Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Summary

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Abstract

Microglía representan el 5-10% de todas las células del sistema nervioso central (SNC) y son cada vez más llamar la atención debido a sus contribuciones durante el desarrollo, homeostasis y enfermedad. Aunque los macrófagos han sido estudiados en detalle por décadas, características especializadas de la microglía, los macrófagos residentes de tejido del SNC, se han mantenido en gran parte misteriosa, en parte debido a las limitaciones en la capacidad para recapitular microglial maduro propiedades en la cultura. Aquí ilustramos un sencillo procedimiento para el aislamiento rápido de puro microglia del cerebro de roedores maduros. También describimos las condiciones de cultivo libre de suero que soportan altos niveles de microglial viabilidad con el tiempo. Microglia cultivada bajo estas condiciones del medio definen exhiben elaborados procesos ramificados y comportamiento dinámico de la vigilancia. Ilustramos algunos efectos de la exposición del suero en microglia cultivada y discutir cómo estas culturas sin suero comparan culturas expuestas al suero, así como microglia en vivo.

Introduction

Como los macrófagos de la parenquimia del CNS, microglia interactuar con una amplia gama de circuitos neuronales y gliales redes de señalización. Desempeñan funciones vitales en el desarrollo y homeostasis del cerebro a través de la poda sináptica, separación de células apoptotic y transitorias interacciones con procesos neuronales^1,2. Microglia son primeros respondedores a lesiones neurológicas, ampliando sus procesos de largas y delgadas a los sitios de lesión para coordinar las respuestas inflamatorias y limitar el sangrado^3,4. Cambios en la morfología de microglial y función son ubicuos en lesiones CNS agudas y crónicas, y microglia exposición altera morfología, localización y expresión de mediadores inflamatorios en una amplia gama de Estados de enfermedad¹. Estudios genéticos en humanos indican que las mutaciones que alteran el riesgo de enfermedades neurodegenerativas son a menudo predominantemente o exclusivamente expresadas por microglia del sistema nervioso intacto, apuntando hacia un papel crítico para la microglia en la patogénesis de la enfermedad o progresión de la⁵ . Dada su prominencia en accidentes y enfermedades, favorecer la comprensión de la biología de microglial es una alta prioridad para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.

Han surgido muchos avances fundamentales para la comprensión de la biología de microglial extrapolando mecanismos descubiertos en estudios de otras poblaciones de macrófagos incluyendo métodos de cultivo, perfiles de expresión génica y definiciones funcionales y técnicas / morfológicas Estados. Aunque generalizado macrófago funciones a menudo juegan de manera sorprendente dentro del panorama de la CNS, microglía son altamente especializados, exhiben una morfología ramificada y una firma de expresión de gen único que les diferencia de otros tejidos los macrófagos⁶. Microglia tienen un linaje que es distinto de la mayoría de los otros macrófagos; colonizar el SNC durante una temprana ola embrionaria de hematopoyesis primitiva y uno mismo-renovar toda la vida, independiente de las contribuciones de hematopoyesis definitiva⁷. La firma de expresión de gen completamente maduros de microglia adultos no se logra hasta la segunda semana postnatal⁸. Señales ambientales del tejido circundante juegan un papel importante en el dictado de macrófagos de tejido-específica características⁶, que en el SNC incluye exposición limitada a factores transmitidos por la sangre por la barrera hemato - encefálica⁹.

Un obstáculo para comprender plenamente microglial contribuciones a CNS homeostasis y enfermedad es la dificultad de recapitular las propiedades especializadas de microglia madura visto en vivo con células purificadas en vitro. Muchos métodos han sido desarrollados para aislar y microglia intacta de la cultura, pero la mayoría de enfoques dependen de suero para apoyar la supervivencia de la célula. Hemos demostrado que además del suero, que es un reactivo inherentemente variable que contiene una gran variedad de moléculas bioactivas, es particularmente problemático cuando trabajo con microglia ya que promueve una morfología ameboides, incrementa la proliferación, y aumento de fagocitosis⁹ a menudo visto en vivo cuando microglía están expuestos a factores de sangre después de la interrupción de la barrera blood - brain. De estas métricas, expuestas al suero de las células se asemejan a microglia en lesiones o enfermedades, pero tales alteraciones se reducen cuando microglia se cultivan en el medio de crecimiento definido con CSF-1 (o IL-34), TGF-β, colesterol y selenita.

