Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

अलगाव और कुतर Microglia की संस्कृति सीरम मुक्त माध्यम में एक गतिशील Ramified आकृति विज्ञान को बढ़ावा देने के लिए

Published: March 9, 2018 doi: 10.3791/57122
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neurobiology, Stanford University

Summary

microglial फंक्शन को विस्तार से समझने के प्रयासों में microglial कल्चर मॉडल्स की कमी से रुकावट आ रही है जो दोहराऊंगा के गुणों को वीवो microglia में करता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक अलगाव और संस्कृति को परिभाषित-मध्यम शर्तों के तहत अत्यधिक ramified परिपक्व चूहे microglia के मजबूत अस्तित्व को बनाए रखने के लिए डिज़ाइन दृष्टिकोण ।

Abstract

Microglia सभी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) कोशिकाओं के 5-10% का प्रतिनिधित्व करते है और तेजी से विकास, homeostasis, और रोग के दौरान उनके योगदान के कारण ध्यान आकर्षित कर रहे हैं । हालांकि मैक्रोफेज दशकों के लिए विस्तार से अध्ययन किया गया है, microglia की विशेष सुविधाओं, ऊतक-सीएनएस के निवासी मैक्रोफेज, मोटे तौर पर रहस्यमय, भाग में दोहराऊंगा करने की क्षमता में सीमाओं की वजह से रह गया है microglial संस्कृति में गुण । यहाँ, हम परिपक्व कुतर मस्तिष्क से शुद्ध microglia के तेजी से अलगाव के लिए एक सीधी प्रक्रिया का वर्णन । हम भी सीरम मुक्त संस्कृति शर्तों का वर्णन है कि समय के साथ microglial व्यवहार्यता के उच्च स्तर का समर्थन । Microglia इन परिभाषित मध्यम शर्तों के तहत प्रसंस्कृत व्यापक ramified प्रक्रियाओं और गतिशील निगरानी व्यवहार का प्रदर्शन । हम microglia पर सीरम जोखिम के कुछ प्रभाव उदाहरण देकर स्पष्ट करना और चर्चा कैसे इन सीरम मुक्त संस्कृतियों दोनों सीरम उजागर संस्कृतियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से vivo मेंmicroglia की तुलना करें ।

Introduction

सीएनएस पैरेन्काइमा के मैक्रोफेज के रूप में, microglia न्यूरॉन सर्किट और glial सिग्नलिंग नेटवर्क की एक विशाल सरणी के साथ बातचीत । वे synaptic छंटाई, अपोप्तोटिक सेल क्लीयरेंस के माध्यम से मस्तिष्क के विकास और homeostasis में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और न्यूरॉन प्रक्रियाओं के साथ परिवर्तनीय बातचीत1,2. Microglia मस्तिष्क संबंधी चोटों के लिए जल्दी प्रतिक्रिया कर रहे हैं, उनके लंबे, पतली प्रक्रियाओं को घाव करने के लिए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं समंवय और सीमा3,4खून बह रहा है । microglial आकृति विज्ञान और समारोह में परिवर्तन दोनों तीव्र और पुरानी सीएनएस चोटों में सर्वव्यापी हैं, और रोग की एक विविध रेंज में भड़काऊ मध्यस्थों की अभिव्यक्ति बदल आकृति विज्ञान, स्थानीयकरण, और microglia का प्रदर्शन1। मानव आनुवंशिक अध्ययन संकेत मिलता है कि उत्परिवर्तनों कि परिवर्तन neurodegenerative रोगों के लिए जोखिम अक्सर मुख्य रूप से या विशेष रूप से बरकरार सीएनएस में microglia द्वारा व्यक्त कर रहे हैं, रोग रोगजनन या प्रगति में microglia के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की ओर इशारा करते हुए5 . चोट और रोग में उनकी प्रमुखता को देखते हुए, microglial जीव विज्ञान की समझ को आगे बढ़ाने के नए चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास के लिए एक उच्च प्राथमिकता है ।

microglial जीव विज्ञान की समझ के लिए कई महत्वपूर्ण अग्रिमों extrapolating तकनीक और संस्कृति विधियों, जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल सहित अंय मैक्रोफेज आबादी के अध्ययन में खोज तंत्र के द्वारा उत्पंन किया है, और कार्यात्मक की परिभाषा /morphological राज्यों । हालांकि सामान्यीकृत मैक्रोफेज कार्यों अक्सर सीएनएस परिदृश्य के भीतर आश्चर्यजनक तरीके से बाहर खेलने के लिए, microglia खुद को अत्यधिक विशिष्ट हैं, एक ramified आकृति विज्ञान और एक अद्वितीय जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर का प्रदर्शन है कि उन्हें अन्य ऊतकों से अलग सेट मैक्रोफेज6. Microglia एक वंश है कि सबसे अंय ऊतक मैक्रोफेज से अलग है; वे आदिम hematopoiesis और स्वयं जीवन भर में एक प्रारंभिक भ्रूण की लहर के दौरान सीएनएस उपनिवेश, निश्चित hematopoiesis7से योगदान से स्वतंत्र । वयस्क microglia का पूर्णतः परिपक्व जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर द्वितीय जन्मोत्तर सप्ताह८तक प्राप्त नहीं होता है. आसपास के ऊतकों से पर्यावरण cues एक प्रमुख भूमिका निभाते ऊतक-विशिष्ट मैक्रोफेज सुविधाओं6, जो सीएनएस में रक्त जनित कारकों रक्त मस्तिष्क बाधा9द्वारा दी के लिए सीमित जोखिम भी शामिल है.

