Isolasjon og kultur av gnager Microglia å fremme en dynamisk Ramified morfologi i Serum-free Medium

Summary

Innsats for å forstå microglial funksjonen i detalj har blitt hindret av mangelen på microglial kultur modeller som recapitulate egenskapene for eldre i vivo microglia. Denne protokollen beskriver isolasjon og kultur tilnærming beregnet på vedlikeholde robuste overlevelse av svært ramified modent rotta microglia under definert mellomstore forhold.

Abstract

Microglia utgjør 5-10% av alle sentralnervesystemet (CNS) celler og økende grad trekker oppmerksomhet deres bidrag under utvikling, homeostase og sykdom. Selv om makrofager har vært studert i detalj for tiår, spesialiserte funksjoner av microglia, vev-resident makrofager av CNS, har vært i stor grad mystisk, delvis på grunn av begrensninger i kunne recapitulate moden microglial egenskaper i kultur. Her viser vi en ukomplisert prosedyre for rask isolering av ren microglia fra modne gnager hjernen. Vi beskriver også serum-free oppdrettsforholdene som støtter høye nivåer av microglial levedyktighet over tid. Microglia kultivert under disse definert mellomstore forholdene utstilling forseggjort ramified prosesser og dynamisk overvåking atferd. Vi illustrerer noen effekter av serum eksponering på kulturperler microglia og diskutere hvordan disse serum-free kulturer i forhold til både serum-eksponerte kulturer samt microglia i vivo.

Introduction

Som makrofager av CNS parenchyma, microglia samhandle med et stort utvalg av nevrale kretser og glial signalnettverk nettverk. De spiller viktige roller i utviklingen og homeostase i hjernen gjennom synaptic beskjæring, apoptotisk celle klarering og transient interaksjoner med neuronal prosesser^1,2. Microglia er tidlig responders for nevrologiske skader, utvide sine lange, tynne prosesser til lesjon steder å koordinere inflammatorisk svar og begrense blødning^3,4. Endringene i microglial morfologi og funksjon er allestedsnærværende i både akutte og kroniske CNS skader, og microglia utstillingen endret morfologi, lokalisering og uttrykk for inflammatoriske mediatorer i en rekke ulike sykdom stater¹. Menneskelige genetiske studier indikerer at mutasjoner som endrer risiko for nevrodegenerative sykdommer er ofte overveiende eller utelukkende uttrykt av microglia i intakt CNS peker til en avgjørende rolle for microglia i patogenesen ved sykdom eller progresjon⁵ . Gitt deres framtredende i skader og sykdom, er fremme forståelsen av microglial biologi svært viktig for å utvikle nye terapeutiske metoder.

Mange viktige fremskritt til forståelsen av microglial biologi har oppstått ved å ekstrapolere teknikker og mekanismer i studier av andre macrophage befolkningsgrupper inkludert kultur metoder, gene uttrykket profiler og definisjoner av funksjonell / morfologiske stater. Selv om generalisert macrophage funksjoner ofte spilt på overraskende måter i CNS landskapet, microglia er selv høyt spesialiserte, viser en ramified morfologi og en unik gene expression signatur som skiller dem fra andre vev makrofager⁶. Microglia har en slektslinje som er forskjellig fra de fleste andre vev makrofager; de kolonisere CNS under en tidlig embryonale bølge av primitive hematopoiesis og selvstendig fornye gjennom livet, uavhengig av bidrag fra definitive hematopoiesis⁷. Fullt ut modne gene expression signatur voksen microglia oppnås ikke før den andre postnatal uke⁸. Miljømessige signaler fra de omkringliggende vev spiller en viktig rolle i dikterer vev-spesifikke macrophage funksjoner⁶, som i CNS inkluderer begrenset eksponering for blodbårne faktorer gitt av blod - hjerne barrieren⁹.

