Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden

Summary

Wir haben das Kapsid Protein von Hepatitis E Virus als Theranostik Nanopartikel (HEVNP) entwickelt. HEVNP montiert selbst in einen stabilen ikosaedrischen Käfig in Schleimhaut Lieferung. Hier beschreiben wir die Änderung des HEVNPs für Tumor gezielt durch Mutationen Oberfläche ausgesetzt Rückstände, Cysteine, die synthetische Liganden konjugieren, die Tumorzellen gezielt zu binden.

Abstract

Virusähnliche Partikel (untersuchten) wurden zur als darin ausländische Epitope Anzeige und/oder kleine Moleküle bei der Erkennung und Behandlung von verschiedenen Krankheiten zu liefern. Diese Anwendung basiert auf gentechnische Veränderung, Selbstmontage und Cystein Konjugation erfüllen die Tumor-targeting Anwendung der rekombinanten untersuchten. verglichen mit genetischen Modifikation allein, chemische Konjugation von fremden Peptiden, untersuchten bietet eine erheblichen Vorteil, weil es eine Vielzahl von Einrichtungen wie synthetische Peptide oder Oligosaccharide, um an die Oberfläche des untersuchten eine flexibel und moduliert und ohne Änderung der Assemblée VLP konjugiert werden können.

Hier zeigen wir wie das Hepatitis E Virus Nanopartikel (HEVNP), eine modularisierte Theranostik-Kapsel als multifunktionale Anlieferung Träger verwenden. Aufgaben des HEVNPs gehören Gewebe-targeting, Bildgebung und therapeutische Lieferung. Basierend auf den etablierten Strukturforschung HEVNP, wurden die strukturell unabhängige und Oberfläche ausgesetzt Rückstände für Cystein Ersatz als Konjugation Standorte für Maleimide verbunden chemische Gruppen über Thiol-selektive Verbindungen ausgewählt. Eine besondere Cystein-modifizierte HEVNP (Cys Ersatz von Asparagin bei 573 aa (HEVNP - 573C)) war konjugiert, eine Brust Krebs Zelle-spezifische Liganden, LXY30 und beschriftet mit Nah-Infrarot (NIR) Fluoreszenz-Farbstoff (Cy5.5), Rendern den Tumor gezielt HEVNPs als effektive diagnostische Kapseln (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Ähnliche technische Strategien können mit anderen makromolekulare Komplexe mit bekannten Atomstrukturen eingesetzt werden, Anwendungsmöglichkeiten im Theranostik Lieferung zu erkunden.

Introduction

Die Entwicklung der nanogrösse Vektoren in therapeutische und diagnostische Lieferung, bekannt als Nanotheranostics, hat viel von der Biomedizin vom generalisierten Behandlungen gegen gezielte Bereitstellung¹verschoben. Gezielte Nanotheranostic Lieferung integriert nanogrösse Vektoren (Nanopartikel) mit Theranostik Moleküle stabil Theranostik-Moleküle zu einem bestimmten erkranktem Gewebe oder biochemischen Weg^{2,3,4 direkt} . Nanomedizin ist an die Spitze der gezielte Bereitstellung gekommen, weil optimal dimensionierte Nanopartikel haben die Fähigkeit ....

Protocol

(1) HEVNP Produktion in Insektenzellen

Hinweis: Alle folgenden Schritte sollte in einer Zelle Kultur Haube durchgeführt werden. Beziehen sich auf unsere früheren Veröffentlichung für detailliertere HEVNP Produktion Verfahren¹¹.

1. Kultur Sf9 Zellen im Insekt Zelle Medien (siehe Tabelle der Materialien), 50-75 % Zusammenfluss in 6-Well Platten.
2. Mit Insekten Zelle Transfektion Reagenzien entsprechend des Herstellers Protokollen, transfizieren Sie Bacmids mit HEVNP - 573 C ORF2 in Sf99 Zellen zur Herstellung rekombinanter Baculovirus. 3-6 Tage, abhängig von der Lebensfähigkeit der Zelle....

Results

Verwandt mit HEV-untersuchten alle Cys HEVNPs gebildeten löslichen ikosaedrischen Capsids modifiziert und nicht in Lösung während der Produktion oder Reinigung aggregiert. Vor und nach der einstufigen Maleimide-Biotin Konjugation, jeweils von der Cys geändert wurden HEVNPs von HEV-untersuchten in den negativen Fleck EM (Abbildung 2) zu unterscheiden. Maleimide-Biotin Konjugation Effizienz Cys modifizierte HEVNPs wurde erstmals mit Western blotting über Chemil.......

Discussion

Im Gegensatz zu der Zeit raubende Gentechnik-Verfahren, das dauert in der Regel Wochen zeigen wir hier in zwei einfachen Schritten und einstufige chemische Konjugation Verfahren, die innerhalb von 3 Tagen des Hinzufügens des Krebs gezielt Liganden abgeschlossen werden können und/oder Fluoreszenz-Erkennung zu Cys/Lys Seiten HEVNPs Farbstoff. Die Technik kann verwendet werden zum Bildschirm für die beste Liganden Ziel aus einem Pool von Kandidaten und damit nutzt die verfügbaren Peptid/kleine Molekül Synthese Dienste zu ei.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI-Dialysegeräte, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	Mini-Dialysegerät
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5-Zellen
SF9-Zellen	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9-Zellen
Bac-zu-Bac-Baculovirus-Expressionssystem	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Baculovirus-Expressionssystem
Bac-zu-Bac-Baculovirus-Expressionssystem	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	Insekt Zellmedien
Cy5.5 NHS-Ester, 5 mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS-Ester
Zeba Spin-Entsalzungssäulen, 40 K MWCO, 0,5 mL	Thermo Scientific	87766	Spin-Entsalzungssäule
MES-Hydrat	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear-Zentrifuge Dünnwandige Ultra-Zentrifugenröhrchen	Beckman Coulter, Inc	Abhängig vom Rotor	Ultrazentrifugenröhrchen
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gele	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS Protein
Gel Cellfectin II Reagenz	Thermo Fisher	Scientific 10362100	Transfektionsreagenz
EMS Glimmentladungsgerät Elektronenmikroskopie	Wissenschaft		Glühentladungsgerät