एक बाधा पूरी तरह से सीएनएस homeostasis और रोग के लिए microglial योगदान को समझने के लिए recapitulating की कठिनाई परिपक्व microglia के विशेष गुणों के साथ vivo में देखा है इन विट्रो में शुद्ध कोशिकाओं । कई तरीकों को अलग और संस्कृति बरकरार microglia विकसित किया गया है, लेकिन सबसे दृष्टिकोण सीरम पर भरोसा करने के लिए सेल अस्तित्व का समर्थन । हमें पता चला है कि इसके अलावा के सीरम, जो एक स्वाभाविक चर reएजेंट है जिसमें एक विशाल सरणी के साथ सक्रिय अणुओं, विशेष रूप से समस्याग्रस्त है जब microglia के साथ काम कर क्योंकि यह एक amoeboid आकृति विज्ञान, वृद्धि प्रसार को बढ़ावा देता है, और वृद्धि हुई phagocytosis9 अक्सर vivo में देखा जब microglia रक्त मस्तिष्क बाधा के विघटन के बाद रक्त जनित कारकों को उजागर कर रहे हैं । इन मैट्रिक्स के द्वारा, सीरम उजागर कोशिकाओं चोट या रोग राज्यों में microglia के समान है, लेकिन इस तरह के परिवर्तन जब microglia सीएसएफ-1 (या IL-34), TGF-β, कोलेस्ट्रॉल, और selenite युक्त परिभाषित विकास माध्यम में प्रसंस्कृत कर रहे हैं कम कर रहे हैं ।

इस प्रोटोकॉल सीरम मुक्त शर्तों के तहत संवर्धन किशोर चूहे microglia के लिए विवरण प्रदान करता है, हाल ही में प्रकाशित काम9से संबंधित । इस प्रोटोकॉल जन्मोत्तर दिवस 21-30 (P21-P30) से चूहों के लिए सुव्यवस्थित किया गया है, लेकिन चूहों और किसी भी उम्र के चूहों से microglia को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि उपज और समग्र व्यवहार्यता प्रजातियों और जानवर की उम्र के आधार पर भिन्न होगा. अधिक पैदावार और इष्टतम व्यवहार्यता जब थोड़ा अपरिपक्व microglia (~ P9), पैदावार और व्यवहार्यता के साथ-धीरे वयस्क पशुओं में कुछ निचले स्तर के लिए पतला का उपयोग कर हासिल की है । Microglia भी चूहों से पृथक किया जा सकता है, लेकिन हमने पाया है कि चूहे की कोशिकाओं को काफी अधिक पैदावार, व्यवहार्यता, और ramified morphologies की जटिलता, जब सीरम मुक्त संस्कृतियों में माउस कोशिकाओं की तुलना में दिखाते हैं । P50 से अधिक आयु वर्ग के पशुओं इस प्रोटोकॉल के साथ मूल्यांकन नहीं किया गया है । यह immunopanning आइसोलेशन प्रक्रिया अलगाव के दौरान microglial transcriptional प्रोफाइल में परिवर्तन को कम करने के लिए और कोशिकाओं के बहाव व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया गया है । इन तकनीकों और मीडिया योगों का प्रयोग, उच्च व्यवहार्यता प्राथमिक संस्कृतियों हफ्तों के लिए निरंतर किया जा सकता है । Microglia इन शर्तों के तहत प्रसंस्कृत एक उच्च ramified तेजी से विस्तार और प्रक्रियाओं के कर्षण और प्रसार के अपेक्षाकृत कम दरों को शामिल आकृति विज्ञान प्रदर्शन । हम इन संपत्तियों पर सीरम जोखिम के महत्व पर प्रकाश डाला, और इस विधि के अंय दृष्टिकोण के सापेक्ष ताकत और कमजोरी पर चर्चा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रक्रियाओं को शामिल कुतर स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों के अनुरूप है, जो राष्ट्रीय और राज्य के कानूनों और नीतियों का अनुपालन । सभी पशु प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु देखभाल पर स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के प्रशासनिक पैनल द्वारा अनुमोदित किया गया ।

नोट: सभी समाधान और बफर रचनाएं सामग्री की तालिकामें प्रदान की जाती हैं ।

1. CD11b Immunopanning के लिए एक पेट्री डिश तैयार (0 दिन)

नोट: हर 1-2 किशोर चूहे दिमाग के लिए 1 immunopanning डिश तैयार करें ।

  1. एक 15 सेमी पेट्री डिश के लिए 50 मिमी Tris पीएच 9.5 समाधान के 25 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. 6 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए पकवान के लिए बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल जंजीरों) जोड़ें । भंवर थाली समान रूप से वितरित करने के लिए ।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 ज के लिए पकवान मशीन ।
  4. बर्तन कुल्ला DPBS के साथ तीन बार+ + (फॉस्फेट-बफर (पंजाब) Ca के साथ2 + और मिलीग्राम2 +), तो 1 µ g/एमएल OX42 एंटीबॉडी युक्त बफर panning के एक समाधान के साथ बदलें । एक सपाट सतह पर कमरे के तापमान पर रात भर पकवान छोड़ दें ।

2. टिशू कलेक्शन (Day 1)

नोट: यह प्रोटोकॉल लेना चाहिए ~ 3-4 h ।

  1. शुरुआत से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी समाधान बाँझ और बर्फ पर ठंडा कर रहे हैं । बर्फ पर सभी उपकरणों चिल और इथेनॉल का उपयोग करने से पहले के साथ निष्फल ।
  2. उपयुक्त विनियामक प्रक्रियाओं के बाद, कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation द्वारा एक किशोर प्रयोगशाला चूहे बलिदान ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, छोटे जानवरों ketamine/xylazine की एक घातक खुराक के साथ बलिदान किया जा सकता है (24 मिलीग्राम/एमएल ketamine, 2.4 मिलीग्राम/एमएल xylazine) के 100-200 µ एल । Ketamine/xylazine इस्तेमाल किया जाना चाहिए अगर जानवरों से कम उंर के 14 दिन हैं । कई जानवरों का उपयोग करते हैं, तो एक जानवर से ऊतक निकालने और बाद में जानवरों के लिए आगे बढ़ने से पहले बर्फ पर पूर्व ठंडा DPBS+ + में जगह ।
  3. एक hindpaw चुटकी और आगे बढ़ने से पहले जानवर से पूर्ण निष्क्रियता सुनिश्चित करते हैं ।
  4. Transcardially perfuse बर्फ के 10-30 मिलीलीटर के साथ पशु शीत छिड़काव बफर एक 27 ½-जी सुई का उपयोग कर जब तक बफर स्पष्ट चलाता है ।
    नोट: छिड़काव बफर की मात्रा पशु के आकार के आधार पर भिन्न हो जाएगा/
  5. इसके तुरंत बाद छिड़काव से पशु का सिर निकाल लें । रीढ़ की हड्डी से में आ रहा है पश्चकपाल condyle कट के साथ हर तरफ विच्छेदन कैंची, मस्तिष्क को नुकसान नहीं सावधान रहना । हर तरफ ध्यान से काटने के बाद, नाक की हड्डी की ओर पार्श्विका और ललाट की हड्डी के साथ एक तरफ काट । संदंश ध्यान से खोपड़ी के ऊपर वापस खींच, जल्दी से मस्तिष्क (या ब्याज की सीएनएस संरचनाओं) को दूर, और बर्फ पर पूर्व ठंडा DPBS में जगह+ + ।
  6. शेष सभी जानवरों के लिए दोहराएँ ।
    नोट: सभी कार्यवाही कदम उचित बाँझ शर्तों के तहत एक लामिना प्रवाह हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