En helt forstå microglial bidrag til CNS homeostase og sykdom er vanskeligheten av recapitulating spesialiserte egenskapene for eldre microglia sett vivo med renset celler i vitro. Mange metoder har blitt utviklet for å isolere og kultur intakt microglia, men de fleste tilnærminger stole på serum støtte celle overlevelse. Vi har vist at tillegg av serum, som er en iboende variabel reagens som inneholder en rekke bioaktive molekyler, er særlig problematisk når arbeider med microglia fordi den fremmer en amoeboid morfologi, økt spredning, og økt fagocytose⁹ sett ofte i vivo når microglia er utsatt for blod båret faktorer etter avbrudd av blod - hjerne barrieren. Av disse beregningene, serum-eksponert cellene ligner microglia i skade eller sykdom stater, men slike endringer er redusert når microglia er kultivert i definerte vekstmediet som inneholder CSF-1 (eller IL-34), TGF-β, kolesterol og selenitt.

Denne protokollen gir detaljer for dyrking juvenile rotte microglia under serum-free forhold knyttet til nylig publiserte arbeider⁹. Denne protokollen er strømlinjeformet for rotter fra postnatal dag 21-30 (P21 - P30), men kan tilpasses å isolere microglia fra rotter og mus i alle aldre, om avkastning og totale levedyktighet vil variere avhengig av arter og alder på dyret. Maksimal gir og optimal levedyktighet oppnås ved litt umoden microglia (~ P9), gir og levedyktighet gradvis avsmalnende til noe lavere nivåer i voksen dyr. Microglia kan også være isolert fra mus, men vi har funnet at rotte celler Vis betydelig høyere avkastning levedyktighet og kompleksiteten i ramified morphologies, sammenlignet med musen celler i serum-free kulturer. Dyr alderen større enn P50 har ikke blitt evaluert med denne protokollen. Denne immunopanning isolasjon prosedyren er blitt optimert å minimere endringer i microglial transcriptional profiler under isolasjon og å maksimere nedstrøms levedyktigheten til cellene. Bruker disse teknikkene og media formuleringer, kan høy-levedyktigheten primære kulturer opprettholdes i uker. Microglia kultivert under disse forholdene viser en svært ramified morfologi med rask utvidelse og retraksjon av prosesser og lave relativt priser spredning. Vi understreke betydningen av serum-eksponering på disse egenskapene, og diskutere styrkene og svakhetene ved denne metoden i forhold til andre tilnærminger.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer gnagere likedannet Stanford University retningslinjer, som i samsvar med nasjonale og statlige lover og retningslinjer. Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Stanford University's Administrative Panel på laboratoriet Animal Care.

Merk: Alle løsning og buffer komposisjoner er gitt i Tabellen for materiale.

1. klargjør en Petriskål for CD11b Immunopanning (dag 0)

Merk: Forberede 1 immunopanning rett hver 1-2 juvenile rotte hjerner.

1. Legg til 25 mL av 50 mM Tris pH 9,5 løsning i en 15 cm Petriskål.
2. Legge til geit anti-musen IgG (H + L kjeder) parabolen for en siste konsentrasjon av 6 µg/mL. Snurr å jevnt distribuere.
3. Inkuber parabolen for 1-3 h på 37 ° C.
4. Skyll rettene tre ganger med DPBS⁺⁺ (fosfat-bufret saltvann (PBS) med Ca^{2 +} og Mg^{2 +}), deretter erstatte med en løsning av panorering bufferen som inneholder 1 µg/mL OX42 antistoff. La rettene over natten i romtemperatur på en flat overflate.

2. vev samling (dag 1)

Merk: Denne protokollen bør ta ~ 3-4 h.

