierten konjugiert werden kann und flexibel ohne Änderung des VLP-Montage.

HEVNPs, abgeleitet aus der rekombinanten Proteins HEV Kapsid, 2Nd offen lesen Frame (ORF2), sind nicht ansteckend, selbst Montage Capsids fähig Zelle-Bindung und Eintrag. Weil HEV für Schleimhaut Getriebe entwickelt, ist das montierte Kapsid Protein in proteolytischen und sauren Schleimhaut Bedingungen5ähnlich stabil. HEVNPs bilden eine Mulde, T = 1 ikosaedrischen Kapsid, bestehend aus 60 identischen Einheiten6,7 der ORF2, Rendern hochstabile sowohl im harten physiologischen Bedingungen im Speicher. Alle viralen genetischen Elemente fehlen, wird die Produktion effizienter, ertragreich durch Baculovirus Expressionssystems in Insektenzellen erreicht. Wegen ihrer proteolytischen Stabilität sind selbstgebaute HEVNPs extrahiert und gereinigt aus Zelle überstand, notwendigen Reinigungsschritte erheblich zu reduzieren. Darüber hinaus besitzen HEVNPs eine Oberfläche exponierten Vorsprung Domäne (P Domäne) durch ein flexibles Scharnier zu einer stabilen ikosaedrischen Basis verbunden. Die P-Domäne bildet Oberfläche ausgesetzt Spikes auf der ikosaedrischen Basis, während das flexible Gelenk es möglich macht, wesentlich die P-Domäne zu ändern, ohne Kompromisse bei der ikosaedrischen Basisstruktur. Mit 60 wiederholte Einheiten führt einzelne standortspezifische Modifikation 60 symmetrischen Seiten für chemische Modulation. Vor kurzem vorgeschlagen wir eine Nano-Plattform mit HEVNP, die chemisch Liganden oder kleine Moleküle für Theranostik Anwendungen konjugieren kann. Dies wurde erreicht, indem eine einzelne Aminosäure mit Cystein in der Vorwölbung Domain der HEV-VLP als Reaktion Site mit Maleimide verknüpft Peptide oder Moleküle. Basierend auf früheren Strukturanalyse von HEV-VLP und gut untersuchte immunogen Epitope8,9, wurden die folgenden fünf HEV-VLP-Aminosäuren als potenzielle Kandidaten mit Cystein ersetzt: Y485C, T489C, S533C, N573C und T586C ( Abbildung 1). Nach Ausdruck und Reinigung von Insektenzellen, wurden ihre VLP-Formationen durch Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Beobachtung (Abbildung 2) bestätigt, und die exponierten Cystein Websites analysiert wurden durch Western blot nach Maleimide-linked Biotin Konjugation (Abbildung 2). Unter den fünf Mutanten HEVNP - 573C angezeigt das stärkste Signal des Maleimide-Biotin Konjugation (Abbildung 2) und diente zur Follow-up-Demonstration als die Nanocarrier für Brust Krebszelle gezielt4 (Abbildung 3).

Dieses Protokoll stellt chemische Konjugation Methoden zur Tumor-targeting Moleküle durch Oberfläche Cystein Konjugation HEVNPs beimessen. Wir ausführlich die Konjugation der Tumor targeting und Erkennung Moleküle für Tumor-Lieferung mit rekombinanten HEVNPs mit Cystein bei N573 (HEVNP - 573C). Wir konzentrieren auf Klick Chemie Konjugation Schritten, einen Brust-Krebs-Tumor gezielt Peptid, LXY3010 , HEVNPs Form LXY30-HEVNP (Abbildung 4) zu binden. Anschließend, N-Hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 wurden auf die separate Lys-Website auf HEVNPs LXY30-HEVNP-Cy5.5 für Fluoreszenz-Detektion sowohl in Vitro (Abbildung 5) bauen konjugiert und in-vivo4.

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Protokoll

(1) HEVNP Produktion in Insektenzellen

Hinweis: Alle folgenden Schritte sollte in einer Zelle Kultur Haube durchgeführt werden. Beziehen sich auf unsere früheren Veröffentlichung für detailliertere HEVNP Produktion Verfahren11.

