Methodenartikel

Formaldehyd-gestützte Isolation regulatorischer Elemente auf die Maßnahme Chromatin Barrierefreiheit in Säugerzellen

DOI:

10.3791/57272

⸱

2. April 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oncohematology and Genetics. Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío, 2Institute of Biochemistry, Medical Faculty, Friedrichstrasse 24, Member of the German Center for Lung Research, Justus-Liebig-University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Plastizität der nuklearen Architektur wird durch dynamische epigenetischen Mechanismen, einschließlich nicht-kodierende RNAs, DNA-Methylierung, Nukleosom Neupositionierung sowie Histon Zusammensetzung und Modifikation gesteuert. Hier beschreiben wir eine Formaldehyde-Assisted Isolation von regulatorischen Elemente (FAIRE) Protokoll ermöglicht die Bestimmung der Chromatin-Barrierefreiheit in gewissem Sinne reproduzierbar, preiswert und unkompliziert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entsprechende Genexpression in Reaktion auf extrazelluläre Signale, d. h. Abstammung und gewebespezifischen Gentranskription hängt hoch definierte Zustände von Chromatin Organisation. Die dynamische Architektur des Kerns wird durch mehrere Mechanismen gesteuert und prägt die transkriptionelle Ausgabe-Programme. Es ist daher wichtig, Locus-spezifische Chromatin Zugänglichkeit auf zuverlässige Weise zu bestimmen, die vorzugsweise unabhängig von Antikörpern, die eine potenziell verwirrende experimentelle Variabilität sein können. Chromatin Zugänglichkeit kann durch verschiedene Methoden, einschließlich der Formaldehyde-Assisted Isolation von regulatorischen Elemente (FAIRE) Assay gemessen werden, die die Bestimmung des allgemeinen Chromatin Barrierefreiheit in einer relativ geringen Anzahl von Zellen zu ermöglichen. Hier beschreiben wir eine FAIRE-Protokoll, das einfache, zuverlässige und schnelle Identifizierung der genomischen Regionen mit einer niedrig-Protein-Belegung ermöglicht. Bei dieser Methode wird die DNA kovalent gebunden an das Chromatin Proteine mit Formaldehyd als ein Vernetzungsmittel und zu den kleinen Stücken geschert. Die freie DNA wird danach angereichert mit Phenol: Chloroform Extraktion. Das Verhältnis von freier DNA wird durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) oder DNA-Sequenzierung (DNA-Seq) im Vergleich zu einer Kontrollprobe Vertretung Gesamt-DNA bestimmt. Die Regionen mit lockerer Chromatinstruktur werden in freie DNA-Probe, so dass die Identifizierung der genomischen Regionen mit niedrigeren Chromatin Verdichtung bereichert.

Einleitung

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Die genomische DNA eukaryotischer Zellen ist dicht gepackt in Nukleosomen, die entfernt oder umgestaltet, um die Interaktion mit der DNA anderer Proteine ermöglichen muss. Die transkriptionelle Aktivierung eines Gens führt typischerweise zu einer offeneren Konfiguration ihrer nucleosomal Struktur, besonders in der + 1-Nukleosom-1Transkription durch die RNA-Polymerase zu erleichtern. Auch unterziehen regulatorische Regionen wie Promotoren und Enhancer dynamische Veränderungen in deren Chromatin Erreichbarkeit für die Interaktion mit Chromatin Modifikatoren oder Transkription Faktoren2ermöglichen. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um diese Nukleosom-freien Regionen zu identifizieren. Dazu gehören die Empfindlichkeit gegenüber Nukleasen wie DNase ich3 oder micrococcal Nuklease4, die nur die DNA zugreifen können, wenn es um Nukleosomen nicht straff gewickelt ist. Andere Methoden zur Identifizierung von offenen Chromatin oder freie DNA sind die Transposase-vermittelte Integration von Retrotransposable Elementen (Assay für Transposase zugänglichen Chromatin, ATAC)5oder Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Antikörper gegen Histone. Die FAIRE Methode basiert nicht auf die Kapazität eines Enzyms, die DNA zu erreichen oder die Bindung eines Antikörpers an ein bestimmtes Protein, sondern stützt sich auf die Reinigung von Nukleosom-freien Regionen von einem Phenol: Chloroform Extraktion6,7. Bei dieser Methode wird die DNA ist kovalent gebunden an Chromatin Proteine durch die Vernetzung Agent Formaldehyd und ist anschließend in kleine Stücke durch Ultraschallbehandlung geschert. Dicht gepackten Chromatin Regionen werden reichlich DNA/Protein vernetzt haben, während DNA-Regionen mit keinen oder wenigen Nukleosomen werden wenig oder gar keine querverbunden DNA/Protein-komplexe. Eine Phenol: Chloroform Extraktion ermöglicht Reinigung von den unvernetzten freie DNA in der wässrigen Phase, während die DNA vernetzt an Proteine in den organischen Phenol Phase oder wässrigen organischen Interphase zusammen mit den Proteinen erfasst wird. Die Quantifizierung dieser freie DNA im Vergleich zu einer Referenz der Gesamtstichprobe DNA ermöglicht die Identifikation von Chromatin freie Regionen. Die FAIRE Methode eignet sich für die Charakterisierung der einzelnen genomische Regionen wie hier beschrieben, sondern eignet sich auch für die Identifizierung der genomweiten Chromatin Zugänglichkeit bei tiefen Sequenzierung gekoppelt wie in verschiedenen Modellen8 beschrieben , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Ergebnisse von Jahrmarkt-Seq und anderen Methoden wie ATAC-Seq14weitgehend überlappen. Die FAIRE Methode ist eine sehr robuste, billig und einfach durchzuführen Methode um Nukleosom-freien Regionen zu identifizieren. Im Gegensatz zu anderen Methoden es erfordert keine Pilotprojekte zu bestimmen, die angemessene Höhe der Verdauung nach Bedarf für Nukleasen (DNase-Seq, MNase-Seq) oder Transposasen (ATAC-Seq) und ausführlich in einem letzten Beitrag15. Die einzigen Parameter angepasst werden, sind die Beschallung Bedingungen und in einigen Fällen die Fixierzeit. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Protokoll, ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt, und das erfordert keine spezielle Ausrüstung außer einem Sonikator. Das Protokoll kann in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden und macht FAIRE eine einfache und zuverlässige Methode zum Testen von Chromatin Barrierefreiheit in einer Reihe von verschiedenen Zelltypen von Lunge Zellen11 bis hin zu Maus Lebern16gewonnenen Primärzellen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tag 1: Zellkultur