1. Før du begynner, kan du sikre at alle løsninger er sterile og kjølt på is. Chill alle instrumenter på is og sterilisere med etanol før å bruke.
2. Følgende aktuelle forskriftene, ofre rotte juvenile laboratorium for karbondioksid kvelning.
   Merk: Alternativt yngre dyr kan bli ofret med en dødelig dose av ketamin/xylazine (100-200 µL av 24 mg/mL Ketamin, 2,4 mg/mL xylazine). Ketamin/xylazine må brukes hvis dyrene er mindre enn 14 dager gammel. Hvis bruker flere dyr, ekstra vev fra en dyr og plasser den i pre kjølt DPBS⁺⁺ på is før du fortsetter til etterfølgende dyr.
3. Klemme en hindpaw og sikre fullstendig manglende respons fra dyret før du fortsetter.
4. Transcardially perfuse dyr med 10-30 mL iskald perfusjon buffer bruker en 27½-G nål til bufferen går klart.
   Merk: Volumet av perfusjon buffer varierer avhengig av størrelse/alder på dyret.
5. Umiddelbart etter perfusjon fjerne hodet av dyret. Kommer inn fra ryggmargen kutte i occipital condyle på hver side med disseksjon saks, være forsiktig med å skade hjernen. Etter klipping hver side nøye, kuttet opp en side langs parietal og frontale Ben mot nasal benet. Med tang nøye trekke tilbake toppen av skallen, raskt fjerne hjernen (eller CNS strukturer rundt) og plassere i pre kjølt DPBS⁺⁺ på is.
6. Gjenta for alle gjenværende dyr.
   Merk: Alle fortsetter trinn skal utføres i laminær strømning hette under riktige sterile forhold.

3. mekanisk dissosiasjon (dag 1)

1. Når alle hjerner har blitt samlet, hogge én hjerne i 1 mm³ biter i en Petriskål på is med kaldt skalpell blad og overføre til en iskald dounce homogenizer med 5-7 mL iskalde douncing buffer. Distansere én hjerne samtidig.
2. Distansere vevet med 10-20 milde og ufullstendig slag med et løst sittende dounce homogenizer. Ta vare ikke å knuse direkte vevet nederst på homogenizer, men i stedet tilskynde vevet gjennom avstanden mellom sidene av stempelet og homogenizer.
3. Fjern forsiktig stempelet for å hindre innføring av luftbobler. Tillate dårlig dissosiert vev biter å bosette til bunnen av homogenizer, og overføre nedbryting til en ny kjølt 50 mL konisk tube.
4. Erstatt fjernet volumet med fersk douncing buffer, og gjenta 3.2 og 3.3 totalt 3-4 runder, eller til alle vev har vært atskilt. Gjenta dette for hver hjernen.

4. myelin fjerning (dag 1)

Merk: Myelin fjerning brukes for isolering av microglia fra dyr eldre enn P12.

1. Måle volumet av cellen suspensjon i 50-mL konisk røret med en 25 mL pipette, deretter legge iskalde douncing buffer for å justere det totale volumet til 33,5 mL.
2. Legge 10 mL av myelin separasjon buffer (MSB) til celle suspensjon og blanding grundig ved å snu røret flere ganger. Dette vil resultere i en 23% siste konsentrasjon av MSB i et volum på 43.5 mL.
3. Sentrifuge celler i 15 min 500 x g på 4 ° C med langsom bremsing.
   Merk: Sentrifuge bør ta ca 1,5-2 min til å avta. Dette vil generere en øvre lag av myelin og død celle rusk, en uklar nedbryting og mindre pellets som berikes for levende celler.
4. Fjerne det øverste laget av myelin/rusk og nedbryting med en pipette. Vær forsiktig når du fjerner det øverste laget slik som mye av det er fjernet som mulig.
5. Resuspend celle pellet i 12 mL panorering buffer. Forsiktig triturate celle suspensjon å bryte opp noen klumper av celler som finnes.