3. यांत्रिक पृथक्करण (Day 1)

  1. सब के बाद दिमाग एकत्र किया गया है, एक ठंडा स्केलपेल ब्लेड के साथ बर्फ पर एक पेट्री डिश में 1 मिमी3 हिस्सा में एक मस्तिष्क काटना, और 5-7 मिलीलीटर बर्फ ठंडा douncing बफर के साथ एक बर्फ ठंडा dounce homogenizer के लिए स्थानांतरण । एक समय में एक मस्तिष्क अलग कर देना ।
  2. अलग कर देना एक ढीला ढाले dounce homogenizer के साथ 10-20 कोमल और अधूरा स्ट्रोक का उपयोग ऊतक । सीधे homogenizer के तल पर ऊतक को कुचलने के लिए नहीं ध्यान रखना है, लेकिन बजाय पिस्टन और homogenizer के पक्षों के बीच अंतरिक्ष के माध्यम से ऊतक प्ररित ।
  3. ध्यान से पिस्टन हवा बुलबुले की शुरूआत को रोकने के लिए निकालें । खराब असंबद्ध ऊतक हिस्सा homogenizer के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, और एक नया ठंडा 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
  4. ताज़ा douncing बफ़र के साथ निकाली गई मात्रा बदलें, और चरण 3.2 और 3.3 3-4 राउंड की कुल के लिए दोहराएं, या जब तक सभी ऊतक असंबद्ध किया गया है । प्रत्येक मस्तिष्क के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ ।

4. Myelin निर्मूलन (Day 1)

नोट: Myelin हटाने P12 से पुराने पशुओं से microglia के अलगाव के लिए प्रयोग किया जाता है ।

  1. एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल निलंबन की मात्रा को मापने, तो ३३.५ मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा को समायोजित करने के लिए बर्फ शीत douncing बफर जोड़ें ।
  2. सेल सस्पेंशन करने के लिए myelin जुदाई बफर (MSB) के 10 मिलीलीटर जोड़ें और ट्यूब कई बार पलटने से अच्छी तरह से मिश्रण । यह ४३.५ मिलीलीटर की मात्रा में MSB के 23% अंतिम एकाग्रता में परिणाम होगा ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x g पर 15 मिनट के लिए धीमी ब्रेक लगाना के साथ कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    नोट: धीमा के लिए लगभग 1.5-2 मिनट लेना चाहिए । यह myelin और मृत कोशिका मलबे, एक कुछ संदिग्ध supernatant, और एक छोटे गोली है कि जीवित कोशिकाओं के लिए समृद्ध है की एक ऊपरी परत उत्पंन होगा ।
  4. myelin/मलबे और एक पिपेट के साथ supernatant की ऊपरी परत निकालें । ध्यान रखना जब शीर्ष परत को हटाने के रूप में यह सुनिश्चित करने के लिए जितना संभव हो हटा दिया है ।
  5. बफर panning के 12 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड । धीरे कक्ष निलंबन triturate कोशिकाओं है कि रह सकता है के किसी भी झुरमुट को तोड़ने के लिए ।

5. Immunopanning (Day 1)

  1. बड़े मलबे या सेल के झुरमुट को हटाने के लिए 70-µm सेल छलनी के माध्यम से सेल सस्पेंशन पास करें ।
  2. DPBS के साथ OX42-लेपित panning डिश तीन बार कुल्ला+ +। प्लेट धोने के बीच पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति न दें ।
  3. पिछले DPBS बंद डालो+ + धो और panning पकवान के लिए फ़िल्टर किए गए सेल निलंबन लागू होते हैं । धीरे कोशिकाओं को वितरित करने के लिए थाली घूमता है, तो 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक फ्लैट की सतह पर थाली गर्मी कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति है । अब 20 मिनट या कोशिकाओं से अधिक गर्मी नहीं पकवान से उबरने के लिए बहुत मुश्किल हो जाएगा ।
  4. DPBS के साथ panning डिश कुल्ला+ + 10 बार गैर अनुयाई कोशिकाओं को दूर करने के लिए । Microglia मजबूती से थाली से जुड़ी होगी, इसलिए अन्य गैर-अनुयाई कोशिकाओं को हटाने को सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक कुल्ला के साथ थाली घूमता है ।
  5. पिछले DPBS बंद डालो+ + धो और 15 मिलीलीटर DPBS+ + और 200 μL trypsin (1.25% शेयर समाधान) के साथ बदलें ।
  6. 10% सह के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ≤ 10 मिनट के लिए पकवान की मशीन2 trypsinize के लिए ।
    नोट: 10 मिनट से अधिक समय तक जारी नहीं रखें या microglia निकालना कठिन हो जाएगा ।
  7. trypsinization के 10 मिनट के बाद, microglia अभी भी थाली के लिए अटक जाएगा । बंद डालो trypsin/DPBS+ + और धीरे DPBS के साथ 2x धो+ + trypsin को दूर करने के लिए, बर्फ की 12 मिलीलीटर-शीत microglia विकास माध्यम (एमजीएम) के साथ प्रतिस्थापित करें ।
  8. 2 मिनट के लिए बर्फ पर panning डिश प्लेस सेल/सब्सट्रेट बातचीत को कमजोर करने में मदद करने के लिए, और सुनिश्चित करें कि पकवान बाहर सुखाने से panning पकवान के क्षेत्रों को रोकने के लिए सपाट है ।
  9. panning पकवान से कोशिकाओं को ठीक करने के लिए उच्च गति पर एक 10 मिलीलीटर पिपेट और प्लास्टिक नियंत्रक के साथ जोरदार पिपेट. पिपेट से तरल की धारा के साथ एक 16 x 16 ग्रिड ड्रा करने के लिए प्रयास करें और सभी कोशिकाओं को दूर ।
  10. सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं थाली से अलग है बनाने के लिए 20X आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच करें । डिश के शीर्ष पर स्पॉट मार्क जहां कोशिकाओं अभी भी अटक रहे हैं, और दोहराने pipetting उन क्षेत्रों में ।
  11. सेल सस्पेंशन और 15 एमएल शंकु ट्यूब प्रति supernatant की aliquot 3-4 मिलीलीटर ले लीजिए । धीमी ब्रेक लगाना के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x g पर 15 मिनट के लिए स्पिन ।
    नोट: एक छोटी मात्रा के माध्यम से microglia कताई कोशिकाओं की अधिकतम वसूली के लिए अनुमति देता है ।
  12. महाप्राण ने supernatant को सेल की गोली के साथ एमजीएम के 0.5 एमएल छोड़े ।
  13. शेष एमजीएम में प्रत्येक गोली reसस्पेंड, और पूल सभी ट्यूबों से कोशिकाओं ।
  14. hemocytometer के साथ कोशिकाओं गिनती ।
  15. अनुप्रयोग के आधार पर चरण 6-7 में वर्णित के रूप में प्लेट कक्ष ।
  16. 10% सह के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं2.
    नोट: कक्ष नियमित रूप से मीडिया में परिवर्तन या कोई मीडिया परिवर्तन के साथ एक सप्ताह के साथ 3-4 सप्ताह तक के लिए संस्कृति हो सकता है ।