Este protocolo proporciona información detallada para el cultivo de rata juvenil microglia en condiciones libres de suero, relacionados con la obra recientemente publicada⁹. Este protocolo se ha racionalizado para las ratas de día postnatal 21-30 (P21 - P30), pero puede ser adaptado para aislar microglia de ratas y ratones de cualquier edad, aunque el rendimiento y la viabilidad general varían dependiendo de la especie y edad del animal. Máximo rendimiento y viabilidad óptima se logra cuando se usa ligeramente inmaduro microglia (~ P9), con rendimientos y viabilidad estrechándose gradualmente a algo de niveles más bajos en animales adultos. Microglía también puede ser aislado de ratones, pero hemos encontrado que las células de rata muestran significativamente mayor rendimientos, viabilidad y la complejidad de la morfología ramificada, en comparación con las células de ratón en cultivos libres de suero. Animales de edad superior a P50 no han sido evaluadas con este protocolo. Este procedimiento de aislamiento de immunopanning ha sido optimizado para reducir al mínimo cambios en perfiles transcripcionales microgliales durante el aislamiento y para maximizar la viabilidad posterior de las células. Usando estas técnicas y formulaciones de los medios de comunicación, cultivos primarios de alta viabilidad pueden mantenerse por semanas. Microglia cultivada bajo estas condiciones presentan una morfología muy ramificada con rápida extensión y retracción de los procesos y relativamente bajas tasas de proliferación. Resaltar la importancia de suero-exposición de estas características y discutir las fortalezas y debilidad de este método en comparación con otros enfoques.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran a roedores conforman a las directrices de la Universidad de Stanford, que cumplan con las políticas y las leyes estatales y nacionales. Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Administrativo de la Universidad de Stanford sobre cuidado de animales de laboratorio.

Nota: Todas las composiciones solución y buffer son proporcionadas en la Tabla de materiales.

1. prepare una placa de Petri Immunopanning de CD11b (día 0)

Nota: Preparar 1 immunopanning plato de cada cerebro de rata juvenil 1-2.

1. Añadir 25 mL de 50 mM solución de Tris pH 9.5 a un plato de Petri de 15 cm.
2. Añadir cabra anti-ratón IgG (cadenas H + L) en el plato para una concentración final de 6 μg/mL. Remolino de placa para distribuir uniformemente.
3. Incubar el plato para 1-3 h a 37 ° C.
4. Platos de enjuague tres veces con DPBS⁺⁺ (tampón fosfato salino (PBS) con Ca^{2 +} y Mg^{2 +}), reemplácelo con una solución de lavado tampón que contiene 1 μg/mL de anticuerpos OX42. Deje los platos durante la noche a temperatura ambiente sobre una superficie plana.

2. tejido colección (día 1)

Nota: Este protocolo debe tomar ~ 3-4 h.

1. Antes de empezar, asegúrese de que todas las soluciones son estériles y refrigeradas con hielo. Enfriar todos los instrumentos en el hielo y esterilizar con etanol antes de usarlo.
2. Siguientes procedimientos regulatorios apropiados, sacrificar a una rata de laboratorio juvenil por asfixia dióxido de carbono.
   Nota: Como alternativa, animales más jóvenes que sean sacrificados con una dosis letal de ketamina/xilacina (100-200 μL de 24 mg/mL ketamina, xilacina 2.4 mg/mL). Ketamina/xilacina debe usarse si los animales son menos de 14 días de edad. Si utiliza múltiples animales, extraer el tejido de un animal y lo coloca en DPBS previamente enfriada⁺⁺ en hielo antes de proceder a los siguientes animales.
3. Pellizque un hindpaw y asegurar la insensibilidad completa del animal antes de proceder.
4. Transcardially perfusión el animal con 10-30 mL de tampón de la helada de la perfusión mediante una aguja de 27½-G hasta que el búfer funcione claro.
   Nota: Volumen de perfusión tampón variará dependiendo del tamaño, edad del animal.
5. Inmediatamente después de la perfusión, quitar la cabeza del animal. Provenientes de la médula espinal cortada el cóndilo occipital a cada lado con tijeras de disección, tenga cuidado de no dañar el cerebro. Después de cortar cada lado con cuidado, corte para arriba de un lado a lo largo de los parietales y el hueso frontal hacia el hueso nasal. Con pinzas cuidadosamente tire hacia atrás la parte superior del cráneo, rápidamente Retire el cerebro (o estructuras de CNS de interés) y coloque en DPBS previamente enfriada⁺⁺ en hielo.
6. Repita para todos los animales restantes.
   Nota: Todos los pasos de procedimiento deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles adecuadas.