5. Immunopanning (dag 1)

1. Cellen suspensjon passere en 70-µm celle sil for å fjerne store vrakgods eller cellen klumper.
2. Skyll OX42-belagt panorering parabolen tre ganger med DPBS⁺⁺. Tillater ikke platen til helt tørt mellom vasker.
3. Hell av siste DPBS⁺⁺ vask og bruke filtrerte celle suspensjon panorering parabolen. Forsiktig swirl platen for å fordele cellene og deretter ruge plate på en flat overflate ved romtemperatur for 20 min slik at cellene å følge. Ruge ikke lenger enn 20 min eller celler vil bli svært vanskelig å gjenopprette fra parabolen.
4. Skyll panorering parabolen med DPBS⁺⁺ 10 ganger for å fjerne ikke-tilhenger celler. Microglia vil være godt festet til platen, så swirl platen med hver skylling for å sikre fjerning av andre ikke-tilhenger celler.
5. Hell av siste DPBS⁺⁺ vask og erstatte med 15 mL DPBS⁺⁺ og 200 μL trypsin (1,25% lager løsning).
6. Inkuber parabolen i ≤10 min på 37 ° C med 10% CO₂ til trypsinize.
   Merk: Fortsette ikke lenger enn 10 min eller microglia vil bli vanskelig å fjerne.
7. Etter 10 min av trypsinization, vil microglia fortsatt være fast til platen. Hell av trypsin/DPBS⁺⁺ og forsiktig vaske 2 x med DPBS⁺⁺ fjerne trypsin, erstatte med 12 mL av iskalde microglia vekst medium (MGM).
8. Panorering rett på isen i 2 minutter er å svekke cellen/substrat samhandling, og kontroller at parabolen flat til hindre områder av panorering parabolen tørker.
9. Pipetter kraftig med en 10-mL pipette og Pipetter kontroller på høy hastighet til å gjenopprette celler fra panorering parabolen. Tegn et 16 x 16 rutenett med strømmen av væske fra pipette å prøve og fjerne alle cellene.
10. Merk cellene under et mikroskop på 20 X forstørrelse å sikre at cellene har løsrevet fra platen. Merk flekker på parabolen der celler er fremdeles stakk, og gjentar pipettering i disse områdene.
11. Samle celle fjæring og aliquot 3-4 mL nedbryting per 15-mL konisk rør. Spinne i 15 min 500 x g på 4 ° C med langsom bremsing.
    Merk: Spinning microglia gjennom små gir maks gjenoppretting av celler.
12. Sug opp nedbryting, forlater 0,5 mL MGM med cellen pellets.
13. Resuspend hver pellet i gjenværende MGM og basseng cellene fra alle rørene.
14. Telle celler med hemocytometer.
15. Plate celler som beskrevet i trinn 6 - 7 avhengig av programmet.
16. Kultur celler på 37 ° C med 10% CO₂.
    Merk: Celler kan være kultur for opp til 3-4 uker med stamgjest media endringer eller en uke uten media endringer.

6. spot belegg vev kultur plater/Coverslips (dag 1)

1. Plate 15 µL av kollagen IV belegg direkte i midten av en 24-og anionic/kationisk belagt vev kultur plate (se Tabell for materiale for detaljer) og Inkuber i 15 min på 37 ° C med 10% CO₂.
2. Etter å telle celler med hemocytometer fortynne celler til 2,3 ganger 10⁵/mL i MGM. Sug opp kollagen IV spot og umiddelbart plate 15 µL av cellen suspensjon til dette stedet; Dette vil gi 3,5 x 10³ celler/plass. Inkuber i 5-10 min på 37 ° C med 10% CO₂ slik at cellene å overholde, legge til 500 µL av CO_{2 -}equilibrated TGF-β2/IL-34/kolesterol inneholder oppblomstringen medium (TIC) forsiktig til brønnen.
3. Hvis plating på coverslips, første strøk sterilt glass coverslips med 10 µg/mL knep-D-lysine (PDL) i H₂O 1t på RT, vask 3 ganger med H₂O og la tørke i hette under UV-lys. Når coverslips er tørr, Fortsett med spot plating på coverslips som beskrevet i trinn 6.2.

7. plating RNA/Protein isolering

1. På dag 1, pels hele området i en 24-og anionic/kationisk belagt vev kultur plate med kollagen IV belegg og ruge for 10 min - 1 t på 37 ° C med 10% CO₂, og fjerne og umiddelbart plate 3-5 x 10⁴ celler/godt i CO₂ equilibrated TIC medier.
2. På dag 2, utføre en 50% media endring for hver Vel dagen etter tilberedning. Døde celler tendens til å klynge midt i brønnen, så ta media derfra.
3. Utføre en 50% media endring hver 2-3 dager for å opprettholde kulturer. Hvis media endringene introdusere en uønsket variabel for kulturer, kan celler overleve i ca 1 uke uten endringer media, i motsetning til over 3 uker med regelmessig vedlikehold.