6. स्पॉट कोटिंग टिशू कल्चर प्लेट्स/Coverslips (Day 1)

  1. प्लेट 15 कोलेजन IV कोटिंग के µ एल सीधे एक 24 के केंद्र में अच्छी तरह से anionic/cationic लेपित ऊतक संस्कृति प्लेट (देखें विवरण के लिए सामग्री की तालिका ) और 15 मिनट के लिए 10% CO2के साथ 37 ° c में मशीन ।
  2. hemocytometer के साथ कोशिकाओं को कमजोर कोशिकाओं की गिनती के बाद एमजीएम में 2.3 x 105/mL. महाप्राण कोलेजन चतुर्थ स्थान और तुरंत इस मौके पर सेल निलंबन के 15 µ एल प्लेट; यह 3.5 x 103 कोशिकाओं को हाजिर/ 10% co2 के साथ 37 ° c पर 5-10 मिनट के लिए मशीन कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति देने के लिए, सह के 500 µ एलजोड़ें-equilibrated TGF-β2/IL-34/कोलेस्ट्रॉल युक्त विकास मध्यम (टिक) धीरे से अच्छी तरह से करने के लिए ।
  3. यदि coverslips पर चढ़ाना, पहले कोट बाँझ गिलास coverslips के साथ 10 µ जी/एमएल सँगै-डी-lysine (PDL) में एच2ओ के लिए 1 ज, एच2ओ के साथ 3 बार धो, और यूवी प्रकाश के तहत एक हुड में सूख जाते हैं । एक बार coverslips शुष्क कर रहे हैं, के रूप में coverslips पर स्थान चढ़ाना के साथ आगे बढ़ना चरण 6.2 में वर्णित है ।

7. आरएनए के लिए चढ़ाना/

  1. 1 दिन पर, कोट 24 के पूरे क्षेत्र में अच्छी तरह से anionic/cationic लेपित ऊतक संस्कृति प्लेट कोलेजन IV कोटिंग और 10 मिनट के लिए मशीन के साथ-37 ° c पर 10% CO2के साथ 1 ज, उसके बाद निकालें और तुरंत प्लेट 3-5 x10 4 कोशिकाओं में अच्छी तरह सेसह 2 equilibrated टिक मीडिया ।
  2. दिन 2 पर, तैयारी के बाद एक अच्छी तरह से दिन के लिए एक 50% मीडिया परिवर्तन करते हैं । मृत कोशिकाओं को अच्छी तरह से केंद्र में क्लस्टर करते हैं, तो वहां से मीडिया ले ।
  3. प्रदर्शन एक 50% मीडिया हर 2-3 दिनों में परिवर्तन संस्कृतियों बनाए रखने के लिए । यदि मीडिया परिवर्तन संस्कृतियों के लिए एक अवांछित चर परिचय, कोशिकाओं को लगभग 1 सप्ताह के लिए किसी भी मीडिया में परिवर्तन के बिना जीवित रह सकते हैं, के रूप में नियमित रखरखाव के साथ 3 सप्ताह से अधिक का विरोध किया ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल किशोर चूहों से उच्च शुद्धता ramified microglia संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन । इसी तरह के परिणाम अपरिपक्व, प्रसवकालीन और वयस्क जानवरों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में नीचे चर्चा की । सेल अलगाव के बाद से अक्सर सूक्ष्म बारीकियों और कोशिकाओं को मरने के लिए कई अवसर शामिल हैं, हम विभिंन चरणों में सफलता का निर्धारण करने में मदद करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों का इस्तेमाल किया । हम आमतौर पर आइसोलेशन प्रोटोकॉल (चित्र 1a) में एकाधिक चरणों में hemocytometer का उपयोग करके कक्ष निलंबनों की निगरानी करते हैं । सफल अलगाव 2.5-5 x 105 कोशिकाओं/किशोर जानवर उपज चाहिए । P7 से पशु-P15 दिखाने के लिए करीब 5 x 105 कोशिकाओं/पशु, जबकि P30 दिखाने की पैदावार से पुराने पशुओं से अलग कोशिकाओं को करीब 2.5 x 105 कोशिकाओं/ प्रोटोकॉल भर में कुल कोशिका गिनती की निगरानी से परे, यह अलग कोशिकाओं है, जो मुश्किल हो सकता है के समग्र स्वास्थ्य का निर्धारण महत्वपूर्ण है क्योंकि microglia इस तरह से अलग संस्कृति में पहले कुछ दिनों के दौरान एक गोल या द्विध्रुवी आकृति विज्ञान है . यहां, हम में P25 microglia के चरण छवियां शामिल है पहले 6 दिनों के दौरान में अलगाव के बाद और टिक 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) युक्त (आंकड़ा 1b) ।