  1. Kultur Sf9 Zellen im Insekt Zelle Medien (siehe Tabelle der Materialien), 50-75 % Zusammenfluss in 6-Well Platten.
  2. Mit Insekten Zelle Transfektion Reagenzien entsprechend des Herstellers Protokollen, transfizieren Sie Bacmids mit HEVNP - 573 C ORF2 in Sf99 Zellen zur Herstellung rekombinanter Baculovirus. 3-6 Tage, abhängig von der Lebensfähigkeit der Zellen inkubieren Sie transfected Zellen bei 27 ° C.
  3. Sammeln Sie Überstand bei 3-6 Tage nach der Infektion (nach die transfizierten Zellen durch Baculovirus Infektion lysiert werden) als P0 Baculovirus bestand.
  4. Entfernen Sie Kulturmedium vor dem Auftragen von 200 µL P0 Lager auf 50-75 % konfluierende Sf9 Zellen in einem 25 cm2 Monolage Kolben. Rock die Flasche alle 15 min um die volle Deckung des Inokulums sicherzustellen. Wiederholen Sie 4 Mal, für eine Gesamtmenge von 60 Minuten.
  5. Der Kolben 2 mL Insekt Zellkulturmedium hinzu und halten Sie bei 27 ° C für ca. 3-6 Tage, abhängig von der Lebensfähigkeit der Zellen Baculovirus zu einem höheren Titer zu verstärken.
  6. Führen Sie Plaque Tests lesen12Baculovirus-Titer zu erhalten.
  7. Kultur der abgehängten Tn5 Insektenzellen (Table of Materials) mit 100 mL Insekt Zelle Medium in 250 mL Flasche und schütteln Sie in 27 ° C bei 150 u/min, ein Titer von 0,5 x 105 - 1 x 106 zum animpfen.
  8. Fügen Sie Baculovirus bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 5-10 bis 100 mL Tn5 Zellen in eine 250 mL Flasche. Nach der Inokulation schütteln Sie in 27 ° C bei 150 u/min für ca. 5-7 Tage.
  9. Sobald die meisten Zellen scheinen Vesikel haben und 70-90 % der Zellen sind tot Lichtmikroskop beobachtet, die Tn5 Zellen zu sammeln und in 33 mL Ultrazentrifugen Rohre übertragen. Ort der Ultrazentrifuge Rohre in schwingende Eimer Rotoren, Balance und Spin-down zellenrückstand und rekombinanten Baculoviren bei 10.000 x g 90 Minuten bei 25 ° C.
  10. Halten Sie den überstand, der die freigegebene HEVNPs bei 4 ° C für weitere Reinigung enthält. Fügen Sie für längere Lagerung des Baculovirus überstand Protease-Inhibitoren.