Representative Results

Denne protokollen beskriver en metode å kultur høy renhetsgrad ramified microglia fra juvenile rotter. Lignende resultater kan oppnås ved hjelp av umodne, perinatal og voksen dyr, som beskrevet nedenfor. Siden cellen isolasjoner ofte inkluderer nyansene og mange muligheter for cellene å dø, brukte vi kvalitetskontroll sjekkpunkter for å finne suksess på trinnene. Vi vanligvis overvåket celle suspensjoner bruker en hemocytometer på flere trinn i isolasjon protokollen (figur 1A). Vellykket isolasjoner skal gi 2.5-5 x 10⁵ celler/juvenile dyr. Dyr fra P7 - P15 viser gir nærmere 5 x 10⁵ celler/dyr, mens celler isolert fra dyr eldre enn P30 Vis gir nærmere til 2,5 x 10⁵ celler/dyr. Utover overvåking total-celle teller i protokollen, er det viktig å tilstandsrapport isolert celler, som kan være vanskelig fordi microglia isolert på denne måten har en avrundet eller bipolar morfologi de første dagene i kultur . Her har vi inkludert fase bilder av P25 microglia i kultur i løpet av første 6 dager etter isolasjon i TIC og TIC som inneholder 10% fosterets kalv serum (FCS) (figur 1B).

Figur 1: evaluering av cell helse under isolasjon protokollen og over 6 dager kultur. (A) fase kontrast bilder illustrerer kvalitetskontroll kontrollpunkter på de angitte trinnene av cellen isolasjon prosedyren. Mobilnettet suspensjoner ble fotografert ved å blande 9 µL av mobilnettet suspensjon med 1 µL av 0,4% trypan blå før lasting på en hemocytometer. Andre bilder viser selve panorering parabolen, og alle bilder vises som felt på 20 X forstørrelse. Skala bar, 200 µm. MGM microglia vekst medium. (B) tid selvfølgelig microglial morfologiske endringer og spredning over 6 dager av kultur i serum-free TIC vekst medium eller TIC pluss 10% fosterets kalv serum (FCS). CD11b-immunopanned celler var spot belagt på kollagen-belagt anionic/kationisk belagt vev kultur plate (se Tabell for materiale for detaljer), og feltet ble avbildet av kontrast hver 24 h. skala bar, 100 µm. TIC, TGF-β2/IL-34 / Kolesterol inneholder vekst medium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Rutinemessig evaluering av helse og levedyktigheten til isolerte celler er viktig for reproduserbarhet og suksessen til eksperimenter. Her viser vi microglia isolert fra en P21 dyr kulturperler i MGM, TIC eller TIC supplert med 10% FCS etter 7 dager i vitro (DIV) med en levedyktighet analysen. Hvis isolasjon var vellykket, viser kulturer mellom 80-90% levedyktighet i TIC etter 7 DIV. celler kultivert i nærvær av serum etter hvert klatre til nær 100% levedyktighet av dette tiltaket, men dette er kunstig oppblåst både av raske spredningen av serum-eksponert cellene og rask fagocytose av død celler innenfor disse kulturene (figur 2A). I tillegg til robust overlevelse vise TIC kultivert cellene også en ramified morfologi sammenlignet med FCS behandlet celler (figur 2B, C).

Figur 2: Survival av microglia i MGM, TIC eller TIC + FCS over syv dager i kultur. (A) celler ble isolert fra P21 rotter og kultivert i microglia vekst medium (MGM), TGF-β2/IL-34/kolesterol inneholder oppblomstringen medium (TIC), eller TIC + 10% fosterets kalv serum (FCS). På hvert punkt, ble kultur medium supplert med calcein AM (1,33 µM endelig) og ethidium homodimer (2,5 µM endelige) i 15 min merke levende celler og døde celler henholdsvis. Cellene ble talt, i hvert felt med et automatisert ImageJ skript. (B og C) etter 7 DIV, uten media endringer, celler dyrket i TIC (B) eller TIC supplert med 10% FCS (C) var farget Hvis etiketten levende og døde celler som ovenfor. Representant bilder ble tatt med en 10 X (venstre) eller 40 X (høyre) mål. Skala bar, 40 µm. feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (SEM). Dette tallet ble endret fra Bohlen et al. ⁹ og brukes med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å demonstrere vellykket isolasjon og kultur av svært ren microglia, vi isolert microglia fra P21 rotter og kultivert disse cellene i TIC eller TIC supplert med 10% FCS i 8 dager. Cellene ble deretter fast og farget med microglial markører (Iba-1 og CD11b) og spredning markør (Ki67, figur 3A). I tillegg til farging for cellen markører, RNA-seq på fersk isolert celler kan gir en kraftfull og følsomme verktøyet for å vurdere RNA profilen til cellene, og kan hjelpe informere Start renheten av kulturer. CD11b immunopanning vanligvis resulterer i en liten prosentandel av CD11b⁺ nøytrofile/monocytt carryover i tillegg til CD11b⁺ microglia (figur 3B). Disse cellene vil dø i TIC etter noen dager, men kan komplisere analyser av tidligere tidspunkt.