Figure 1
चित्रा 1: अलगाव प्रोटोकॉल के दौरान और संस्कृति के 6 दिनों में सेल स्वास्थ्य का मूल्यांकन । (A) चरण-कंट्रास्ट छवियां जो कक्ष आइसोलेशन प्रक्रिया के निर्दिष्ट चरणों में गुणवत्ता-नियंत्रण चौकियों को दर्शाती हैं । सेलुलर सस्पेंशन एक hemocytometer पर लदान से पहले 0.4% trypan नीले रंग के 1 µ एल के साथ सेलुलर निलंबन के 9 µ एल मिश्रण से imaged थे । अन्य छवियों panning पकवान ही दिखाने के लिए, और सभी छवियों 20X आवर्धन पर एक क्षेत्र के रूप में दिखाए जाते हैं. स्केल बार, 200 µm. एमजीएम, microglia ग्रोथ मीडियम. (ख) microglial रूपात्मक परिवर्तन और सीरम मुक्त टिक विकास मध्यम या टिक प्लस 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) में संस्कृति के 6 दिनों में प्रसार के समय पाठ्यक्रम । CD11b-immunopanned कोशिकाओं की जगह कोलेजन-लेपित anionic/cationic लेपित ऊतक संस्कृति प्लेट पर चढ़ाया गया (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें), और एक ही क्षेत्र चरण द्वारा imaged था इसके विपरीत हर 24 ज. स्केल बार, 100 µm. टिक, TGF-β2/IL-34/ कोलेस्ट्रॉल युक्त विकास माध्यम. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

स्वास्थ्य और पृथक कोशिकाओं की व्यवहार्यता का नियमित मूल्यांकन reproducibility और प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है । यहां हम दिखाने के microglia एक P21 पशु से पृथक एमजीएम में संस्कृति, टिक, या टिक के साथ पूरक 10% FCS 7 दिनों के बाद इन विट्रो में (DIV) एक व्यवहार्यता परख के साथ । यदि अलगाव सफल रहा था, संस्कृतियों के बीच 80-90% व्यवहार्यता में टिक के बाद 7 DIV । प्रसंस्कृत कोशिकाओं सीरम की उपस्थिति अंततः इस उपाय से 100% व्यवहार्यता के पास चढ़ाई करने के लिए, लेकिन यह कृत्रिम रूप से दोनों तेजी से प्रसार द्वारा फुलाया है सीरम उजागर कोशिकाओं और इन संस्कृतियों के भीतर मृत कोशिकाओं के तेजी से phagocytosis (चित्रा 2a). मजबूत अस्तित्व के अलावा, टिक कल्चरल कोशिकाओं को भी एक ramified आकृति विज्ञान दिखाने के लिए जब FCS इलाज कोशिकाओं की तुलना में (चित्र बी, सी).

Figure 2
चित्रा 2: एमजीएम में microglia की उत्तरजीविता, टिक या टिक + संस्कृति में सात दिनों से अधिक FCS. (A) कोशिकाएं P21 चूहों से पृथक की गई और microglia विकास माध्यम (एमजीएम) में कल्चर्ड, TGF-β2/IL-34/कोलेस्ट्रॉल युक्त विकास मध्यम (टिक), या टिक + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) । प्रत्येक समय बिंदु पर, संस्कृति मध्यम calcein AM के साथ पूरक था (1.33 µ m अंतिम) और ethidium homodimer (2.5 µ m अंतिम) 15 मिनट के लिए क्रमशः लेबल जीवित कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं के लिए. एक स्वचालित ImageJ स्क्रिप्ट का उपयोग करते हुए प्रत्येक फ़ील्ड में कक्षों की गणना की गई । (ख और ग) के बाद 7 DIV, कोई मीडिया में परिवर्तन के साथ, (ख) टिक या 10% FCS (ग) के साथ पूरक टिक कोशिकाओं के ऊपर के रूप में रहते है और मृत कोशिकाओं लेबल दाग थे । प्रतिनिधि छवियां एक 10x (बाएं) या 40X (सही) उद्देश्य का उपयोग कर लिया गया । स्केल बार, 40 µm. त्रुटि पट्टियों माध्य (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा Bohlen एट अल से संशोधित किया गया था । 9 और अनुमति के साथ उपयोग किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

आदेश में सफल अलगाव और अत्यधिक शुद्ध microglia की संस्कृति को प्रदर्शित करने के लिए, हम P21 चूहों से microglia अलग और 8 दिनों के लिए 10% FCS के साथ पूरक टिक या टिक में इन कोशिकाओं को प्रसंस्कृत । कोशिकाओं को फिर तय किया गया और microglial मार्करों (आईबीए-1 और CD11b) और प्रसार मार्कर (Ki67, चित्रा 3) के साथ दाग । सेल मार्कर के लिए दाग के अलावा, आरएनए-हौसले से पृथक कोशिकाओं पर seq कोशिकाओं की आरएनए प्रोफ़ाइल का मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली और संवेदनशील उपकरण प्रदान करता है, और संस्कृतियों की शुरुआत पवित्रता को सूचित करने में मदद कर सकते हैं कर सकते हैं. CD11b immunopanning आमतौर पर CD11b+ न्यूट्रोफिल/monocyte carryover के अलावा CD11b+ microglia (चित्र बी) के एक छोटे प्रतिशत में परिणाम है । इन कोशिकाओं के कुछ दिनों के बाद टिक में मर जाएगा, लेकिन पहले समय अंक का विश्लेषण जटिल कर सकते हैं ।

Figure 3
चित्रा 3: immunohistochemistry और आरएनए-seq द्वारा मूल्यांकन के रूप में प्रसंस्कृत कोशिकाओं की पवित्रता. (A) Microglia P21 चूहों से अलग किया गया, PDL पर चढ़ाया/कोलेजन लेपित ग्लास coverslips और TGF में कल्चर्ड-β2/IL-34/कोलेस्ट्रॉल युक्त विकास मध्यम (टिक) 8 दिनों के लिए । कोशिकाओं को 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए तय किया गया था और इस आईबीए-1 (1:500), CD11b (1:1500), और Ki67 (1:500) के साथ प्रतिरक्षा दाग । संक्षेप में, निश्चित कोशिकाओं 0.1% डिटर्जेंट के साथ अवरुद्ध (विवरण के लिए तरीके तालिका देखें) और 10% सामांय गधा सीरम (NGS) 1 के लिए कमरे के तापमान पर एच थे । कोशिकाओं तो 1% NGS के साथ 0.1% डिटर्जेंट में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की मशीन थे । सेल 5 मिनट के लिए तीन बार धोया पंजाब में प्रत्येक थे । कोशिकाओं तो माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 1% NGS के साथ 0.1% डिटर्जेंट में सभी 1:500 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मशीन थे । कोशिकाओं को फिर से तीन बार पंजाब में धोया और DAPI-युक्त बढ़ते माध्यम के साथ बढ़ रहे थे । प्रतिनिधि छवियों 40X आवर्धन पर ले जाया गया । स्केल बार, 50 µm. (ख) प्रतिनिधि कक्ष की अभिव्यक्ति-नए सिरे से पृथक और प्रसंस्कृत कोशिकाओं द्वारा प्रकार विशिष्ट टेप । Microglia P21 चूहों और आरएनए अलगाव और आरएनए-seq के लिए immunopanning डिश से सीधे लीजड ड से अलग-थलग थे. अन्य प्रमुख सीएनएस सेल प्रकारों (astrocytes, न्यूरॉन्स, oligodendrocytes, और endothelial कोशिकाओं) के मार्करों को न्यूनतम संदूषण दिखाएँ CD11b-immunopanned कोशिकाओं । न्युट्रोफिल मार्कर हौसले से अलग कोशिकाओं (काला) में पाए जाते हैं, लेकिन सीरम मुक्त संस्कृतियों (ग्रे) में खो रहे हैं । कल्चरल सेल आम मैक्रोफेज मार्कर के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं, लेकिन विशेष microglial हस्ताक्षर को परिभाषित करने वाले मार्कर जल्दी से कल्चरल सेल द्वारा downregulated जाते हैं । त्रुटि पट्टियां माध्य (SEM) के मानक त्रुटि दर्शाती हैं । डेटा Bohlen एट अल से संशोधित कर रहे हैं । 9 और अनुमति के साथ उपयोग किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