2. HEVNP-Reinigung

  1. Pellet- und die HEVNPs mit Cäsium-Chlorid (CsCl) gradient Trennung zu isolieren:
    1. Übertragen Sie die gesammelten überstand (aus Schritt 1.10) geben und 20 % NP-40 in jedes Rohr eine Endkonzentration von 0,5 % zu NP-40, alle übrigen Zellmembran aufzulösen. Sanft durch pipettieren mischen und mindestens 30 Minuten bei 25 ° c inkubieren
    2. Die HEVNPs bei 112.400 x g in schwingende Eimer Rotoren für 2 h bei 4 ° C, unten die HEVNPs aus der Überstand pellet Ultrazentrifugen. Verwerfen des Überstands nach Zentrifugation und sanft wieder auszusetzen das rohe Pellet in 200 µL 10 mM MES Puffer pH 6.2 in jedem Röhrchen über Nacht (O/N) bei 4 ° C. Laufen Sie SDS-PAGE (Schritt 3.1) bestätigen das Vorhandensein von HEVNP ORF2 in das Rohöl Pellet als 52 kDa Band.
    3. Bereiten Sie einen 38,5 % (w/V) CsCl-Gradienten durch Mischen 1,96 g CsCl neu suspendierten Rohöl Pellet und der ~ 4 mL 0,01 M MES pH 6.2 in einer 5 mL Ultrazentrifugen Röhre. Balancieren Sie die Röhren zu und in eine schwingende Eimer-Rotor. Ultrazentrifugen 147.000 x g 16 h bei 4 ° C.
  2. Sammeln Sie die Fraktionen nach CsCl-Gradienten:
    1. Die Top 500 µL-Fraktion, die in erster Linie leichte Zellmembran Schutt ist zu verwerfen. Sammeln Sie 500 µL Brüche, ausgehend von der Spitze des Rohres, und ändern Sie Tipps zwischen den einzelnen Fraktionen zu. Legen Sie jede Fraktion in nummeriert/mit der Bezeichnung 1,5 mL Röhrchen.
      Hinweis: Die Anwesenheit von HEVNP ORF2 in Bruchteilen von CsCl Gradienten nicht erkannt werden kann, durch Ausführen von SDS-PAGE Gelen aufgrund der hohen Konzentration von CsCl getrennt. Die CsCl in jede Fraktion kann entfernt oder durch nach einem CsCl-Bereinigung-Verfahren verdünnt. Alternativ kann die CsCl-Gradienten durch ein 10-40 % Saccharose gradient13 CsCl Rückstände zu vermeiden ersetzt werden.
    2. Übertragen Sie jede Fraktion auf eine 5 mL Ultrazentrifugen Rohr und verdünnen Sie die CsCl mit 4,5 mL 10 mM MES, pH 6.2. Balancieren Sie die Röhren zu und in eine schwingende Eimer-Rotor. Ultrazentrifugen 147.000 x g für 2 h bei 4 ° C, unten die HEVNPs pellet.
    3. Verwerfen Sie den überstand und aussetzen Sie sanft wieder der HEVNPs in 100 µL 10 mM MES pH 6.2 in jedem Röhrchen. Decken Sie die Rohre, um Verdunstung zu vermeiden und O/N bei 4 ° c inkubieren
    4. Notieren Sie die A280 Lesung und A260/A280 nm Verhältnis mit einem Spektralphotometer. Bestimmen Sie die ungefähre Konzentration der ORF2 als:
      figure-protocol-1
      Jedes ORF2 enthält Cys Platz 1 und Platz für chemische Konjugation 1 Lys.
      Hinweis: Der molaren Aussterben Koeffizient der HEVNP ORF2 ist 60.280, das entspricht 1,019 mg/mL × A280. Dies ist so nahe an 1:1, die die Konzentration von HEVNPs (in mg/mL) kann durch die A280, und daher die Konzentration von ORF2 durch die obige Gleichung angenähert werden. Zum Beispiel eine HEVNP mit einem A280 Lesung von 1 haben eine Konzentration von 1 mg/mL, 18,8 µM entspricht ORF2.
    5. Bereiten Sie eine SDS-PAGE. Verwenden Sie eine 6 µL Probe aus jeder Fraktion um die Fraktionen mit 53,3 HEVNP ORF2-kDa-Protein (Schritt 3.1) zu bestimmen. Die HEVNPs sollte in Sekundenbruchteilen 3-5, mit einer Dichte von ~1.25 g/mL gefunden werden.
    6. Das Vorhandensein und die Reinheit des HEVNPs durch TEM Beobachtung zu bestätigen. Vorzubereiten oder zu 0,5 - 2,0 mg/mL für TEM HEVNP Proben zu verdünnen. Die HEVNPs erscheinen in TEM als leere ikosaedrischen Proteine, ~ 27 nm im Durchmesser (Abbildung 2). Einige Protein-Verunreinigungen verbleiben in den Fraktionen und unter TEM (Schritt 3.2) beobachtet werden.
  3. Wiederholen Sie im Fall, dass Verunreinigungen unter TEM vorhanden sind Schritt 2.1.3 - 2.2.6 für bessere Reinheit der HEVNPs.
    Hinweis: Zusätzliche Reinigung durch CsCl-Gradienten verursachen Ertragsverlusten von HEVNPs. Alternativ kann die CsCl-Gradienten-Reinigung durch einen 10-40 % Saccharose Verlauf verbleibende CsCl13vermeiden ersetzt werden.