Figur 3: renhet kulturperler celleområde som vurdert av immunohistochemistry og RNA-seq. (A) Microglia ble isolert fra P21 rotter, belagt på PDL/kollagen belagt glass coverslips og kultivert i TGF-β2/IL-34/kolesterol inneholder vekst medium (TIC) i 8 dager. Celler var fast med 4% paraformaldehyde (PFA) i 10 min ved romtemperatur og immun-farget Iba-1 (1:500), CD11b (1:1500), og Ki67 (1:500). Kort, fast celler ble blokkert med 0,1% vaskemiddel (se metoder tabell for detaljer) og 10% normal esel serum (NGS) 1t ved romtemperatur. Cellene ble deretter inkubert med primære antistoffene inne 0.1% vaskemiddel med 1% NGS overnight på 4 ° C. Cellene ble vasket tre ganger i 5 min hver i PBS. Cellene ble deretter inkubert med sekundær antistoffer alle 1:500 i 0,1% vaskemiddel med 1% NGS 1t ved romtemperatur. Cellene ble igjen vasket tre ganger i PBS og montert med DAPI inneholder montering medium. Representant bilder ble tatt på 40 X forstørrelse. Skala bar, 50 µm. (B) uttrykk for representant celle-type bestemt transkripsjoner av fersk-isolert og kultivert cellene. Microglia ble isolert fra P21 rotter og lysed direkte fra immunopanning parabolen RNA isolering og RNA-seq. markører for andre store CNS-celletyper (astrocyttene, nerveceller, oligodendrocytes og endotelceller) viser minimal forurensning av CD11b-immunopanned celler. Nøytrofile markører oppdages i fersk-isolert celler (svart), men er tapt i serum-free kulturer (grå). Kultivert celler uttrykke høye nivåer av felles macrophage markører, men markører definere spesialiserte microglial signaturen er raskt downregulated av kultivert celler. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (SEM). Data er endret fra Bohlen et al. ⁹ og brukes med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Farging levedyktighet og celle markører tillater fastsetting av overlevelse og renhet av cellene, men gir begrenset informasjon om dynamikken i kulturen. Her har vi gitt en time-lapse film av P21 rotte microglia etter 14 DIV i TIC. Etter to uker, serum-free kulturer Vis dynamisk overvåking atferd, med rask prosessutvidelser og retractions gjennom parabolen (se film 1). I tillegg har vi tidligere funnet at serum eksponering forvandler dette hviler egenskaper av microglia, som resulterer i varige morfologiske og phagocytic endringer. Vi har inkludert en film av microglia kulturperler i 5 dager i TIC, så utsatt for 10% FCS (se Movie 2).

