Summary
Establecimos un protocolo quirúrgico novedoso para la proyección de imagen de dos fotones de hígado en ratones con la invasión mínima. Con esta técnica identificamos la estructura detallada del hígado durante la endotoxemia inducida por lipopolisacáridos. Esperamos que este método puede utilizarse para determinar la efectividad del tratamiento de reactivos diferentes a la migración de leucocitos hepáticos.
Abstract
La sepsis es un tipo de infección grave que puede causar falta del órgano y tejido daños. Aunque las tasas de morbilidad y mortalidad asociada a sepsis son tratamiento muy alto, no directo o mecanismo relacionado con el órgano se ha examinado en detalle en tiempo real. El hígado es el órgano clave que administra las toxinas e infecciones en el cuerpo humano. En este documento, se intentó realizar intravital la proyección de imagen del hígado del ratón después de la inducción de endotoxemia para rastrear la motilidad de las células inmunes, tales como neutrófilos y macrófagos capsulares hepáticos (LCMs). Por consiguiente, hemos diseñado un nuevo método quirúrgico para la exposición del hígado con cirugía mínimamente invasiva. Ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con lipopolisacárido (LPS), una endotoxina común. Con nuestro nuevo enfoque quirúrgico para la exposición y la proyección de imagen intravital de la contratación de ratón, hígado, que encontramos del neutrófilo en proteína tratados con LPS LysM-verde fluorescente (GFP) hígado de ratón fue aumentada en comparación con los en tampón fosfato hígado tratados con solución salina. Después del tratamiento de LPS, el número de neutrófilos aumentó significativamente con el tiempo. Además, utilizando ratones CX3Cr1-GFP, con éxito visualizado hígados macrófagos residentes llamados LCMs. Por lo tanto, para investigar la eficacia de nuevos reactivos para el control inmune movilidad en vivo, determinar la motilidad y la morfología de los neutrófilos y LCMs en el hígado puede permitirnos identificar efecto terapéutico en órgano falla y tejidos daños causados por activación de leucocitos en la sepsis.
Introduction
El hígado es el órgano metabólico importante en mamíferos; actúa como una torre de control de energía, hormonas y la desintoxicación1. Debido a su importancia, los investigadores han llevado a cabo muchos experimentos in vitro e in vivo para aclarar los cambios en el hígado durante la inflamación. La microscopia intravital ha sido utilizada para capturar imágenes en vivo del hígado2 . De hecho, hígado varios métodos de proyección de imagen han sido introducido2,3,4,5,6. Sin embargo, con el fin de desarrollar un enfoque quirúrgico más simplificado y lograr la estabilización de órgano blanco y las células inmunes, se diseñó un protocolo simple que pueda guiar investigadores para minimizar su esfuerzo para la proyección de imagen intravital.
En este estudio, hemos introducido una cámara de proyección de imagen estable y novela y técnica quirúrgica que podría ser utilizado para minimizar el sangrado y posibles infecciones. Se confirmó que el hígado permaneció intacto por más de 2 h. Con este método, se identificaron con éxito morfología de neutrófilos bajo condición séptica y LCMs7 . Puesto que este método minimiza el físicos y biológicos factores de confusión tales como inflamación de temblor e inesperada durante el procedimiento quirúrgico, Anticipamos que este método podría ser utilizado para observar reacciones agudas de células inmunes en el hígado en respuesta a reactivos como LPS.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo las directrices de la atención institucional del Animal y uso Comité de Yonsei University College of Medicine, Corea. Proteína LysM verde fluorescente (GFP; gfp / +) ratones8 y CX3Cr1-GFP (gfp / +) ratones de9 a 8-12 semanas de edad fueron utilizados para la proyección de imagen de intravital. Todas las herramientas quirúrgicas fueron esterilizado y desinfectado con alcohol al 70%.