3. HEVNP Charakterisierung

  1. Bereiten Sie SDS-PAGE 4-12 % Bis-Tris Protein Gele, 1,0 mm, 17-Brunnen (siehe Tabelle der Materialien) gemäß des Benutzers manuell14 vor:
    1. Fügen Sie 2 µL 4 x Ladepuffer zu 6 µL Protein Probe. Inkubieren Sie die Probe-Mischung in einem Hitze-Block für 10 min bei 100 ° C, um das Protein zu denaturieren. Laden Sie die Proteinproben auf das Gel.
    2. Laufen Sie die SDS-PAGE von Einstellung der DC-Versorgung bei 100 V für 10 min, dann 150 V 45 min bis die Proben bis ca. 1 cm über dem Boden des Gels laufen.
    3. Fleck das SDS-PAGE-Gel mit Coomassie-blau (0,25 % (w/V) Coomassie Brilliant Blue R250, 30 % (V/V) Methanol, 10 % (V/V) Essigsäure), für 1 h.
    4. Nach dem Färbeverfahren Coomassie blaue Fleck entfernen und anwenden de-Färbung Puffer (30 % (V/V) Methanol, 10 % (V/V) Essigsäure) auf das Protein Gel für > 12 h bei Raumtemperatur.
    5. Dokumentieren Sie das Gel unter weißem Licht, das Vorhandensein von HEVNP ORF2 am Band 52 kDa zu bestätigen.
  2. Beobachten Sie die HEVNPs mit TEM.
    1. Bereiten Sie vor oder verdünnen Sie die HEVNP Proben auf 0,5 - 2 mg/mL mit 10 mM MES pH 6.2 für TEM-Bildgebung.
    2. Ionisieren die Kohlenstoff-beschichtete Netze mit 40 mA Glimmentladung für 30 s, eine hydrophile Carbon-Oberfläche zu produzieren. Die Glut Entlastung Ausrüstung wird in der Tabelle der Materialienbeschrieben.
      Hinweis: Die hydrophilen Carbon-Oberfläche der Netze kann dauern nur für 30 min nach dem glühen Behandlung Entlastung.
    3. In einer Pinzette halten das Raster 2 µL HEVNP Probe hinzufügen, warten Sie 15-30 s und blot mit Filterpapier.
    4. Waschen Sie das Gitter mit DdH20 und Blot mit Filterpapier.
    5. Fügen Sie 2 µL 2 % Uranyl-Acetat sofort die Raster, warten 15 s, dann Fleck mit Filterpapier hinzu. Trocken die Probe-Gitter, indem man sie in einem elektronischen Entfeuchten Trockenschrank für O/N.
    6. Übertragen Sie das Raster in eine TEM und Bild bei 10-80k Vergrößerung. HEVNPs in TEM erscheinen als leere ikosaedrischen Proteine, ~ 27 nm im Durchmesser, aufgrund des Fehlens von viralen RNA.

4. chemische Konjugation von HEVNPs mit Biotin, Krebs gezielt Liganden und Fluorophore