Film 1: definert mellomstore microglia kulturer Vis ramified morfologi med dynamisk prosesser. Microglia ble isolert fra P21 rotte, spot belagt på kollagen-belagt anionic/kationisk belagt vev kultur tallerkener og kultivert i 14 dager i TIC. På 14 DIV, ble bildene samlet hver 3 minutter. Filmen spiller på 6 rammer/s, og tidsstempelet i nedre høyre hjørne angir varigheten av imaging i h:min. filmen er gjengitt fra Bohlen et al. ⁹ og brukes med tillatelse. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Movie 2: Serum eksponering utløser en rask morfologiske endring i definert mellomstore microglial kulturer. Microglia ble isolert fra P21 rotte, spot belagt på kollagen-belagt anionic/kationisk belagt vev kultur tallerkener og kultivert i 5 dager i TIC. På 5 DIV, bilder ble samlet hver 5 min. planlagte motilitet/morfologi ble registrert, deretter på 2:55 (2 h, 55 min), en 50% media endring ble utført for å legge til FCS en siste konsentrasjon på 10%. Cellene ble fotografert for en ytterligere 7 h. Filmen spiller på 6 rammer/s, og tidsstempelet i nedre høyre hjørne angir varigheten av imaging i h:min. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Fordi microglia fungere som sentinel immunceller av CNS, er de svært responsive til miljøendringer; stor forsiktighet må derfor minimere inflammatorisk svar i cellene under deres isolasjon og kultur⁸. Dette gjøres i denne protokollen gjennom hastighets- og temperaturinnstillinger. Holde cellene på isen eller i 4 ° C når mulig reduserer aktivisering, så alle sentrifugering trinnene finner sted på 4 ° C, dyrene er parfyme med iskald perfusjon buffer, og protokollen har blitt strømlinjeformet for å minimere tiden mellom vev utvinning og dyrking av cellene. Hvis vurdere genet uttrykk mønstre av fersk-isolert celler, høste celle lysates direkte fra CD11b immunopanning rett før trypsinization å holde isolasjon-induserte endringer på et minimum. Det bør bemerkes at selv nøye isolert microglia utføre en betennelsesreaksjon umiddelbart etter blir plassert i varme temperaturer, antagelig på grunn av anerkjennelse av skade-assosiert signaler Egensikker knyttet isolasjon prosedyren. Hvis protokollen ble utført, er 2.5-5 x 10⁵ celler/ungdoms rotten forventet.

Cellen isolasjon protokollen tilbys her er svært spesifikke for å isolere CD11b + celler fra perfused CNS⁹. Selv om denne cellen befolkning består hovedsakelig av microglia, inneholder den også lave nivåer av andre myelogen bestander som perivascular makrofager, meningeal makrofager, choroid plexus makrofager, monocytter og nøytrofile¹⁰. Akkord-assosiert myeloide celler kan elimineres hovedsakelig av gjenkjenning og fjerning av den choroid plexus før vev dissosiasjon. Meninges kan også fjernes til en viss grad, men fullstendig eliminering av alle meningeal vev er ikke praktisk innen tidsrammen mål for rask isolasjon beskrevet her. Derfor, for å begrense variasjon på grunn av ufullstendige fjerning av meninges, vi ikke Fjern meninges. For å minimere antall sirkulerende monocytter/nøytrofile i isolerte materialet, det er også viktig å ha en ren perfusjon og vi vanligvis forkaste vev som er dårlig parfyme. Selv med utmerket perfusjon er rydding av blod ikke absolutt, som blir tydelig av tilstedeværelsen av en liten mengde erytrocytter i cellen pellets gjennom rensingen. Dermed liten nivåer av monocytter og nøytrofile er co renset og bidra en distinkt signatur i transcriptomic profiler av fersk-isolert celler. Men sirkulerende celler vil raskt dø i serum-free TIC media og representerer ikke vedvarende forurensning, selv om de kan fortsette å overleve og sprer i serum som inneholder kulturer.

Et annet viktig punkt å oppnå en sunn, levedyktig kultur er å ta vare under mekanisk dissosiasjon trinnene. Mens douncing dreper mange neurons, glia og andre overleve CNS celler, microglia denne dissosiasjon relativt uskadd (selv om microglia kan også bli drept av over-douncing). Hvis det gjøres riktig, denne protokollen gir cellen gir sammenlignbare med de får proteolytisk dissosiasjon, mens potensielt confounding variabler fra vev inflammatorisk svar på høye temperaturer unngås. Ved å utføre påfølgende ufullstendig runder av mekanisk vev dissosiasjon, kan enkeltceller høstes fra suspensjon samtidig minimere mengden mekanisk stress på generelle kultur.