3. mecánica disociación (día 1)

1. Después de todos los cerebros han sido recogidos, picar un cerebro en trozos de³ 1 mm en una placa Petri sobre el hielo con una hoja de bisturí frío y transferir a un homogeneizador dounce helada con 5-7 mL de tampón de douncing helada. Disociar un cerebro en un momento.
2. Disociar el tejido con 10-20 movimientos suave e incompletas con un homogeneizador de dounce sueltas. Tenga cuidado de no aplastar directamente el tejido en la parte inferior de la homogeneizadora, pero en su lugar impulsar el tejido a través del espacio entre los lados del pistón y el homogenizador.
3. Retire con cuidado el pistón para evitar la introducción de burbujas de aire. Permite trozos de tejido mal disociada a instalarse en la parte inferior de la homogeneizadora y transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL refrigerado nuevo.
4. Reemplazar el volumen quitado con tampón de douncing fresca y repita los pasos 3.2 y 3.3 para un total de 3-4 rondas o hasta que todo el tejido ha sido disociado. Repita el procedimiento para cada cerebro.

4. mielina retiro (día 1)

Nota: Eliminación de la mielina se utiliza para el aislamiento de la microglía de animales mayores de P12.

1. Medir el volumen de la suspensión de células en el tubo cónico de 50 mL con una pipeta de 25 mL, luego agregar helado douncing tampón para ajustar el volumen total en mL 33,5.
2. Añadir 10 mL de tampón de separación de mielina (MSB) a la suspensión de células y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Esto resultará en una concentración final del 23% de MSB en un volumen de 43,5 mL.
3. Centrifugar las células durante 15 min a 500 x g a 4 ° C con el frenado lento.
   Nota: La centrífuga debe tomar aproximadamente 1.5-2 min a desacelerarse. Esto generará una capa superior de mielina y restos de células muertas, un sobrenadante algo turbio y un pellet más pequeños que se enriquece para células vivas.
4. Quitar la capa superior de la ruina del myelin y el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado al retirar la capa superior para asegurar que gran parte se elimina como sea posible.
5. Resuspender el precipitado de células en 12 mL de tampón de lavado. Triturate suavemente la suspensión de celular romper cualquier grumos de células que puedan quedar.

