Summary
We een nieuwe chirurgische protocol voor twee-foton beeldvorming van levende muizen lever met minimale invasie opgericht. Met deze techniek vastgesteld we de gedetailleerde structuur van de lever tijdens lipopolysaccharide-geïnduceerde endotoxemia. Wij verwachten dat deze methode kan worden gebruikt om te bepalen van de effectiviteit van verschillende behandeling van de reagentia te hepatische migratie.
Abstract
Sepsis is een soort ernstige infectie die orgaanfalen en weefsel kan veroorzaken schade. Hoewel de tarieven van de mortaliteit en morbiditeit geassocieerd met sepsis zijn extreem hoog, geen directe behandeling of orgel-gerelateerde mechanisme is onderzocht in detail in real-time. De lever is het belangrijkste orgaan, die worden beheerd met toxines en infecties in het menselijk lichaam. Hierin wilde we intravital beeldvorming van muis lever na inductie van endotoxemia uitvoeren om het bijhouden van de beweeglijkheid van immune cellen, zoals neutrofielen en lever kapselvorming macrofagen (LCMs). Dienovereenkomstig, we ontwierpen een nieuwe chirurgische methode voor blootstelling van de lever met minimaal invasieve chirurgie. Muizen werden intraperitoneally met lipopolysaccharide (LPS), een gemeenschappelijke endotoxine ingespoten. Met behulp van onze nieuwe chirurgische benadering voor blootstelling en intravital beeldvorming van de muis lever, dat we vonden dat neutrofiele aanwerving in LPS-behandeld LysM-groen fluorescente proteïne (GFP) werd muis lever verhoogd in vergelijking met die in fosfaatgebufferde Saline-behandelde lever. Na de behandeling van de LP's, het aantal neutrofielen aanzienlijk gestegen met tijd. Bovendien, met behulp van CX3Cr1-GFP muizen, we met succes lever resident macrofagen genaamd LCMs gevisualiseerd. Daarom voor het onderzoek naar de werkzaamheid van nieuwe reagentia te controleren immuun mobiliteit in vivo, kan vaststelling van de motiliteit en morfologie van neutrofielen en LCMs in de lever toestaan ons te identificeren therapeutisch effect in orgel falen en weefsel schade veroorzaakt door de activering van de leukocyten in sepsis.
Introduction
De lever is het grootste metabole orgaan in zoogdieren; het fungeert als een verkeerstoren voor energie, hormonen en ontgifting1. Vanwege het belang ervan, hebben de onderzoekers vele in vitro en in vivo experimenten om het verhelderen van de wijzigingen in de lever tijdens ontsteking uitgevoerd. Intravital microscopie is gebruikt om live beelden van de lever2 te vangen. Inderdaad, introduceerde diverse lever beeldvormende methoden zijn2,3,,4,,5,6. Echter om een eenvoudigere chirurgische aanpak ontwikkelen en stabilisatie van de doel-orgel en de immuuncellen te bereiken, ontwierpen we een eenvoudige protocol dat onderzoekers om te minimaliseren van hun inspanningen voor intravital imaging kan begeleiden.
In deze studie introduceerde wij een stabiel en roman imaging kamer en chirurgische techniek die gebruikt kan worden om te minimaliseren van bloeden en mogelijke infecties. We hebben bevestigd dat de lever bleef intact gedurende meer dan 2 uur. Met deze methode vastgesteld we met succes morphologies van LCMs7 en neutrofielen onder septische voorwaarde. Aangezien deze methode storende factoren van fysische en biologische zoals beven en onverwachte ontsteking tijdens chirurgische ingreep minimaliseert, verwachten wij dat deze methode kan worden gebruikt om het observeren van acute reacties van immune cellen in de lever in reactie op reagentia zoals LPS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele Animal Care en gebruik Comité Yonsei University College of Medicine, Korea. LysM-groen fluorescente proteïne (GFP; gfp / +) muizen8 en CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 muizen op 8-12 weken leeftijd werden gebruikt voor intravital imaging. Alle chirurgische instrumenten waren gesteriliseerde met autoclaaf en gedesinfecteerd met alcohol 70%.
1. douane-ontworpen muis lever imaging kamer met ondersteuning van tools
- Muis lever imaging kamer ontwerp
- Maken van een kamer van het volgende formaat voor muis lever imaging (Figuur 1): binnenkamer (120 mm lengte × 160 mm breedte × 30 mm hoogte), buitenste chamber (100 mm lengte × 100 mm breedte × 24 mm hoogte), bouten (Ф 3 mm × 30 mm hoogte), noten (Ф 4 mm) , en vleugel-vormige noten (Ф 4 mm).
- De uithardende agent en elastomeer basis in 1:9-verhouding zodat een totaal van 120 g silicone meten.
- Doe het mengsel van vloeibare siliconen in een conische kolf van 250 mL en meng het goed. Vervolgens zet de kolf in een exsiccator en verwijderen van luchtbellen voor ongeveer 1U onder drukvermindering door de pomp.
- Giet de mix van vloeibare siliconen in een douane-ontworpen muis kamer zo hoog als 10 mm hoogte en laat het remedie voor een paar dagen (figuur 1A).
- Voorbereiding van dekking dia's en de lever vaststelling bed
- Op de metalen frame, door het glas van de cover met behulp van siliconen lijm te koppelen. Laat het drogen voor 1 dag (figuur 1B).
- Om effectief het gedestilleerd water voor het water onderdompeling-lens, is een semipermanent water-blokkerende structuur essentieel. Maak van 1 mm siliconen lijm afronding en harden het 's nachts.
- Meng de uithardende agent en elastomeer basis en giet het in een 6-well-plaat op een hoogte van ongeveer 8-10 mm. uitvoeren de verharding proces zoals beschreven in 1.1.2-1.1.4.
2. voorbereiding van LPS
- Steriele 1 ×-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om te verdunnen het LPS poeder van Salmonella enterica serotype enteritidis voor te bereiden. (1 × PBS: 137 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 10 mM nb2HPO4, 1,8 mM KH2PO4).
- Verwarm in een waterbad bij 37 ° C op PBS en open de LPS poeder fles (25 mg) zorgvuldig.
- Met behulp van een pipet steun, giet de steriele PBS (5 mL) in de LPS poeder fles en zachtjes roeren of op te schorten de oplossing ter voorbereiding van de stockoplossing.
Opmerking: Nadat LPS poeder is vloeibaar, harde vortexing kan bellen. Vermijden makend bubbles om verlies te minimaliseren bij het maken van aliquots in 1.5-mL tubes. - Opslaan van de stockoplossing van de LPS van −20 ° C, en vul het in een 1 mg/mL LPS oplossing voor injectie.
- Injecteren de LPS oplossing van 1 mg/mL (20 mg/kg) in het buikvlies van een niet-verdoofd muis met behulp van een injectiespuit 1 mL. Injecteren hetzelfde volume van PBS voor het dier controle.
- Wacht 2 h voor voldoende inflammatoire respons.
3. voorbereiding van de Texas-rood Dextran om vlek van bloedvaten
- Twee kegelvormige buizen van 15 mL en 10 mL steriele PBS te bereiden.
- Verdun Texas-rood Dextran poeder (25 mg) in 3 mL PBS en meng het goed. Het mengsel overbrengen in een lege 15 mL conische buis.
- De resterende PBS (7 mL) overbrengen met de 15 mL conische buis met het mengsel van dextran (3 mL).
- Sluit een 0,45 µm spuit filter naar het uiteinde van een 10 mL spuit. Het filter van de spuit moet de naald vervangen.
- Filtreer het mengsel dextran (10 mL). Druk gelijkmatig op de spuit om te voorkomen dat morsen.
- Afzien van 500 µL van 2,5 mg/mL dextran oplossing in de 1.5-mL licht-geblokkeerde buis en op te slaan bij −20 ° C. Eenmaal ontdooid, bewaren bij 4° C.
4. het chirurgische proces
- Desinfecteer de operatie tafel en alle instrumenten met behulp van 70% alcohol voorafgaand aan de operatie. Vervolgens stelt u de hulpprogramma's voor de lever chirurgie en aanpassen van de verwarmingsplaat tot 37 ° C (figuur 2A, B).
- Voor anesthesie, intraperitoneally injecteren de muizen met 30 mg/kg tiletamine/zolazepam en 10 mg/kg xylazine. Deze oplossingen kunnen worden gemengd en voor gelijktijdige injectie in PBS is verdund. Bevestigen afstomping door zachtjes op de teen van de muis. Gaan de volgende stap als er geen reflex is.
- Kleine hoeveelheid oog zalf om te voorkomen dat de droogte van muis vlek van toepassing.
- Lichaamshaar rond het gebied van de buik met behulp van hair removal cream (figuur 2C) verwijderen.
- Injecteren van 200 µL van Texas-rood Dextran oplossing (concentratie van 2,5 mg/mL) via de staart ader of retro-orbitaal injectie met een insuline-injectiespuit (figuur 2D).
- Het recht subcostal gebied markeren met een viltstift. De lijn moet worden getrokken uit de xiphoid proces tot het einde van de rib. Snijd de epidermis met Tang en schaar (figuur 2E, F).
- De buikholte met behulp van de micro-schaar en pincet open en bloot de lever zorgvuldig. De linker laterale kwab moet worden uitgerold met behulp van katoen swabs (Figuur 2 g, H).
- Giet 500 µL van steriele PBS op de buikholte ter voorkoming van droogheid van de lever.
- Plaatst u de muisaanwijzer op de positie van de recht-decubitus in een kamer speciaal ontworpen, en breng een kleine hoeveelheid weefsel lijm aan het bed van silicium. Zorgvuldig hechten dan de lever met katoenen wissers (figuur 2I).
Opmerking: Omdat het leverweefsel extreem brokkelige is, mechanisch Trek niet uit de lever. Zachtjes uitrollen het met wissers van katoen. - Een paar seconden later, natte de lever weer met 500 µL van steriele PBS te vermijden drogen uit de lever. Plaats de metalen frame op de lever en stevig repareren met noten (figuur 2J).
5. intravital beeldvorming van de lever met twee-foton microscopie
- Uitvoeren van ZEN software (Carl Zeiss) zet de laser, stelt u de golflengte aan 880 nm, en groene, en rode kanalen. Aanpassen laser macht volgens de intensiteit van de fluorescentie (figuur 3A). Emissie filterinformatie is als volgt: groen/Alexa488, 500-550 nm en rood/Alexa 555, 575-610 nm.
- Plaats van de kamer het imaging werkgebied en plaats de 20 X water-immersie objectief dicht bij de glazen cover.
- De siliconen rubber kachel onder het lichaam van de muis te handhaven van de lichaamstemperatuur (figuur 3B) vast te stellen.
- Drop 500 µL van gedistilleerd water op de metalen frame, en dan trek de objectief dicht bij de lever (Figuur 3 c).
- De focus aanpassen en bepalen van de diepte en de tijd van het imaginggebied.
- Gedrag imaging.
- Voor langdurige imaging, injecteren helft van een dosis van tiletamine/zolazepam en xylazine mengsel elk uur tijdens imaging. Handhaven van de lichaamstemperatuur van de muizen bij 37 ° C is essentieel tijdens deze etappe. Houd altijd op oog voor de muis, aangezien afstomping tijd van elke muis verschilt.
Opmerking: Deze methode is niet geschikt voor herstel na de operatie en beeldvorming. We offeren ethisch de muis onmiddellijk na de operatie. - Controleer de pedaal reflexen voor elke 30 min. voor stabiele afstomping.
6. de gegevensanalyse
- Open de data-analysesoftware Volocity en vervolgens de onbewerkte gegevens in de bibliotheek in de software importeren.
- Verwijder ruis van het beeld aanpassen aan de situatie te nemen van een momentopname.
Opmerking: Voor het verkrijgen van goede beelden, het 'Fine' of 'Mediaan' filter gebruiken. Bovendien, de 'Contrast enhancement'-functie gebruiken om donkere of wazige beelden duidelijker te maken. - Passen de bewerkte producten 100% te exporteren als JPEG- of TIFF-bestanden voor momentopname beelden en AVI-bestanden voor films.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een eenvoudige en zeer stabiel imaging kamer was bedacht. De bodem van kamer was bedekt met silicone, waardoor het wegglijden van de muis lichaam en de organen. Bovendien, omdat silicium de juiste hoeveelheid elasticiteit heeft, kon het voorkomen dat van verwachte schade veroorzaakt door de druk van de cover dia (figuur 1A, C). Tweede, weefsel-kluis lijm (dierenarts bond) werd toegepast om te bevestigen de uitgepakte lever op het cirkelvormig siliconen bed. Deze methode ons in staat gesteld om te voorkomen dat trillen veroorzaakt door de hartslag of respirational beweging. Tot slot was een metalen deksel dia geplaatst en opgelost door bouten en moeren, gebaseerd op de lichaamslengte van de muizen en de positie van de uitstekende lever (figuur 1B-D). Wanneer de verdoving werd correct uitgevoerd, kunnen deze beeldvorming instellingen langer duren dan 6 h.
Voordat u begint de chirurgie, werd de lichaamstemperatuur van de muizen gecontroleerd door het plaatsen van het dier op een verwarming kamer die was vooraf ingesteld op 37 ° C (figuur 2A). Vervolgens werden alle noodzakelijke gereedschappen voor muis chirurgie en beeldbewerking secundaire om infectie te voorkomen, gesteriliseerde met 70% alcohol en/of gesteriliseerde met autoclaaf ter voorkoming van secundaire infectie (figuur 2B). Vervolgens werd muis lichaamshaar verwijderd, met name van de buikstreek, met een haar verwijdering room (figuur 2C). Alvorens de incisie, was de huid met Povidon jodium gesteriliseerd. De bloedstroom was voorzien van Texas-rood Dextran via veneuze injectie (figuur 2D). Een lijn die begon op de xiphoid process en eindigde op de juiste ribben is getekend. Deze lijn rechts subcostal incisie geholpen minimaliseren bloeden. Met een scalpel of micro-schaar, is de dissectie gestart; de buik werd niet teveel geopend om te voorkomen dat uitwijzing van de ingewanden uit de buikholte (figuur 2E, F). Vet en weefsel lagen werden verwijderd met pincet en micro-dissectie schaar, en het gebied van de snede werd schoongemaakt met gesteriliseerde PBS en katoen swabs (Figuur 2 g). De laterale linker kwab, de grootste van de vier lever kwabben, was met katoenen wissers genomen en dan gekoppeld aan het bed van de silicium met behulp van een weefsel bond (dierenarts bond). Zoals het leverweefsel extreem brokkelige was, was de lever verhuisd met katoenen wissers (Figuur 2 H, ik). Na het toepassen van metalen cover glas, werd de lever onderworpen aan beeldvorming. Om te voorkomen dat droogte, werd gesteriliseerde PBS toegepast op de ruimte tussen de lever en de cover glas (figuur 2J). De hoogte van het glas van de cover is aangepast met noten wanneer nodig.
Twee-foton microscopie was uitgerust met X, Y, en Z as micrometer controller en afgeschermd met zwarte gordijn (figuur 3A). De laser was stabiel modus-vergrendeld op de Zen-software. Om te krijgen stabiel imaging, moet drijven van doel orgaan worden voorkomen. Daarom waren de draden van de elektronische verwarming pad naast imaging kamer en chirurgische methode, beveiligde weg van de beeldvorming fase en overzichtelijk door kleverige banden (figuur 3B). Tot slot, een voldoende hoeveelheid gedestilleerd water is toegevoegd aan de bovenkant van de cover glas voor de water onderdompeling lens (Figuur 3 c).
De bloedstroom was het duidelijk aangegeven op het scherm na intraveneuze injectie van Texas-rood Dextran. Om te vangen gelijktijdig zowel rood en groen, we uitgevoerd beeldbewerking met een golflengte van 880 nm. Volgens intravital imaging analyse, was een passend aantal neutrofielen altijd het bloed in PBS voorwaarde circuleert. Overwegende dat het aantal neutrofielen in LPS behandeld muizen was aanzienlijk verhoogd. Merk op dat een heleboel neutrofielen circuleerden in de bloedbaan, maar ze niet buiten het schip in de inflammatoire aandoening migreren. (Figuur 4A, aanvullende film 1). Neutrofielen in het LPS-behandelde muizen waren meer stevig vasthouden aan het luminal oppervlak van het schip, waardoor vaker detectie van neutrofielen in het schip (figuur 4A, aanvullende film 1). Afgezien van de beweeglijkheid van neutrofiele granulocyten, werden LCMs in CX3Cr1-GFP muizen waargenomen op het oppervlak van leverweefsel in plaats van diep in het weefsel (figuur 4B). LCMs toonde weinig beweging of activering in de lever zelfs in muizen LPS-behandeld.
Figuur 1 . Ontwerp van lever kamer en subsidiaire hulpmiddelen. (A) gieten het siliconen-mengsel in de zaal van de douane-ontworpen muis. (B) de afmetingen van de metal cover dia (1 inch = 25,4 mm, Ф = diameter). (C) de afbeelding toont het plastic douane-ontworpen lever kamer gevuld met silicone-elastomeer. (D) andere delen werden gebruikt voor het monteren van de lever kamer. Fixing bouten en moeren zijn gemaakt van ijzer. Pijlen aangegeven bouten en moeren, respectievelijk onder C en D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Chirurgische stappen voor lever chirurgie. (A) metaal en rubber verwarming platen bij 37° C en DC temperatuurregelaar voor de operatie. (B) algemene chirurgie en ondersteunende tools voor lever chirurgie (a. katoenen doekje en container, b. 70% alcohol, c. papier weefsel, overleden scheermes, e. hair removal cream, f. douane-ontworpen kamer, g. chirurgische tape, h. huisgemaakte lever voetstuk, i. vleugelmoeren en noten, j. metal cover dia, k. micro-dissectie schaar, l. pincet, m. schaar, n. 3 mL spuit, o. marker, p. 0.3 mL insuline spuit, v. 1 mL spuit). Procedure voor lever chirurgie (C-J). (C) toepassen haar verwijdering room op de buik site. (D) retro-orbitaal injectie van muizen met Texas-rood Dextran. (E) markeren de insnijding site met een viltstift. (F) snijden de epidermis met Tang en schaar. (G) het maken van een incisie in de buikholte. (H) trekken zachtjes uit de linker laterale kwab. (I) koppelt de kwab aan de lever sokkel met behulp van dierenarts bond. (J) beeld van de finale instellen. Noten werden bevestigd aan de dia metalen deksel, en vervolgens de dekking dia werd bevestigd met vlinder noten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Instellingen voor twee-foton microscopie en imaging fase. (A) zicht op twee-foton microscopie (LSM 7 MP) en de beeldvorming fase, die in de x- en y-richtingen kan bewegen. (B) een lever imaging kamer voorzien van een rubberen verwarming pad was verbonden met behulp van tape ter dekking van de muis. (C) dropping gedestilleerd water met een pipet tussen het objectief en de cover glas. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Visualisatie van neutrofielen en lever kapselvorming macrofagen in de lever van levende muizen. (A) uitgebreid focus momentopname van neutrofiele granulocyten in de lever van LysM-GFP muizen. Het beeld van de controle was van PBS-behandelde muizen. De LPS-beeld was van LPS-behandelde muizen. Beelden werden verkregen met behulp van een 20 X / 1.0 nb water-onderdompeling lens (gezichtsveld [FOV] = 424.3 µm × 424.3 µm, diepte = 40 µm, segment Interval = 1 µm, tijdsinterval = 60 s, cyclus = 31). Schaal bar = 50 µm. (B) binnenste en oppervlak gebied momentopname van LCMs in de lever van CX3Cr1-GFP muizen. Beelden werden verkregen met behulp van een 20 × / 1.0 nb water-onderdompeling lens (FOV = 424.3 µm × 424.3 µm, diepte = 40 µm (innerlijke) / 10 µm (oppervlakte), segment interval = 1 µm, tijdsinterval = 60 s (innerlijke) / 20 s (oppervlakte), cyclus = 31). Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende film 1. Vergelijking van PBS behandeld lever versus LPS behandeld lever. Duidelijk verschil in twee verschillende voorwaarden goed wordt nageleefd. In LPS behandeld lever, het aantal neutrofielen is aanzienlijk verhoogd en de motiliteit is gedaald. De stabiliteit van de film in beide voorwaarden in acht worden genomen. Doorbloeding is gelabeld met Texas Red dextran. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De lever is actief bestudeerd door vele groepen3,10, vanwege het belang van zijn functie. Bijvoorbeeld, stelde Heymann et al. een gevoelige methode met behulp van agarose. Hoewel deze methode bleek te zijn zeer nauwkeurige, heeft de instelling van de agarose duurt. Echter, met onze methodologie alle procedures kunnen worden uitgevoerd binnen 30 min, minimaliseren van andere storende factoren. Ten tweede, het stabiliseren van de lever is zeer belangrijk omdat de hartslag kan het verstoren van de video. Om dit verschijnsel te elimineren, we hebben het geherpositioneerd de muizen in de juiste decubitus positie.
Een andere belangrijke stap in dit protocol was de productie van de metalen afdekkader ingebouwd en de locatie ervan op de metalen staaf. Het belangrijkste obstakel dat we geconfronteerd was om te bepalen hoe om te overwinnen de afslijting van de lever overeenkomstig lever fixatie met behulp van een geschikte hoeveelheid van druk. Aanvankelijk, wanneer alleen de vlinder noten werden toegepast om te houden van de dia deksel, de omloop van het bloed werd belemmerd, en de lever was niet in staat te verduren van het gewicht van de dia deksel. In plaats daarvan bedacht we een methode afrollen van de bouten vóór het plaatsen van de cover dia langs de bar. Aangezien de dekking dia werd ondersteund door bouten, gaf enige ruimte voor de lever dikte en hierbij het, deed niet druk naar beneden hard in de lever en nog behouden van het evenwicht en de fixatie. LysM-GFP muizen6gebruikt, bevestigd we hebben dat dit ontwerp visualisatie van neutrofielen in sinusoïdes en centrale aders kan leiden. CX3Cr1-GFP muizen5 werden ook gebruikt in dit model om te observeren LCMs. LCMs bleken vaak op het oppervlak van de lever.
De hoogte van de lever sokkel of het silicium bed, was ook essentieel. Als het te hoog was, zou de omloop van het bloed in de lever worden onderbroken. Wanneer de hoogte van de lever sokkel te laag was, was het moeilijk om stabiele fixatie van de lever. Omdat alle muizen verschillende lichaam maten hadden, wij geproduceerd silicium bedden die had verschillende hoogtes met een 6-well plaat, vergelijkbaar met die voor de cultuur van de cel gebruikt. Op deze manier konden we de kamer volgens de grootte van elke muis aanpassen. Kortom ontwierpen we een roman en eenvoudige protocol voor intravital beeldvorming van muis lever te onderzoeken van de morfologie en de beweeglijkheid van immune cellen in de lever onder inflammatoire voorwaarden.
Dit nieuwe protocol zou zeer nuttig zijn voor onderzoekers op dit gebied willen observeren van acute immune reactie van de lever. Met deze methode kunnen niet onderzoekers echter op lange termijn beeldvorming langer dan 6 uur als gevolg van de lever fixatie met weefsel lijm voeren. Dit protocol is een eenmalige enige methode, en daarom, muizen na imaging onmiddellijk moeten worden opgeofferd. Wanneer de lever is losgekoppeld van het silicium bed, zal de lever uiteindelijk worden ontdaan van het bed, waardoor overmatig bloeden. Daarom is opnieuw inbrengen en wordt van de buikstreek onmogelijk voor toekomstige observatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door een subsidie van de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door de regering van Korea (MSIP; subsidie no. 2016R1A2B4008199 tot Y-M. H.), en het ministerie van volksgezondheid en welzijn, Republiek Korea (verlenen van nummer: HI14C1324).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