1. diseñado ratón hígado de cámara con el apoyo de herramientas de imagen
- Hígado de ratón de diseño de la cámara
- Hacer una cámara del siguiente tamaño de hígado de ratón (figura 1) la proyección de imagen: cámara interior (120 mm longitud × anchura 160 mm × 30 mm de altura), cámara exterior (100 mm longitud × anchura 100 mm × 24 mm de altura), pernos (Ф 3 mm × 30 mm de altura), tuercas (Ф 4 mm) y las tuercas en forma de ala (Ф 4 mm).
- Medir el agente de curado y elastómero base en proporción de 1:9 para hacer un total de 120 g de silicona.
- Ponga la mezcla de la silicona líquida en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y mezclar bien. A continuación poner el matraz en un desecador y eliminar burbujas de aire de aproximadamente 1 h bajo vacío por la bomba.
- Vierta la mezcla de la silicona en una cámara de ratón personalizados hasta 10 mm de altura y dejar curar durante un par de días (figura 1A).
- Preparación de la cubierta y el hígado fijación cama
- En el marco del metal, coloque el vidrio de cubierta usando pegamento de silicona. Déjelo secar por 1 día (figura 1B).
- Para llevar a cabo con eficacia el agua destilada para el lente de inmersión de agua, una estructura de bloqueo del agua semipermanente es esencial. Hacer 1 mm redondeo pegamento de silicona y endurecen durante la noche.
- Mezclar el agente de curado y el elastómero base y luego verterlo en una placa de 6 pozos a una altura de unos 8-10 mm. realizar el proceso de endurecimiento descrito en 1.1.2-1.1.4.
2. preparación de LPS
- Preparar 1 × tampón fosfato salina (PBS) para diluir el polvo de LPS de Salmonella enterica serotipo enteritidis. (1 x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4).
- Precalentar PBS en baño María a 37 ° C y abrir con cuidado el frasco de polvo de LPS (25 mg).
- Con la ayuda de una pipeta, verter el PBS estéril (5 mL) en el frasco de polvo de LPS y revuelva suavemente o suspender la solución para preparar la solución madre.
Nota: Después de polvo LPS es licuado, Vortex áspero puede causar burbujas. Evitar hacer burbujas para minimizar la pérdida al hacer alícuotas en tubos de 1,5 mL. - Almacenar la solución LPS a −20 ° C y diluir en una solución de LPS de 1 mg/mL para inyección.
- Inyecte la solución 1 mg/mL de LPS (20 mg/kg) en el peritoneo de un ratón no anestesiados con una jeringa de 1 mL. Para el animal de control, inyectar el mismo volumen de PBS.
- Espere durante 2 h suficiente respuesta inflamatoria.
3. preparación de Texas-Red dextrano a los vasos sanguíneos de la mancha
- Preparar dos tubos cónicos de 15 mL y 10 mL de PBS estéril.
- Diluir el polvo rojo Texas dextrano (25 mg) en 3 mL de PBS y se mezcla bien. Transferir la mezcla a un tubo cónico de 15 mL vacío.
- Transferencia del PBS restantes (7 mL) para el tubo cónico de 15 mL que contiene la mezcla de dextrano (3 mL).
- Conectar un filtro de 0.45 μm la jeringuilla para la punta de una jeringa de 10 mL. El filtro de la jeringuilla debe reemplazar la aguja.
- Filtrar la mezcla de dextrano (10 mL). Presione uniformemente la jeringa para evitar derrames.
- Dispensar 500 μl de solución de dextrano de 2,5 mg/mL en el tubo de 1,5 mL de luz bloqueada y almacenar a −20 ° C. Una vez descongelado, almacenarla a 4° C.
4. proceso quirúrgico
- Desinfectar la mesa de cirugía y todos los instrumentos con alcohol al 70% antes de la cirugía. Luego, los instrumentos para la cirugía hepática y ajuste la placa de calentamiento a 37 ° C (figura 2A, B).
- Para la anestesia, inyectar por vía intraperitoneal los ratones con 30 mg/kg de tiletamina/zolazepam y 10 mg/kg de xilacina. Estas soluciones pueden ser mezcladas y diluidas en PBS para la inyección simultánea. Confirmar anestesia presionando suavemente el dedo del ratón. Continuar siguiente paso cuando no hay ningún reflejo.
- Aplicar pequeña cantidad de ungüento oftálmico para prevenir la sequedad de la retina del ratón.
- Eliminar el vello corporal en el área del abdomen con crema depilatoria (figura 2).
- Inyecte 200 μL de solución de dextrano de Texas-rojo (concentración de 2,5 mg/mL) a través de la vena de la cola o retro-orbital inyección con una jeringa de insulina (Figura 2D).
- Marque el área subcostal derecha con un marcador. La línea debe extraerse desde el proceso xifoides hasta el final de la costilla. Corte de la epidermis con pinzas y tijeras (Figura 2E, F).
- Abrir la cavidad abdominal utilizando micro-tijeras y pinzas y exponer el hígado cuidadosamente. El lóbulo lateral izquierdo debe desplegado utilizando hisopos de algodón (figura 2, H).
- Vierta 500 μl de PBS estéril en la cavidad abdominal para evitar la sequedad del hígado.
- Coloque el ratón en la posición de decúbito derecho en una cámara de diseño personalizado y aplique una pequeña cantidad de pegamento de tejido a la cama de silicio. Luego, con cuidado coloque el hígado utilizando hisopos de algodón (figura 2I).
Nota: Debido a que el tejido del hígado es muy friable, no mecánicamente extraer el hígado. Gire el cartucho suavemente hacia fuera con bastoncillos de algodón. - Unos segundos después, moje el hígado nuevo con 500 μl de PBS estéril para evitar que se sequen fuera del hígado. Coloque el marco de metal en el hígado y fijarla firmemente con las tuercas (figura 2J).
5. intravital imágenes del hígado con microscopía de dos fotones
- Ejecutar software de ZEN (Carl Zeiss) para encender el láser, ajuste la longitud de onda de 880 nm y el conjunto verde y rojo. Ajustar la potencia del láser según la intensidad de fluorescencia (Figura 3A). Información de filtro de emisión es el siguiente: verde/Alexa488, 500-550 nm y rojo/Alexa 555, 575-610 nm.
- Colocar la cámara en el escenario de proyección de imagen y 20 X objetivo de inmersión en agua cerca del cubierta de vidrio.
- Fijar el calentador de caucho de silicona debajo del cuerpo del ratón para mantener su temperatura corporal (figura 3B).
- Dejar caer 500 μl de agua destilada en el marco del metal y luego tire de la lente del objetivo cerca del hígado (figura 3).
- Ajustar el enfoque y determinar la profundidad y el tiempo de la zona de proyección de imagen.
- Realizar la proyección de imagen.
- Para la proyección de imagen a largo plazo, inyecte media dosis de mezcla tiletamina/zolazepam y xilacina cada hora durante proyección de imagen. Mantener la temperatura corporal de los ratones a 37 ° C es esencial en esta etapa. Mantener siempre en el ojo el ratón, ya que el tiempo de anestesia difiere de cada ratón.
Nota: Este método no es conveniente para la recuperación después de cirugía y la proyección de imagen. Éticamente sacrificamos el ratón inmediatamente después de la cirugía. - Revise los reflejos pedal para cada 30 minutos de anestesia estable.
6. Análisis de datos
- Abra el software de análisis de datos Volocity y luego importar los datos en bruto en la biblioteca en el software.
- Eliminar ruido de la imagen para adaptarse a la situación y tomar una instantánea.
Nota: Para obtener imágenes nítidas, utilice el filtro 'Finos' o 'Mediana'. Además, utilice la función 'Realce de contraste' a oscuras o borrosas imágenes más claras. - Ajustarse los elementos editados al 100% y exportación como archivos JPEG o TIFF para imágenes y archivos AVI para peliculas.
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Representative Results
Se creó una cámara de proyección de imagen sencilla y muy estable. La parte inferior de la cámara estaba cubierta con silicona, que impidió el deslizamiento del ratón cuerpo y órganos. Además, porque el silicio tiene la cantidad apropiada de la elasticidad, podría prevenir daño esperado inducido por la presión de la corredera de cubierta (figura 1A, C). Segundo, el tejido de seguridad pegamento (enlace de veterinario) se aplicó con el fin de fijar el hígado extraído en la cama de silicona con forma de círculo. Este método nos permitió evitar temblor causado por latidos del corazón o movimiento respiratorio. Por último, una diapositiva de cubierta de metal puesta, fijada con tornillos y tuercas basadas en el tamaño corporal de los ratones y la posición del hígado protuberante (figura 1B–D). Cuando la anestesia se realizó correctamente, estos ajustes de imagen podrían durar más de 6 h.
Antes de comenzar la cirugía, la temperatura corporal de los ratones fue controlada colocando el animal en una cámara de calentamiento que previamente a 37 ° C (figura 2A). A continuación, para evitar la infección secundaria, todas las herramientas necesarias para la cirugía de ratón y la proyección de imagen fueron esterilizados con alcohol al 70% o esterilizado para prevenir la infección secundaria (figura 2B). Luego, pelo del cuerpo del ratón fue quitado, particularmente de la zona abdominal, con una crema depilatoria (figura 2). Antes de hacer la incisión, la piel se esterilizó con povidona yodada. El flujo de sangre fue etiquetado con dextrano rojo de Texas mediante inyección en la vena (Figura 2D). Se dibuja una línea que comenzó en el proceso del xiphoid y terminó en las costillas derecha. Esta línea de incisión subcostal derecha ayudó a minimizar el sangrado. Con un bisturí o tijeras micro, la disección se inició; el abdomen no se abrió demasiado para evitar la expulsión de los intestinos de la cavidad abdominal (Figura 2E, F). Capas de grasa y de tejido fueron quitadas con el fórceps y tijeras de disección micro, y se limpia el área de incisión con hisopos esterilizados de PBS y algodón (figura 2). El lóbulo lateral izquierdo, el más grande de los cuatro lóbulos de hígado, fue sacado con bastoncillos de algodón y luego atado a la cama de silicio usando un tejido enlace (veterinario). Como el tejido del hígado era extremadamente friable, el hígado se mudó con hisopos de algodón (figura 2 H, ). Después de aplicar el vidrio de cubierta de metal, el hígado se sometió a la proyección de imagen. Para evitar la sequedad, PBS esterilizada fue aplicado al espacio entre el hígado y el vidrio de la cubierta (figura 2J). La altura de la cubierta de vidrio se ajustó con las tuercas cuando sea necesario.
Microscopía de dos fotones fue equipado con X, Y, y Z hachas controlador de micrómetro y blindado con cortina negra (Figura 3A). El láser fue estable modo-bloqueado en el software Zen. Para obtener la proyección de imagen estable, deriva del órgano blanco debe evitarse. Por lo tanto, además de proyección de imagen de la cámara y el método quirúrgico, los cables de la almohada eléctrica electrónica fueron aseguradas de la etapa de proyección de imagen y bien organizada por cintas adhesivas (figura 3B). Por último, una cantidad suficiente de agua destilada se añadió a la parte superior del vidrio de cubierta para el lente de inmersión de agua (figura 3).
El flujo de sangre fue indicado claramente en la pantalla después de la inyección intravenosa de dextrano de Texas-Red. Para capturar al rojo y verde al mismo tiempo, se realizó la proyección de imagen con una longitud de onda de 880 nm. Según análisis de proyección de imagen intravital, un número adecuado de neutrófilos siempre estaba circulando la sangre en condiciones de PBS. Mientras que el número de neutrófilos en LPS tratados ratones aumentó significativamente. Tenga en cuenta que circulaban una gran cantidad de neutrófilos dentro del torrente sanguíneo pero no migran fuera de la nave en condiciones inflamatorias. (Figura 4A, película complementario 1). Neutrófilos en los ratones tratados con LPS fueron más firmemente adheridos a la superficie luminal de la nave, que hizo más frecuente detección de neutrófilos en el recipiente (Figura 4A, adicional 1 de la película). Aparte de la motilidad de neutrófilos, LCMs en ratones CX3Cr1-GFP se observaron en la superficie del tejido del hígado en lugar profundo dentro del tejido (Figura 4B). LCMs mostraron poco movimiento o activación en el hígado en los ratones tratados con LPS.
Figura 1 . Diseño de cámara de hígado y filial herramientas. (A) verter la mezcla de la silicona en la cámara de ratón personalizados. (B) dimensiones de la diapositiva de cubierta de metal (1 pulgada = 25,4 mm, Ф = diámetro). (C) la imagen muestra el plástico diseñado hígado cámara llena de elastómero de silicón. (D) otras partes fueron utilizados para montar la cámara de hígado. Fijación de pernos y tuercas se hicieron de hierro. Las flechas indican pernos y tuercas, respectivamente, en (C) y (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Pasos quirúrgicos para Cirugía hepática. (A) Metal y caucho calefacción placas a 37° C y regulador de temperatura de DC antes de la cirugía. (B) cirugía total y herramientas de apoyo para la cirugía hepática (a. algodón torunda y envase, alcohol al 70% b., c. papel del tejido, maquinilla de afeitar de d., crema depilatoria e., f. cámara de diseño personalizado, cinta quirúrgica g., h. caseros hígado pedestal, i. tuercas y tuercas, cubierta de metal de j. diapositiva, k. disección micro tijeras, pinzas l., m. tijeras, n. jeringa de 3 mL, marcador o., jeringa de insulina de 0,3 mL de p., jeringa de 1 mL de p.). Procedimiento para la cirugía hepática (C-J). (C) aplicar Crema del retiro del pelo en el sitio abdominal. (D) retro-orbital inyección de ratones con dextrano de Texas-Red. (E) marcando el sitio de la incisión con un marcador. (F) la epidermis con pinzas y tijeras de corte. (G) haciendo una incisión en la cavidad abdominal. (H) sacando el lóbulo lateral izquierdo suavemente. () Asociar el lóbulo al pedestal hígado utilizando bonos de veterinario. (J) imagen de la configuración final. Las tuercas fueron fijadas a la diapositiva de cubierta de metal, y entonces la corredera de cubierta fue fijada con tuercas de mariposa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Configuración para microscopía de dos fotones y la etapa de proyección de imagen. (A) vista de microscopía de dos fotones (LSM 7 MP) y la etapa de proyección de imagen, que puede moverse en el x y y direcciones. (B) una cámara de proyección de imagen hepática con un caucho del cojín de calefacción fue atada con cinta para cubrir el ratón. (C) colocar agua destilada agua con una pipeta entre el objetivo y el vidrio de cubierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Visualización de los neutrófilos y los macrófagos capsulares hepáticos en el hígado de ratones vivo. (A) extendida instantánea de enfoque de neutrófilos en el hígado de ratones LysM-GFP. La imagen de control fue de ratones tratados con PBS. La imagen de LPS fue de ratones tratados con LPS. Imágenes fueron adquiridas con un 20 X lente 1,0 NA-inmersión en agua (campo de visión [FOV] = 424.3 μm × 424.3 μm, profundidad = 40 μm, rebanada intervalo = 1 μm, intervalo de tiempo = 60 s, ciclo = 31). Barra de escala = 50 μm. (B) interno y la superficie instantánea del área de LCMs en el hígado de ratones CX3Cr1-GFP. Imágenes se adquirieron utilizando una lente de inmersión en agua 20 × / 1.0 NA (FOV = 424.3 μm × 424.3 μm, profundidad = 40 μm (interno) / 10 μm (superficie), intervalo de corte = 1 μm, intervalo de tiempo = 60 s (interno) / 20 ciclo (superficie), s = 31). Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película complementaria 1. Comparación de PBS trata hígado versus LPS tratados hígado. Bien se observa una diferencia clara en dos condiciones diferentes. En LPS tratados hígado, el número de neutrófilos se incrementa significativamente y se disminuye la motilidad. Se observa la estabilidad de la película en ambas condiciones. Flujo de sangre se etiqueta con dextrano de Texas Red. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El hígado se ha estudiado activamente por muchos grupos3,10, debido a la importancia de su función. Por ejemplo, Heymann et al. sugirió un método delicado utilizando agarosa. Aunque este método fue encontrado para ser muy preciso, el ajuste de agarosa toma tiempo. Sin embargo, con nuestra metodología, todos los procedimientos pueden llevarse a cabo dentro de 30 minutos, reduciendo al mínimo otros factores de confusión. En segundo lugar, estabilizar el hígado es muy importante porque el latido del corazón puede disturbar el video. Para eliminar este fenómeno, recolocan los ratones en la posición de decúbito derecho.
Otro paso crítico en este protocolo era la producción de la estructura de la cubierta del metal y su ubicación en la barra de metal. El obstáculo más importante que enfrentamos fue determinar cómo superar la friabilidad del hígado según fijación hepática utilizando una cantidad adecuada de presión. Inicialmente, cuando se aplicaron sólo las tuercas de mariposa para sujetar la corredera de cubierta, se impidió la circulación de la sangre y el hígado no pudo soportar el peso de la diapositiva de cubierta. En cambio, ideamos un método a rodar abajo de los pernos antes de colocar la diapositiva de cubierta a lo largo de la barra. Puesto que la diapositiva de cubierta fue apoyada por los pernos, dio algo de espacio para el espesor del hígado y por este medio, no presione fuerte en el hígado y aún mantiene el equilibrio y la fijación. Usando GFP LysM ratones6, confirmamos que este diseño podría permitir la visualización de los neutrófilos en los sinusoides y venas centrales. Ratones de GFP CX3Cr15 también fueron usados en este modelo para observar el LCMs. LCMs fueron encontrados con frecuencia en la superficie del hígado.
La altura del pedestal de hígado o de la cama de silicio, también era esencial. Si es demasiado alto, interrumpirse la circulación de sangre en el hígado. Cuando la altura del pedestal hígado era demasiado baja, era difícil mantener una fijación estable del hígado. Porque todos los ratones tenían tamaños de cuerpo diferentes, se producen camas de silicio que tenían diferentes alturas utilizando una placa de 6 pozos, similar a la utilizada para el cultivo celular. De esta manera, pudimos personalizar la cámara según el tamaño de cada ratón. En Resumen, hemos diseñado un novedoso y sencillo protocolo intravital proyección de imagen del hígado de ratón para investigar la morfología y motilidad de las células inmunes en el hígado en condiciones inflamatorias.
Este nuevo protocolo podría ser muy útil para los investigadores en este campo que desean observar respuesta inmune aguda del hígado. Sin embargo, con este método, los investigadores no pueden realizar la proyección de imagen a largo plazo por más de 6 h debido a la fijación del hígado con pegamento de tejido. Este protocolo es un método de sólo una sola vez, y por lo tanto, ratones deben ser sacrificados inmediatamente después de la proyección de imagen. Cuando el hígado está separado de la cama de silicio, el hígado que finalmente se quitó de la cama, lo que resulta en sangrado excesivo. Por lo tanto, la reinserción y la sutura de la zona abdominal es imposible observación futura.
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Disclosures
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por una subvención de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea (MSIP; subvención n ° 2016R1A2B4008199 Y m. H.) y el Ministerio de salud y bienestar, República de Corea (número: HI14C1324).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
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