5. Immunopanning (día 1)

1. Pasar la suspensión celular a través de un colador de celular de 70 μm para eliminar basura grande o grupos de células.
2. Enjuagar el plato barrido tres veces con DPBS⁺⁺OX42 cubierto. No permita que la placa se seque completamente entre lavados.
3. Retirar el último lavado DPBS⁺⁺ y aplique la suspensión filtrada al plato barrido. Suavemente la placa para distribuir las células del remolino, luego Incube la placa en una superficie plana, a temperatura ambiente durante 20 minutos permitir que las células se adhieran. No incubar más de 20 min o células será muy difíciles recuperarse del plato.
4. Enjuagar el plato barrido con DPBS⁺⁺ 10 veces para eliminar las células no adherentes. Microglia será tan firmemente conectada a la placa, agitar la placa con cada enjuague para asegurar el retiro de otras células no adherentes.
5. Retirar el último lavado DPBS⁺⁺ y reemplace con DPBS⁺⁺ de 15 mL y 200 μL tripsina (solución stock de 1.25%).
6. Incubar el plato ≤10 min a 37 ° C con 10% CO₂ para trypsinize.
   Nota: No continúe más de 10 min o microglia será difícil de quitar.
7. Después de 10 min de la tripsinización, microglia todavía se ser pegado a la placa. Vierta de tripsina/DPBS⁺⁺ y lave suavemente 2 x con DPBS⁺⁺ eliminar tripsina, reemplazar con 12 mL de medio de crecimiento de microglia helada (MGM).
8. Lavado plato en hielo durante 2 minutos para ayudar a debilitar la interacción celular/substrato y asegúrese de que el plato es plana para evitar que áreas del plato barrido de la desecación.
9. Pipetear enérgicamente con un controlador de pipeta y pipeta 10 mL de alta velocidad para recuperar las células de la fuente de barrido. Dibujar una cuadrícula de 16 x 16 con la corriente de líquido de la pipeta para tratar de eliminar todas las células.
10. Compruebe las células bajo un microscopio de 20 aumentos para asegurarse de que las células han separado de la placa. Marcar puntos sobre el plato donde las células se pegan todavía y repita el pipeteo en esas áreas.
11. Recoger la suspensión celular y alícuota 3-4 mL del sobrenadante por el tubo cónico de 15 mL. Vuelta por 15 min a 500 x g a 4 ° C con el frenado lento.
    Nota: Microglia a través de un pequeño volumen de giro permite la recuperación máxima de las células.
12. Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 mL de MGM con el precipitado de células.
13. Resuspender cada precipitado en MGM restante y las células de los tubos de la piscina.
14. Contar celdas con hemocitómetro.
15. Células de la placa como se describe en los pasos 6 - 7 dependiendo de la aplicación.
16. Células en cultivo a 37 ° C con 10% CO₂.
    Nota: Las células pueden ser cultura para hasta 3-4 semanas con cambios regulares de los medios de comunicación o una semana sin cambios de los medios de comunicación.

6. punto capa las placas de cultivo de tejidos/cubreobjetos (día 1)

1. Placa de 15 μl de la capa de colágeno IV en el centro de una placa de cultivo de tejidos recubiertos 24-pozo aniónico/catiónico (para detalles, véase Tabla de materiales ) e incubar por 15 min a 37 ° C con 10% CO₂.
2. Después de contar las células con hemocitómetro diluir las células a 2.3 x 105/ml en MGM. Aspirar en lugar de colágeno IV y placa 15 μl de la suspensión celular a este lugar; Esto le dará 3.5 x 10³ células/punto. Incubar durante 5-10 min a 37 ° C con 10% CO₂ para permitir que las células se adhieren, Añadir 500 μl de CO_{2 -}equilibrado que contiene medio de crecimiento TGF-β2 y IL-34/colesterol (TIC) suavemente hacia el pozo.
3. Si la galjanoplastia en cubreobjetos, primera capa cubreobjetos de vidrio estéril con 10 μg/mL estratagema-D-lisina (PDL) en H₂O por 1 h a temperatura ambiente, lavar 3 veces con H₂O y dejar secar en una campana bajo luz UV. Una vez seco cubreobjetos, proceder con la galjanoplastia del punto sobre el cubreobjetos como se describe en el paso 6.2.

7. recubrimiento para el aislamiento de RNA/proteína

1. El día 1, capa toda la zona de un 24-pozo aniónico/catiónico revestido en placa de cultivo de tejidos con la capa de colágeno IV e incubar por 10 min - 1 h a 37 ° C con 10% CO₂, luego retire e inmediatamente la placa 3-5 x 10⁴ células/pozo en CO₂ equilibrado Medios de comunicación TIC.
2. En el día 2, realizar un cambio de media de 50% para cada uno bien el día después de la preparación. Las células muertas tienden a cluster en el centro del pozo, así que los medios de comunicación a partir de ahí.
3. Realizar un cambio de media de 50% cada 2-3 días para mantener los cultivos. Si los cambios de los medios de comunicación introducen una variable no deseada de las culturas, las células pueden sobrevivir aproximadamente una semana sin ningún cambio de los medios de comunicación, frente a más de 3 semanas con mantenimiento regular.