  1. Führen Sie eine Schritt-Konjugation von HEVNPs und Maleimide Zusammenhang mit Biotin.
    1. Puffer-Änderung: wenden Sie die HEVNPs in Mini-Dialysezentren und Dialyse gegen 0,01 M PBS pH 7.4 bei Raumtemperatur 1 h nach der Hersteller-Protokoll (Table of Materials). Übertragen der HEVNPs auf 1,5 mL Tuben und messen die Proteinkonzentration bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.
    2. Mischen Sie die HEVNP auf 1 mg/mL, die entspricht 18,8 µM Cys Reaktion Websites (siehe Details in Schritt 2.2.4), mit einer gleichen Menge von Maleimide-Biotin (100 µM) in 0,01 M PBS, pH 7,4, zu einem Molverhältnis von 1:5; O/N zu reagieren, bei 4 ° C. Entfernen Sie ungebundenen Maleimide-Biotin mit 40 K MWCO Spin Desalting Spalte Verfahren nach der Hersteller-Protokoll (Table of Materials).
    3. Analysieren Sie die Proben durch eine Verringerung der SDS-PAGE (Schritt 3.1) Standard.
    4. Mit Standardverfahren, bereiten Sie eine Chemolumineszenz Western Blot mit Streptavidin HRP verknüpft. Erfassen Sie die Chemolumineszenz Signal durch X-Ray Film (Abbildung 2).
  2. Führen Sie zwei Schritt LXY30 Konjugation, Oberfläche ausgesetzt Cystein für HEV NPs (Abbildung 5).
    1. Puffer-Austausch: HEVNPs in Mini Dialysezentren und Dialyse gegen 0,01 M PBS pH 7.4 bei Raumtemperatur für 1 h Übertragung der HEVNPs auf 1,5 mL Röhrchen und messen die Proteinkonzentration bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.
    2. Fügen Sie 650 µM Maleimide-azid und 650 µM Alkinen-LXY3010 in 0,01 M PBS pH 7.4 mit 200 µM CuSO4 und 1 mM Ascorbinsäure, Maleimide verbunden LXY30 zu bilden (Mal-LXY30) die Mischung bei 4 ° C inkubieren bei 650 µM. O/N.
    3. Mischen Sie die HEVNP auf 1 mg/mL, 18,8 µM Cys Reaktion Website entspricht (siehe Details in Schritt 2.2.4), mit etwa 10 % Volumen der Mal-LXY30 (650 µM) in 0,01 M PBS pH 7.4, zu einem Molverhältnis von 1:3; O/N zu reagieren, bei 4 ° C.
      Hinweis: Aufgrund der relativ hohen Konzentration von Mal-LXY30, die Endkonzentrationen der Edukte, z. B. CuSO4, etwa 10 Mal sinken nach dem Mischen, um ihren Schaden zu HEVNPs zu vermeiden. Eine weitere Möglichkeit ist die Cu-freie Konjugation Methode15.
    4. Entfernen Sie ungebunden Maleimide-Klick-LXY30 mit einer 40 K MWCO Spin Entsalzung Spalte nach der Hersteller-Protokoll (siehe Tabelle der Materialien). Halten Sie die LXY30-Verbindung HEVNPs (LXY30-HEVNPs) bei 4 ° C.
  3. Führen Sie eine Schritt-Konjugation des LXY30-HEVNPs und Cy5.5-NHS Ester (NHS-Cy5.5)
    1. Mischen HEVNPs LXY30 verknüpft (LXY30-HEVNPs), 1 mg/mL, 18,8 µM des Standortes Cys Reaktion entspricht (siehe Details in Schritt 2.2.4), in gleicher Lautstärke des NHS-Cy5.5 (100 µM) in 0,01 M PBS pH 7.4 zu einem Molverhältnis von 1:5; O/N zu reagieren, bei 4 ° C.
    2. Entfernen Sie ungebunden Cy5.5-NHS mit 40K MWCO Spin Entsalzung Spalte Verfahren nach Protokoll des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien). Halten Sie die LXY30, HEVNPs Cy5.5 verknüpft (LXY30-HEVNP-Cy5.5) bei 4 ° C.

5. Bindung an HEVNP und Internalisierung in Brustkrebszellen MDA-MB231

  1. Samen MDA-MB231 Brustkrebs-Zellen in ein 35-mm-Glas unten Gerichte (5 x 104 pro Schale) O/N in einer säugerzelle Kultur Kabinett.
  2. Die Zelle Bindung Experiment bereiten Sie LXY30-HEVNP-Cy5.5 durch folgende Schritte 4.2-4.3 vor. Verdünnen Sie die LXY30-HEVNP-Cy5.5 auf 0,01 mg/mL, die 0.188 µM HEVNP ORF2 entspricht (siehe Schritt 2.2.4), in 250 µL von 0 - 1 % FBS/DMEM.
    1. Bereiten Sie die negative Kontrollprobe bei 0,01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 für folgende Schritt 4.3 aber konjugierte mit NHS-Cy5.5 Farbstoff nur, (HEV-Cy5.5). Verdünnen Sie die HEVNP-Cy5.5 auf 0,01 mg/mL, die 0.188 µM HEVNP ORF2 entspricht (siehe Schritt 2.2.4), in 250 µL 10 % FBS mit DMEM ergänzt.
  3. Waschen Sie die Zellen durch die Anwendung von 1 M-PBS-Puffer, pH 7,4 250 µL einmal. Entfernen Sie die PBS-Puffer nach der Wäsche, wobei einige Puffer in der Kulturschale Zelle.
  4. Gelten Sie 250 µL LXY30-HEVNP-Cy5.5 bei 10 %, die FBS ergänzt mit DMEM oder HEVNP-Cy5.5 bei 10 %, die FBS mit DMEM, die kultivierten MDA-MB231 Brustkrebs-Zellen ergänzt. Schild der Zelle kultiviert Gerichte aus Licht mit Alu-Folie.
  5. Halten Sie die Zelle kultiviert Gerichte in einer Zellkultur 37 ° C Schrank für 1 h für Verinnerlichung.
  6. Waschen Sie die kultivierten Zellen auf Eis 3 mal 5 min pro Waschgang mit 250 µL 1 M PBS, pH 7.4.
  7. Fix die Zellen bei 4 % PFA in 1 M PBS, pH 7.4 für 20 min und dann waschen einmal mit 250 µL 1 M PBS, pH 7.4.
    Hinweis: Die Zellen sind nun bereit, confocal Mikroskop abgebildet werden. Repräsentative Daten sind in Abbildung 5dargestellt.