व्यवहार्यता और सेल मार्करों के लिए धुंधला अस्तित्व और कोशिकाओं की पवित्रता के निर्धारण के लिए अनुमति देता है, लेकिन संस्कृति की गतिशीलता पर सीमित जानकारी प्रदान करता है । यहां हम P21 चूहे microglia के एक समय चूक फिल्म के बाद उपलब्ध कराई है टिक में 14 DIV । दो सप्ताह के बाद, सीरम मुक्त संस्कृतियों तेजी से प्रक्रिया एक्सटेंशन और पकवान भर में reकर्षण के साथ गतिशील निगरानी व्यवहार, शो ( फिल्म 1देखें) । इसके अतिरिक्त, हम पहले पाया है कि सीरम जोखिम microglia के इन आराम राज्य गुण, स्थाई रूपात्मक और phagocytic परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप बदल जाता है । हम microglia के एक फिल्म टिक में 5 दिनों के लिए, तो 10% FCS के संपर्क में शामिल है ( फिल्म 2देखें) ।

Movie 1
मूवी 1: परिभाषित मध्यम microglia संस्कृतियों गतिशील प्रक्रियाओं के साथ ramified आकृति विज्ञान दिखाएँ। Microglia एक P21 चूहा, कोलेजन पर चढ़ाया-लेपित anionic/cationic लेपित ऊतक संस्कृति प्लेटें से अलग थे, और टिक में 14 दिनों के लिए संस्कृति । पर 14 DIV, छवियां हर 3 मिनट एकत्र किए गए । फिल्म 6 फ्रेम में खेलता है/एस, और कम दाएं कोने में टाइमस्टैंप h:min. फिल्म में इमेजिंग की अवधि को नोट Bohlen एट अल से reproduced है । 9 और अनुमति के साथ उपयोग किया गया । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
मूवी 2: सीरम जोखिम परिभाषित मध्यम microglial संस्कृतियों में एक तेजी से रूपात्मक परिवर्तन से चलाताहै । Microglia एक P21 चूहा, कोलेजन पर चढ़ाया-लेपित anionic/cationic लेपित ऊतक संस्कृति प्लेटें से अलग थे, और टिक में 5 दिनों के लिए संस्कृति । 5 DIV पर, छवियां हर 5 मिनट में एकत्र किए गए थे । आधारभूत गतिशीलता/आकृति विज्ञान दर्ज किया गया था, तो 2:55 पर (2 एच, 55 मिनट), एक 50% मीडिया परिवर्तन के लिए 10% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए FCS जोड़ने के लिए किया गया था । कोशिकाओं को एक अतिरिक्त 7 एच के लिए imaged थे । फिल्म 6 फ्रेम में खेलता है/एस, और कम सही कोने में टाइमस्टैंप h:min. में इमेजिंग की अवधि को नोट कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

क्योंकि microglia सीएनएस के प्रहरी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में सेवा, वे अत्यधिक पर्यावरण परिवर्तन के लिए उत्तरदायी हैं; इसलिए, महान देखभाल के लिए अपने अलगाव और संस्कृति8के दौरान कोशिकाओं के भीतर भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को कम करने की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल में गति और तापमान के माध्यम से पूरा किया जाता है । बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को रखते हुए जब भी संभव बहुत सक्रियण कम कर देता है, तो सभी केंद्रापसारक कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह ले, जानवरों बर्फ ठंड छिड़काव बफर के साथ perfused हैं, और प्रोटोकॉल ऊतक के बीच समय को कम करने के लिए सुव्यवस्थित किया गया है निष्कर्षण और कोशिकाओं के संवर्धन । यदि हौसले से अलग कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन, फसल सेल lysates सीधे CD11b immunopanning डिश से पहले trypsinization के लिए एक ंयूनतम पर अलगाव प्रेरित परिवर्तन रखने के लिए । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यहां तक कि ध्यान से पृथक microglia तुरंत गर्म तापमान में रखा जा रहा है पर एक भड़काऊ प्रतिक्रिया निष्पादित, संभवतः क्षति-संबद्ध संकेतों आंतरिक रूप से अलगाव की प्रक्रिया के साथ जुड़े की मांयता के कारण । यदि प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक किया गया था, 2.5-5 x 105 कोशिकाओं/किशोर चूहे की उंमीद कर रहे हैं ।