Representative Results

Este protocolo describe un método de cultura alta pureza ramificado microglia de ratas juveniles. Resultados similares pueden obtenerse utilizando animales inmaduros, perinatales y adultos, como se explica a continuación. Desde aislamientos celulares suelen incluyen matices sutiles y muchas oportunidades para que las células mueren, usamos puntos de control de calidad para ayudar a determinar el éxito en varios pasos. Normalmente supervisamos suspensiones celulares usando un hemocitómetro en múltiples pasos en el protocolo de aislamiento (figura 1A). Aislamientos de éxito deben producir 2.5-5 x 10⁵ animales de células juvenil. Animales de P7 - P15 muestran rendimientos más al 5 x 10⁵ células/animal, considerando que las células aisladas de animales mayores de P30 muestran rendimientos más cercano a 2.5 x 10⁵ células animales. Más allá control de celular total cuentas en todo el protocolo, es importante determinar la salud general de las células aisladas, que puede ser difícil porque microglia aislado de esta manera tienen una morfología redondeada o bipolar durante los primeros días en la cultura . Aquí, hemos incluido imágenes de fase de P25 microglia en cultura durante los primeros 6 días después de la aislamiento en TIC y en TIC que contiene 10% de suero fetal de ternero (FCS) (figura 1B).

Figura 1: evaluación de la salud de la célula durante el protocolo de aislamiento y durante 6 días de cultura. (A) fase-ponga en contraste imágenes ilustrando puntos de control de calidad en los pasos designados del procedimiento de aislamiento celular. Suspensiones celulares fueron reflejadas mezclando 9 μl de la suspensión celular con 1 μl de tripano 0.4% azul antes de cargar en un hemocitómetro. Otras imágenes muestran el plato barrido sí mismo, y todas las imágenes se muestran como un campo con 20 aumentos. Barra de escala, 200 μm. MGM, medio de crecimiento de la microglia. (B) curso temporal de los cambios morfológicos microglial y proliferación durante 6 días de la cultura libre de suero TIC crecimiento medio o TIC más 10% fetal suero de ternera (FCS). Las células CD11b-immunopanned eran punto plateado en placa de cultivo tejido revestido catiónico/aniónico recubierta de colágeno (para detalles, véase Tabla de materiales ), y el mismo campo era reflejado por contraste de fase cada 24 h. escala bar, 100 μm. TIC, TGF-β2/IL-34 / Medio de cultivo que contienen colesterol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La evaluación rutinaria de la salud y la viabilidad de células aisladas son importantes para la reproducibilidad y el éxito de los experimentos. Aquí mostramos microglia aislada de un animal de P21 cultivado en MGM, TIC o TIC suplementado con 10% FCS después de 7 días en vitro (DIV) con un análisis de viabilidad. Si el aislamiento era acertado, las culturas muestran entre 80-90% de viabilidad en TIC después 7 div de células cultivadas en presencia de suero eventualmente subir a casi el 100% de viabilidad de esta medida, sin embargo esto es inflado artificialmente por la rápida proliferación de las células expuestas al suero y rápida fagocitosis de células muertas dentro de estas culturas (figura 2A). Además de supervivencia robusta, las células cultivada de TIC muestran también una morfología ramificada en comparación con FCS tratados las células (figura 2B, C).

Figura 2: supervivencia de microglia en MGM, TIC o TIC + FCS durante siete días en la cultura. (A) las células fueron aisladas de ratas de P21 y cultivadas en medio de crecimiento de la microglia (MGM), TGF-β2 y IL-34/colesterol que contiene un medio (TIC), o TIC + suero de ternera fetal 10% (FCS). En cada momento, medio de cultivo fue suplementado con calceína AM (final de 1.33 μm) y homodímero de etidio (final de 2,5 μm) durante 15 min a la etiqueta de células vivas y las células muertas respectivamente. Las células fueron contadas en cada campo usando un script automatizado de ImageJ. (B y C) después de 7 DIV, sin cambios de los medios de comunicación, las células cultivadas en TIC (B) o TIC suplementado con 10% FCS (C) fueron teñidos para las células vivas y muertas como arriba de la etiqueta. Imágenes representativas fueron tomadas usando un 10 X (izquierda) o (derecha) objetivo de 40 X. Barra de escala, 40 μm. barras de Error representan el error estándar de la media (SEM). Esta figura fue modificada de Bohlen et al. ⁹ y usada con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para demostrar el aislamiento exitoso y cultura de microglia altamente puro, aislado microglia de ratas de P21 y cultivar estas células en TIC o TIC suplementado con 10% FCS por 8 días. Las células fueron fijos y manchadas con marcadores microgliales (Iba-1 y CD11b) y marcador de la proliferación (Ki67, Figura 3A). En adición a las manchas de marcadores de la célula, RNA-seq en las células recién aisladas puede proporciona una herramienta poderosa y sensible para evaluar el perfil de RNA de las células y puede ayudar a informar a la pureza inicial de las culturas. Immunopanning CD11b típicamente resulta en un pequeño porcentaje de CD11b⁺ arrastre de neutrófilos/monocitos CD11b además de⁺ microglia (figura 3B). Estas células morirán en TIC después de algunos días, pero pueden complicar los análisis de momentos anteriores.

Figura 3: pureza de las células cultivadas evaluada por immunohistochemistry y RNA-SEQ Microglia (A) fueron aisladas de ratas de P21, plateado en PDL/colágeno cubierto de vidrio cubreobjetos y cultivadas en medio de cultivo que contiene TGF-β2 y IL-34/colesterol (TIC) por 8 días. Las células se fija con 4% paraformaldehido (PFA) durante 10 min a temperatura ambiente e inmune-manchadas de Iba-1 (1: 500), CD11b (1:1500) y Ki67 (1: 500). Brevemente, las células fijas fueron bloqueadas con 0,1% detergente (ver tabla de métodos para obtener detalles) y 10% de suero normal de burro (NGS) por 1 h a temperatura ambiente. Luego se incubaron las células con anticuerpos primarios en detergente de 0.1% con 1% NGS durante la noche a 4 ° C. Las células se lavaron tres veces por 5 minutos cada uno en PBS. Las células entonces se incubaron con anticuerpos secundarios todos 1: 500 en detergente de 0.1% con 1% NGS por 1 h a temperatura ambiente. Células otra vez se lavaron tres veces en PBS y montadas con medio de montaje que contiene el DAPI. Se tomaron imágenes representativas a 40 aumentos. Escala de la barra, 50 μm. (B) expresión de las transcripciones específicas representante tipo de la célula por células recién aisladas y cultivadas. Microglia fueron aislados de ratas de P21 y lisis directamente de la fuente de immunopanning para el aislamiento de RNA y RNA-seq. marcadores de otros tipos de células importantes del CNS (astrocitos, neuronas, oligodendrocitos y células endoteliales) muestran contaminación mínima de Células CD11b-immunopanned. Marcadores de neutrófilos se detectaron en las células recién aisladas (negro), pero se pierden en las culturas sin suero (gris). Células cultivadas expresan altos niveles de marcadores de macrófagos común, pero rápidamente los marcadores definiendo la firma especializada microglial son regulada por células cultivadas. Barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Los datos se modifican de Bohlen et al. ⁹ y usada con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tinción de viabilidad y marcadores de la célula permite la determinación de la supervivencia y la pureza de las células, pero proporciona información limitada sobre la dinámica de la cultura. Aquí hemos incluido una película Time-lapse de P21 rata microglía después 14 DIV en TIC. Después de dos semanas, cultivos libres de suero demuestran comportamiento vigilancia dinámica, con extensiones de proceso rápido y retracciones a lo largo del plato (ver 1 película). Además, hemos previamente encontramos que la exposición del suero transforma estas descansando propiedades estado de microglia, dando por resultado duraderos cambios morfológicos y fagocíticos. Hemos incluido una película de microglia cultivada durante 5 días en TIC, entonces expuesto a 10% FCS (véase película 2).

Película 1: culturas de microglia medio definidos muestran morfología ramificada con procesos dinámicos. Microglia se aislaron una P21 rata, punto plateado en placas recubiertas de colágeno aniónico/catiónico cultura de tejido recubierto y cultivadas durante 14 días en TIC. En DIV 14, imágenes fueron recogidas cada 3 minutos. La película Juega a 6 fotogramas/s, y la fecha y hora en la esquina inferior derecha indica la duración de la proyección de imagen en h:min. la película se reproduce de Bohlen et al. ⁹ y usada con permiso. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Película 2: exposición de suero desencadena un rápido cambio morfológico en medio definido microglial culturas. Microglia se aislaron una P21 rata, punto plateado en placas recubiertas de colágeno aniónico/catiónico cultura de tejido recubierto y cultivadas durante 5 días en TIC. 5 DIV, imágenes se recogieron cada 5 min basales morfología de motilidad se registró, luego en 2:55 (2 h, 55 min.), un cambio del 50% los medios de comunicación fue realizado para añadir FCS a una concentración final de 10%. Las células fueron fotografiadas para una adicional 7 h. La película Juega a 6 fotogramas/s, y la fecha y hora en la esquina inferior derecha indica la duración de la proyección de imagen en h:min. por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)