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Ergebnisse

Verwandt mit HEV-untersuchten alle Cys HEVNPs gebildeten löslichen ikosaedrischen Capsids modifiziert und nicht in Lösung während der Produktion oder Reinigung aggregiert. Vor und nach der einstufigen Maleimide-Biotin Konjugation, jeweils von der Cys geändert wurden HEVNPs von HEV-untersuchten in den negativen Fleck EM (Abbildung 2) zu unterscheiden. Maleimide-Biotin Konjugation Effizienz Cys modifizierte HEVNPs wurde erstmals mit Western blotting über Chemil...

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Diskussion

Im Gegensatz zu der Zeit raubende Gentechnik-Verfahren, das dauert in der Regel Wochen zeigen wir hier in zwei einfachen Schritten und einstufige chemische Konjugation Verfahren, die innerhalb von 3 Tagen des Hinzufügens des Krebs gezielt Liganden abgeschlossen werden können und/oder Fluoreszenz-Erkennung zu Cys/Lys Seiten HEVNPs Farbstoff. Die Technik kann verwendet werden zum Bildschirm für die beste Liganden Ziel aus einem Pool von Kandidaten und damit nutzt die verfügbaren Peptid/kleine Molekül Synthese Dienste zu ei...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

Danksagungen

Die Autoren erkennen die Patenschaft der Finanzierung zum RHC von NIH gewähren #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Nationales Institut für Ernährung und Landwirtschaft sowie Finnland Distinguished Professor Programm.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MINI-Dialysegeräte, 10K MWCOThermo Fisher Scientific69572Mini-Dialysegerät
High Five CellsThermo Fisher ScientificB85502Tn5-Zellen
SF9-Zellen Thermo Fisher Scientific11496015Sf9-Zellen
Bac-zu-Bac-Baculovirus-ExpressionssystemThermo Fisher ScientificA11101, A11100Baculovirus-Expressionssystem
Bac-zu-Bac-Baculovirus-ExpressionssystemLife Technologies10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024Bacmid
ESF921 Insect Cell MediaExpression Systems LLC96-001-01Insekt Zellmedien
Cy5.5 NHS-Ester, 5 mgLumiprobe Corp27020Cy5.5 NHS-Ester
Zeba Spin-Entsalzungssäulen, 40 K MWCO, 0,5 mLThermo Scientific87766Spin-Entsalzungssäule
MES-HydratSigma-Aldrich Chemical CoM8250-250GMES
Ultra-Clear-Zentrifuge Dünnwandige Ultra-ZentrifugenröhrchenBeckman Coulter, IncAbhängig vom RotorUltrazentrifugenröhrchen
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein GeleThermo Fisher ScientificNPO321BOXSDS Protein
Gel Cellfectin II ReagenzThermo FisherScientific 10362100Transfektionsreagenz
EMS Glimmentladungsgerät ElektronenmikroskopieWissenschaftGlühentladungsgerät

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Maleimid-BiotinLXY30-LigandCy55-FluoreszenzmarkerClick-ChemieTEM-BildgebungKonfokalmikroskopieSpin-Entsalzungssäule
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