यहाँ प्रदान किया गया कक्ष आइसोलेशन प्रोटोकॉल perfused सीएनएस से CD11b + कोशिकाओं को अलग करने के लिए अत्यधिक विशिष्ट है9. हालांकि इस सेल की आबादी microglia के मुख्य रूप से शामिल है, यह भी ऐसे perivascular मैक्रोफेज, मस्तिष्कावरणीय मैक्रोफेज, रंजित जाल मैक्रोफेज, monocytes, और न्यूट्रोफिल10के रूप में अंय माइलॉयड आबादी के निंन स्तर होते हैं । धमनियां संबद्ध माइलॉयड कोशिकाओं को अनिवार्य रूप से मांयता और ऊतक पृथक्करण से पहले रंजित जाल को हटाने के द्वारा समाप्त किया जा सकता है । मेनिन्जेस भी कुछ हद तक हटाया जा सकता है, लेकिन सभी मस्तिष्कावरणीय ऊतक के पूरा उन्मूलन व्यावहारिक नहीं है यहां वर्णित तेजी से अलगाव के लिए लक्षित समय सीमा के भीतर । इसलिए, मेनिन्जेस के अपूर्ण हटाने के कारण परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए, हम मेनिन्जेस को नहीं निकालते हैं । monocytes/न्यूट्रोफिल अलग सामग्री में परिचालित की संख्या को कम करने के लिए, यह भी एक साफ छिड़काव है करने के लिए महत्वपूर्ण है, और हम आम तौर पर खराब perfused है कि ऊतक त्याग । यहां तक कि उत्कृष्ट छिड़काव के साथ, रक्त की निकासी निरपेक्ष नहीं है, के रूप में शुद्ध भर में सेल छर्रों में एरिथ्रोसाइट्स की एक छोटी मात्रा की उपस्थिति से स्पष्ट हो जाएगा. इस प्रकार, monocytes और न्यूट्रोफिल के छोटे स्तर को सह-शुद्ध कर रहे है और हौसले से अलग कोशिकाओं के transcriptomic प्रोफाइल में एक अलग हस्ताक्षर योगदान करते हैं । हालांकि, परिसंचारी कोशिकाओं को जल्दी सीरम मुक्त टिक मीडिया में मर जाएगा और लगातार दूषित पदार्थों का प्रतिनिधित्व नहीं करते, हालांकि वे जीवित रहने और संस्कृतियों युक्त सीरम में पैदा करना जारी रख सकते हैं ।

एक स्वस्थ, व्यवहार्य संस्कृति को प्राप्त करने के लिए एक अंय महत्वपूर्ण बिंदु के लिए यांत्रिक पृथक्करण कदम के दौरान ध्यान रखना है । जबकि douncing कई न्यूरॉन्स, glia, और अन्य सीएनएस कोशिकाओं को मारता है, microglia इस पृथक्करण अपेक्षाकृत नुकसान से बच (हालांकि microglia भी ओवर-douncing द्वारा मारे जा सकते हैं). यदि सही ढंग से किया है, सेल में इस प्रोटोकॉल परिणाम proteolytic पृथक्करण का उपयोग प्राप्त उन से तुलनीय पैदावार, जबकि संभावित रूप से उच्च तापमान पर ऊतक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं से चर पाया परहेज कर रहे हैं । यांत्रिक ऊतक पृथक्करण के लगातार अधूरे दौर प्रदर्शन करके, एकल कोशिकाओं निलंबन से काटा जा सकता है, जबकि समग्र संस्कृति पर यांत्रिक तनाव की मात्रा को कम ।

immunopanning प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक विश्वसनीय और reproducible तरीका microglia अलग है, लेकिन अंय तुलनीय तरीके उपलब्ध हैं । हम चुंबकीय के साथ चुंबकीय अलगाव का उपयोग कर समान परिणाम प्राप्त किया है सक्रिय सेल छंटाई myelin कमी और CD11b चयन । हम यहाँ immunopanning विधि पर ध्यान केंद्रित किया है क्योंकि यह तारीख को उच्चतम गुणवत्ता संस्कृतियों प्रदान की गई है, कम विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और तुरंत संस्कृति से पहले कोशिकाओं को आयरन ऑक्साइड-संयुग्मित एंटीबॉडी के परिचय की आवश्यकता नहीं है. एक और आमतौर पर microglial अलगाव के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण प्रवाह cytometry है, जो कि प्रोटोकॉल में मौजूदा दृष्टिकोण पर एक प्रमुख लाभ है अंय CD11b + माइलॉयड पदार्थों से सतह का उपयोग कर बोना के microglia की शुद्धि के लिए मौजूद TEMEM1198जैसे हस्ताक्षर मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी । हालांकि प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल एक अत्यंत शुद्ध सेल जनसंख्या में परिणाम छंटाई, यह भी कोशिकाओं को अतिरिक्त तनाव लगाता है और कम व्यवहार्यता संस्कृतियों या कम पैदावार में परिणाम हो सकता है । कुल मिलाकर, हम लेबल पर एंटीबॉडी आधारित तरीकों पर ध्यान केंद्रित मुक्त घनत्व केंद्रापसारक और शेक बंद की तैयारी reproducibility और सेल की आबादी की पवित्रता को अधिकतम करने के लिए ।

हालांकि इस प्रोटोकॉल किशोर चूहे microglia की संस्कृति के लिए अनुकूलित है, यह विभिंन युगों से संस्कृति microglia के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; कुल सेल पैदावार 1-2-सप्ताह पुराने चूहों से अधिक से अधिक कर रहे हैं, microglial विस्तार के शिखर के बाद पारित कर दिया है और संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था है कि पुराने ऊतक से कोशिकाओं की वसूली के साथ हस्तक्षेप से पहले । Microglia भी अलग किया जा सकता है और एक उचित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी माउस या मानव epitopes के लिए विशिष्ट के साथ CD11b एंटीबॉडी की जगह द्वारा माउस और मानव ऊतक से संस्कृति । जबकि दोनों माउस और मानव microglia इन संस्कृति शर्तों के तहत जीवित रहते हैं, वे रूपात्मक मतभेद दिखाने जब चूहे की कोशिकाओं की तुलना में । माउस कोशिकाओं को बनाए रखने के एक ramified आकृति विज्ञान, लेकिन कम विस्तृत प्रक्रियाओं है, जबकि मानव कोशिकाओं को एक लगभग समान amoeboid आकृति विज्ञान जब अलग और इस प्रक्रिया के अनुसार संस्कृति ।