Immunopanning protokollen beskrevet her er en pålitelig og reproduserbar måte å isolere microglia, men andre sammenlignbare metoder er tilgjengelige. Vi har fått lignende resultater med magnetiske isolasjon med magnetisk-aktivert cellen sortering myelin uttømming og CD11b utvalg. Vi har her fokusert på metoden immunopanning fordi det har gitt de høyeste kvalitet kulturene, krever mindre spesialisert utstyr, og krever ikke innføringen av jernoksid-konjugerte antistoffer til cellene umiddelbart før kultur. En annen metode brukt for microglial isolasjon er flowcytometri, som har en stor fordel over nåværende tilnærming i at protokoller finnes for rensing av bona fide microglia fra andre CD11b + myelogen forurensninger bruker overflate antistoffer mot signatur markører som TEMEM119⁸. Om fluorescens-aktivert celle sortering resulterer i en svært ren celle befolkning, det også pålegger ekstra stress til cellene og kan resultere i lavere levedyktighet kulturer eller redusert avkastning. Samlet fokusere vi på antistoff-baserte metoder over etiketten-fri tetthet sentrifugering og riste av forberedelser for å maksimere reproduserbarhet og renhet av celle befolkningen.

Mens denne protokollen er optimalisert for kulturen i juvenile rotte microglia, kan den brukes å kultur microglia fra ulike aldre; total-celle gir er maksimal fra 1 - 2-uke-gamle rotter, etter toppen av microglial ekspansjon og før strukturelle rearrangements som forstyrrer gjenoppretting av cellene fra eldre vev. Microglia kan også være isolert og kultivert fra mus og menneskelig vev ved å erstatte CD11b antistoffer med en passende monoklonalt antistoff spesifikke for mus eller menneskelig epitopes. Mens både mus og menneskelig microglia overleve under disse oppdrettsforholdene, viser de morfologiske forskjeller sammenlignet med rotte celler. Musen celler beholder en ramified morfologi, men har mindre utdype prosesser, mens menneskelige celler har en nesten enhetlig amoeboid morfologi når isolert og kultivert etter denne fremgangsmåten.

Isolerte microglia kan være belagt i ulike måter avhengig av analyser kreves. For optimale resultater (som illustrert i live/dead analyser og morfologiske filmer vist her), var 3,5 x 10³ celler "spot" belagt midt på av en 24-og anionic/kationisk belagt vev kultur plate etter en 10-minutters belegg av kollagen IV som beskrevet i over protokollen. Alternativt, for eksperimenter krever stort antall celler, for eksempel RNA isolasjon, 3-5 x 10⁴ celler kan være belagt per brønn av en 24-vel plate etter 10 min å 1t av kollagen IV belegg. Celler belagt på høyere tettheten viste litt lavere levedyktighet og mindre kompleks morfologi sammenlignet med celler som var spot behandlet, muligens på grunn av virkningen av inflammatoriske signaler utskilles i respons til isolasjon. Immunohistochemistry eller imaging krever glass coverslips, celler exhibit beste overlevelse og morfologi da coverslips var første belagt med PDL så belagt i kollagen IV som beskrevet ovenfor. For analyser som krever en rekke forhold, er celle levedyktighet også høy i 96-brønnen eller 384-vel kollagen belagte plater. I alle forhold, cellene starter runde eller bipolare, begynner å skaffe prosesser rundt dag 3-4, og ta 5-10 dager å stille maksimalt ramified morfologi illustrert i figur 1 og film 1.

Mens denne protokollen resulterer i en kultur som viser dynamisk overvåking atferd og morfologi ligner hvile microglia i vivo, disse cellene ikke fullt beholde spesialiserte gene expression signaturen til microglia i vivo. Mange av de vedvarende gene endringene i kulturperler celler gjenspeiler endringer vanligvis sett i embryonale eller betent CNS⁹. Slik denne protokollen representerer et skritt fremover i forståelsen av microglia krever for å overleve i kultur og serum-utløste endringer, men videre studier er nødvendig for å forstå de ytre signalene fra de tilkoblede nettverkene som finjusterer microglial egenskaper og gene uttrykk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.