Discussion

Porque microglia sirva de centinela de las células inmunes de la CNS, son altamente sensibles a los cambios ambientales; por lo tanto, se requiere gran cuidado para reducir al mínimo las respuestas inflamatorias dentro de las células durante el aislamiento y cultura⁸. Esto se logra en este protocolo a través de la velocidad y la temperatura. Mantener las células en hielo o a 4 º C siempre que sea posible reduce la activación, por lo que realizará todos los pasos de centrifugación a 4 ° C, los animales son perfundidos con tampón de perfusión helada, y el protocolo se ha racionalizado para minimizar el tiempo entre el tejido extracción y cultivo de las células. Si evaluación de patrones de expresión génica de células recién aislado, cosecha lysates de la célula directamente en el plato de immunopanning CD11b antes de tripsinización para mantener los cambios inducidos por el aislamiento mínimo. Cabe señalar que incluso cuidadosamente aislado microglia ejecutar una respuesta inflamatoria inmediatamente después de estar en temperaturas cálidas, presumiblemente debido al reconocimiento de señales de daño asociado intrínsecamente asociados con el procedimiento de aislamiento. Si el protocolo se realizó con éxito, se espera que 2,5-5 x 10⁵ rata de células juvenil.

El protocolo de aislamiento celular proporcionada aquí es altamente específico para aislar las células CD11b + de la perfusión del CNS⁹. Aunque esta población de células se compone predominante de microglia, también contiene niveles bajos de otras poblaciones mieloides como macrófagos perivasculares, meníngeos macrófagos, los macrófagos del plexo coroides, monocitos y neutrófilos¹⁰. Las células mieloides asociadas coroides pueden eliminarse esencialmente por reconocimiento y eliminación del plexo coroideo antes de la disociación del tejido. Meninges pueden eliminarse también en cierta medida, pero la eliminación completa de todo el tejido meníngeo no es práctica en los plazos destinados a aislamiento rápido descrito aquí. Por lo tanto, para limitar la variabilidad debido a la extirpación incompleta de la meninges, no quitamos meninges. Para minimizar el número de monocitos/neutrófilos en el material aislado de la circulación, también es importante tener una perfusión limpiarla y normalmente descartamos tejido que es pobremente perfundido. Incluso con excelente perfusión, separación de la sangre no es absoluta, como será evidente por la presencia de una pequeña cantidad de eritrocitos en gránulos de células a través de la purificación. Así, pequeños niveles de monocitos y neutrófilos Co son purificados y contribuyan con una firma diferente en los perfiles transcriptómicos de células recién aislado. Sin embargo, las células circulantes se mueren rápidamente en medios libres de suero TIC y no representan los contaminantes persistentes, aunque puede seguir sobrevivir y proliferar en el suero que contiene culturas.

Otro punto importante a la consecución de una cultura saludable y viable debe cuidar durante las etapas de disociación mecánica. Mientras que douncing mata muchas neuronas, glia y otras células del SNC, microglia sobrevivirán esta disociación relativamente ilesa (aunque microglía también puede ser matado por sobre-douncing). Si se hace correctamente, este protocolo resulta en células rendimientos comparables a los obtenidos mediante disociación proteolítica, mientras que potencialmente confundir variables de tejido inflamatorio se evitan respuestas a temperaturas elevadas. Realizando partidas incompletas consecutivas de disociación mecánica del tejido, las células se pueden cosechar de la suspensión y reducir al mínimo la cantidad de tensión mecánica en la cultura general.

El protocolo de immunopanning descrito aquí es una manera fiable y reproducible para aislar la microglia, pero existen otros métodos comparables. Hemos obtenido resultados similares con aislamiento magnético celular activada por el magnético clasificación selección CD11b y agotamiento de la mielina. Aquí nos hemos centrado en el método immunopanning porque ha proporcionado las culturas de la más alta calidad hasta la fecha, requiere equipo menos especializado y no requiere la introducción de anticuerpos conjugados con óxido de hierro a las células inmediatamente antes de la cultura. Otro enfoque utilizado para el aislamiento de microglial es la citometría de flujo, que tiene una gran ventaja sobre el actual enfoque que protocolos existen para la purificación de la microglía de bona fide de otros CD11b + contaminantes mieloides con superficie anticuerpos contra los marcadores de firma como TEMEM119⁸. Aunque celular activado por fluorescencia clasificación resulta en una población celular muy puro, que impone estrés adicionales a las células y puede resultar en menor viabilidad culturas o rendimientos reducidos. En general, nos centramos en los métodos basados en anticuerpos sobre los preparativos de centrifugación y la sacudida de densidad libre de etiqueta para maximizar la reproducibilidad y la pureza de la población de células.

Mientras que este protocolo está optimizado para la cultura de la microglía de rata juvenil, puede utilizarse para cultura microglia de varias edades; rendimiento total de la célula es máxima de 1 - 2 semanas de edad ratas, después de que ha pasado el pico de la expansión de la microglía y antes de los cambios estructurales que interfieren con la recuperación de las células del tejido más viejo. Microglia puede ser aislado y cultivado de tejido humano y ratón sustituyendo el anticuerpo CD11b con un anticuerpo monoclonal apropiado específico para ratón o epítopes humanos. Mientras que ratón y microglia humano sobrevivirán bajo estas condiciones de cultivo, muestran diferencias morfológicas en comparación con las células de rata. Las células de ratón conservan una morfología ramificada pero tienen menos elaborar procesos, mientras que las células humanas tienen una morfología ameboides casi uniforme cuando se aíslan y cultivan según este procedimiento.

Microglia aislado puede ser plateado en diferentes maneras dependiendo de los ensayos requeridos. Para obtener resultados óptimos (como se ilustra en el live/dead ensayos y películas morfológicas que se muestra aquí), 3.5 x 10³ células eran "spot" plateado en el centro del pozo de una placa de cultivo de tejidos recubiertos 24-pozo aniónico/catiónico, después una capa de 10 min de colágeno IV como descrito en el protocolo anterior. Alternativamente, para los experimentos que requieren grandes cantidades de células, tales como aislamiento de RNA, se puede platear 3-5 x 10⁴ células por pocillo de una placa de 24 pocillos después de 10 min a 1 h de la capa de colágeno IV. Células plateado con densidades superiores mostró ligeramente menor viabilidad y morfología menos complejo en comparación con las células que eran punto tratado, posiblemente debido al impacto de las señales inflamatorias secretadas en respuesta al aislamiento. Para imágenes que requieren vidrio cubreobjetos o inmunohistoquímica, las células exhiben la mejor supervivencia y morfología cuando primeros fueron cubreobjetos forrada PDL entonces cubierto en colágeno IV como se describió anteriormente. Para ensayos que requieren un gran número de condiciones, la viabilidad celular es también alta en placas recubiertas de colágeno bien 96 o 384 pocillos. En todas las condiciones, las células inician ronda o bipolar, empiezan a adquirir procesos alrededor de día 3 y 4 y 5-10 días para exponer la morfología ramificada máximo ilustrada en la figura 1 y la 1 de la película.

Si bien este protocolo resulta en una cultura que exhibe comportamiento de vigilancia dinámica y morfología similar a la reclinación microglia en vivo, estas células no retener completamente la firma de expresión de genes especializados de microglia en vivo. Muchos de los cambios de gene persistente observados en células cultivadas reflejan alteraciones consideradas típicamente en el embrionario o inflamado CNS⁹. Así, este protocolo representa un avance en la comprensión de las condiciones de microglia requieren para sobrevivir en la cultura y los cambios de suero-evocado, pero más estudio es necesario para comprender las señales extrínsecas proporcionadas por el SNC que afinar microglial propiedades y expresión genética.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.