पृथक microglia आवश्यक परख के आधार पर विभिंन तरीकों से चढ़ाया जा सकता है । इष्टतम परिणामों के लिए (के रूप में जीवित/मृत परख और रूपात्मक फिल्मों में सचित्र यहां दिखाया गया है), 3.5 x 103 कोशिकाओं थे "स्पॉट" एक 24-अच्छी तरह से anionic/cationic लेपित ऊतक संस्कृति की थाली के केंद्र में चढ़ाया के बाद एक 10-कोलेजन IV के ंयूनतम कोटिंग के रूप में उपर्युक्त प्रोटोकॉल में वर्णित है । वैकल्पिक रूप से, ऐसी आरएनए अलगाव के रूप में कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है, प्रयोगों के लिए, 3-5 x10 4 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली के बाद 1 कोलेजन IV कोटिंग के लिए 10 मिनट चढ़ाया जा सकता है । कोशिकाओं को उच्च घनत्व पर चढ़ाया थोड़ा कम व्यवहार्यता और कम जटिल आकृति विज्ञान जब कोशिकाओं है कि इलाज स्पॉट थे, संभवतः अलगाव के जवाब में स्रावित भड़काऊ संकेतों के प्रभाव के कारण की तुलना में दिखाया । immunohistochemistry या इमेजिंग कांच coverslips की आवश्यकता के लिए, कोशिकाओं का सबसे अच्छा अस्तित्व और आकृति विज्ञान प्रदर्शन जब coverslips पहले PDL के साथ लेपित थे तो कोलेजन IV में लेपित के रूप में ऊपर वर्णित है । शर्तों की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता परख के लिए, सेल व्यवहार्यता भी 96 में उच्च है-अच्छी तरह से या 384-अच्छी तरह से कोलेजन-लेपित प्लेटें । सभी स्थितियों में, कोशिकाओं के दौर या द्विध्रुवी बाहर शुरू, दिन 3-4 के आसपास प्रक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए शुरू, और 5-10 दिन लेने के लिए अधिक से अधिक ramified चित्रा 1और फिल्म 1 में सचित्र आकृति विज्ञान प्रदर्शित करने के लिए.

गतिशील निगरानी व्यवहार और vivo मेंmicroglia आराम करने के लिए समान आकृति विज्ञान प्रदर्शित करता है कि एक संस्कृति में इस प्रोटोकॉल का परिणाम है, इन कोशिकाओं को पूरी तरह से vivo मेंmicroglia के विशेष जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर को बनाए रखने में विफल. लगातार जीन परिवर्तन के कई प्रसंस्कृत कोशिकाओं में मनाया परिवर्तनों को प्रतिबिंबित आम तौर पर भ्रूण या सूजन9सीएनएस में देखा । जैसे, इस प्रोटोकॉल शर्तों microglia की समझ में एक कदम आगे का प्रतिनिधित्व करता है संस्कृति और सीरम में जीवित रहने के लिए आवश्यकता होती है परिवर्तन पैदा की, लेकिन आगे के अध्ययन के लिए बाह्य सीएनएस द्वारा प्रदान संकेतों को समझने की जरूरत है कि ठीक धुन microglial गुण और जीन अभिव्यक्ति ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि अनुसंधान किसी भी व्यावसायिक या वित्तीय संबंधों कि ब्याज की एक संभावित संघर्ष के रूप में लगाया जा सकता है के अभाव में आयोजित किया गया ।

Acknowledgments

इस काम क्रिस्टोफर और दाना रीव फाउंडेशन इंटरनेशनल रिसर्च कंसोर्टियम रीढ़ की हड्डी की चोट पर, डॉ मरियम और शेल्डन जी Adelson मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, JPB फाउंडेशन, बुनियादी अनुसंधान के नोवार्टिस संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था, विंसेंट और स्टेला कोट से उदार योगदान है, और Damon Runyon कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (डीआरजी-2125-12) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat: Sprague-Dawley Charles River Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) Bio-Rad Cat# MCA275R Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1 Abcam Cat# AB5076 Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67 Abcam Cat# AB15580 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 Invitrogen Cat# 11055 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 Invitrogen Cat# A-21203 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 Invitrogen Cat# A-31573 Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining) Thermo Fisher Cat# 28313
Heparan sulfate Galen Laboratory Supplies Cat# GAG-HS01
Heparin Sigma  Cat# M3149
Peptone from milk solids Sigma Cat# P6838
TGF-β2 Peprotech Cat# 100-35B
Murine IL-34 R&D Systems Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol Avanti Polar Lipids Cat# 700000P
Collagen IV Corning  Cat# 354233
Oleic acid Cayman Chemicals  Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid Cayman Chemicals  Cat# 20606
Calcein AM dye Invitrogen Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1 Invitrogen Cat# E1169
DNaseI Worthington Cat# DPRFS
Percoll PLUS GE Healthcare Cat# 17-5445-02
Trypsin Sigma Cat# T9935
DMEM/F12 Gibco Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin Gibco Cat# 15140-122
Glutamine Gibco Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine  Sigma Cat# A9165
Insulin Sigma Cat# 16634
Apo-transferrin  Sigma Cat# T1147
Sodium selenite Sigma Cat# S-5261
DMEM (high glucose) Gibco Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G Southern Biotech Cat# 0100-20 
Poly-D-Lysine  Sigma Cat# A-003-E
Primaria Plates  VWR Cat# 62406-456
Name Company Catalog Number Comments
Stock reagents 
Apo-transferrin Reconstitution: 10 mg/mL in PBS
Concentration used: 1:100
Storage: -20°C
N-acetyl cysteine Reconstitution: 5 mg/mL in H2O
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Sodium selenite Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O
Concentration used: 1:25,000
Storage: -20°C
Collagen IV Reconstitution: 200 μg/mL in PBS
Concentration used: 1:100
Storage: -80°C
TGF-b2 Reconstitution: 2 mg/mL in PBS
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
IL-34 Reconstitution: 200 μg/mL in PBS
Concentration used: 1:1,000
Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Heparan sulfate Reconstitution: 1 mg/mL in H2O
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Heparin Reconstitution: 50 mg/mL in PBS
Concentration used: 1:100
Storage: -20°C
Name Company Catalog Number Comments
Solutions 
Perfusion Buffer Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)
Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++
Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM) Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite
Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2
Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)  Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid
Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  2. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).
  3. Lou, N., et al. Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).
  4. Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).
  5. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  6. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  7. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages. Front Immunol. 6, 486 (2015).
  8. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  9. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  10. Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. Myeloid Cells in the Central Nervous System. Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 133 Microglia सेल संस्कृति मध्यम परिभाषित तंत्रिका विज्ञान मैक्रोफेज सीरम मुक्त Ramified इम्यूनोलॉजी
अलगाव और कुतर Microglia की संस्कृति सीरम मुक्त माध्यम में एक गतिशील Ramified आकृति विज्ञान को बढ़ावा देने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, H. Y., Bohlen, C. J.… More

Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. J. Vis. Exp. (133), e57122, doi:10.3791/57122 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter