Methodenartikel

Ein Flow Cytometry-basierte Assay, Verbindungen zu identifizieren, die Bindung von Eindringmittel beschriftet CXC-Chemokin-Liganden 12 an CXC-Chemokin-Rezeptor 4 stören

DOI:

10.3791/57271

⸱

10. März 2018

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein Flow Cytometry-basierten zellulären Bindung Assay beschrieben wird, die in erster Linie als Screening-Instrument verwendet wird, um Verbindungen zu identifizieren, die die Bindung eines Eindringmittel beschrifteten CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) an den CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hemmen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pharmakologische Ausrichtung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) ist von großer Bedeutung für die menschliche Gesundheit als dysfunktionale GPCR-vermittelten Signalisierung zu den Verlauf vieler Krankheiten beiträgt. Das Ligand-Rezeptor-paar CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) / CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hat erhebliches klinische Interesse, zum Beispiel als ein potenzielles Ziel für die Behandlung von Krebs und entzündliche Erkrankungen erhöht. Kleine Moleküle sowie therapeutische Antikörper, die spezifisch CXCR4 und hemmen die Rezeptor-Funktion gelten daher als wertvolle pharmakologische Werkzeuge. Hier wird ein Flow Cytometry-basierten zellulären Assay, der Identifizierung von Verbindungen (z. B. kleine Moleküle) ermöglicht, die CXCL12 Bindung an CXCR4, aufzuheben beschrieben. Im wesentlichen stützt sich der Test auf den Wettbewerb für die Rezeptor-Bindung zwischen einen Festbetrag von Eindringmittel beschrifteten CXCL12, die natürliche Chemokin-Agonist für CXCR4 und unbeschriftete Verbindungen. Daher ist die unerwünschte Verwendung von radioaktiv markierte Sonden in diesem Assay vermieden. Darüber hinaus sind lebende Zellen als Quelle des Rezeptors (CXCR4) anstelle von Zellmembran Vorbereitungen verwendet. Dies ermöglicht eine einfache Anpassung des Assays zu einem Plattenformat, das den Durchsatz erhöht. Dieser Test hat sich gezeigt, zu einem wertvollen Generika Entdeckung Assay, CXCR4-targeting Verbindungen zu identifizieren. Das Protokoll kann wahrscheinlich andere GPCRs mindestens angepasst wenn Fluoreszent markierte Liganden zur Verfügung stehen oder erzeugt werden können. Vorkenntnisse über die intrazelluläre Signalwege, die durch die Aktivierung dieser GPCRs verursacht werden ist nicht erforderlich.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) sind Zelle Oberflächenproteine, die von extrazellulären Liganden (z. B. Peptide, Proteinhormone, Amine) aktiviert werden können, dadurch regulieren viele physiologische und entwicklungspolitische Prozesse1. Wenn ein Agonist seine GPCR-Bindungstasche einnimmt, induzierte Konformationsänderung im Rezeptor-Protein fördert die Bindung von intrazellulären Rezeptor-assoziierten Heterotrimeric G Proteine, bestehend aus Gα- BIP und Gβγ Untereinheiten. Der anschließende Austausch von GTP für das BIP auf der Gα -Untereinheit resultiert die Dissoziation der G Protein Untere....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wartung der Zellkultur

Hinweis: Alle unter 1 und 2 beschriebenen Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow Kabinett durchgeführt.

  1. Wachsen Sie Zellen in T75 Kulturflaschen bei 37 ° C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator.
    Hinweis: In diesem Test werden Jurkat Zellen (z.B. menschliche leukämischen T-Lymphozyten, die endogen CXCR417ausdrücken) verwendet. Ausdruck von CXCR4 an der Zelloberfläche sollten in der gesamten Zelle Kultivierung mittels Durchflusszytometrie ausgewertet werden. Eine Beschreibung der Flow Cytometry Verfahren und Reagenzien zu bestimm....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die allgemeine Workflow des Assays Bindung ist in Figur 1Avorgestellt. Eine Illustration des Typs der Flow Cytometry Daten für unterschiedliche Probentypen in ein standard-Experiment (d. h. negative Kontrolle, positive Kontrolle und experimentelle Probe) ist in Abbildung 1 bund eine mögliche Platte Layout durchführen dargestellt. der Test in einem 96-Well-Platte-Format wird in Abbildung 1ang.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Im Vergleich zu anderen Arten der Bindung-Assays (z. B. Sättigung Bindung und kinetische verbindliche Experimente), sind Wettbewerb-Bindung-Assays am besten geeignet zu screening-Zwecken. In der Tat, ermöglichen sie Bewertung von Großserien unbeschriftete Verbindungen, zum Beispiel kleine Moleküle durch scoring ihre Fähigkeit, die Bindung eines Festbetrags eines beschrifteten Rezeptor Liganden stören. Verbindungen, die an andere Rezeptoren als die markierten Liganden binden könnte im Test unentdeckt zu bleiben. .......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten Eric Fonteyn für ausgezeichnete technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt von der KU Leuven (keine zu gewähren. PF/10/018), Fonds Voor Wetenschappelijk Onderzoek-(FWO, Nein zu gewähren. G.485.08) und der Fondation Dormeur Vaduz.

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BD FACSCanto IIBecton DickinsonNicht zutreffendDurchflusszytometrie-Gerät
BD FACSDIVA Software
BD FACSArrayBecton DickinsonNicht zutreffendDurchflusszytometrie-Gerät
BD FACSArray System Software
Graphpad PrismGraphpadSoftwarepaket, das für die nichtlineare Regressionsanalyse in Abbildung 2 und Abbildung 3 verwendet wird
FlowJoFlowJo ist jetzt eine hundertprozentige Tochtergesellschaft von BD.
Vi-CELLBeckman CoulterNicht anwendbarZellviabilitätsanalysator
Sigma 3-18 KSSigmaNicht anwendbarZentrifuge
AMD3100SigmaA5602-5mgspezifischer CXCR4-Antagonist
MaravirocPfizerantiretrovirales Medikament, CCR5-Antagonist, verfügbar für die Forschung bei Selleckchem (Kat#S2003), Sigma (Kat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647)ALMACCAF-11-B-01fluoreszenzmarkiert CXCL12, CXCL12AF647
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaA1933-25G
HBSS (10x), Calcium, Magnesium, kein PhenolrotGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1M)Gibco (Leben Technologien)15630-056
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Jurkat-ZellenATCC
Reagenzreservoir PPSigmaBR703411
Schnellstromfilter: 0,2 &Mikro; m aPESThermo Scientific566-0020
Sterilin Mikrotiterplatte, 96 Well, U-Boden, klarThermo Scientific611U96
Falcon Röhrchen, 50 mlGreiner Bio-One227 261
Gewebekulturflasche (T75)Corning353024

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  2. Milligan, G., Kostenis, E.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Durchflusszytometrie AssayCXCR4 BindungCXCL12 KompetitionGPCR WirkstoffforschungLebendzell Assayfluoreszierende Ligandenbindungkompetitiver BindungsassayJurkat ZellenAMD3100 AntagonistMaraviroc Kontrolle

Verwandte Artikel