  1. Kultur der Zellen auf den gewünschten Wert analysiert werden. Zelle Kulturbedingungen und Medien hängen die Zelltypen untersucht.
    Hinweis: Grundsätzlich ist jeder eukaryontische Zelle eine Analyse der Chromatin-Zugänglichkeit durch FAIRE zugänglicher. Für dieses Experiment 4 x 106 HEK-293T Zellen in einem einzigen 10 cm Teller in DMEM Medium mit 10 % (V/V) FBS und 1 % (w/V) Penicillin/Streptomycin ergänzt und bei 5 % CO2 und 37 ° C für 24 Stunden, bis die Zellen 70-80 % Zusammenfluss erreichen inkubiert gesät werden (~ 8 x 10 6 Zellen pro Gericht).

(2) Tag 2: Formaldehyd-Vernetzung und Zelle Ernte

Achtung: Formaldehyd ist hochgiftig und muss immer unter einem Abzug verwendet werden. Tragen Sie Schutzkleidung (Handschuhe und Kittel). Entsorgen Sie die Abfälle entsprechend.

  1. Fügen Sie Formaldehyd direkt in Zellkulturmedium unter einem Abzug, eine Endkonzentration von 1 % (V/V) (270 µL 37 % (V/V) Formaldehyd, 10 mL von Zellkulturmedium) zu erreichen. 10 min bei Raumtemperatur (20-25 ° C) inkubieren und erschlug die Platten manuell alle 2 min.
    Hinweis: Die Vernetzung Zeit ist je nach Zelltyp einstellbar. Für die Mehrheit der Zell-Linien ist 10 min Vernetzungsgrad ausreichend. Für Gewebe möglicherweise längere Inkubationen erforderlich um die Fixierung aller Zellen zu ermöglichen.
  2. Hinzufügen von Glycin, eine Endkonzentration von 0,125 M das Formaldehyd zu stillen (10 mL Kulturmedium 500 µL einer 2,5 M Glycin Aktie hinzufügen). 5 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie und töteten Sie alle 2 min.
  3. Waschen Sie die Zellen 3 X mit Eis kaltem PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4 · 2 H2O, 0,24 g/L KH2PO4, justieren pH bis 7.4 mit HCl oder NaOH). Aspirieren Sie das Medium und direkt in der Zelle Kulturschale oder Kolben durch Zugabe von 10 mL PBS waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, sehr vorsichtig bei lose adhärente Zellen wie HEK-293T. Fügen Sie PBS sorgfältig auf die Seite der Schale um Loslösung der Zellen zu vermeiden.
  4. Nach der dritten Wäsche Aufschwemmen der Zelle in 1 mL Eis kaltem PBS und Übertragung auf einen 1,5 mL Reaktionsgefäß auf Eis. Verwenden Sie Zelle Schaber, um die Zellen bei Bedarf zu trennen.
    Hinweis: Beim Starten mit einem begrenzten Material verwenden Sie niedrigen DNA-bindende Röhren Probenverlust während des Verfahrens zu vermeiden.
  5. Zentrifuge für 5 min bei 300 X g bei 4 ° C in einer gekühlten Tabletop Zentrifuge. Verwerfen Sie den Überstand durch sorgfältig Absaugen es.

(3) Zell-Lyse und Chromatin Fragmentierung

  1. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL FAIRE Lyse Puffer (1 % (w/V), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1 10 µg/mL Leupeptin, 10 µg/mL Aprotinin, 2 mM PMSF) und Aufschwemmen der Zellen durch vorsichtig nach oben und unten mehrmals pipettieren. Inkubieren Sie für 20 min auf Eis. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bei diesem Schritt bei Bedarf.
  2. Beschallen Sie die vernetzte DNA, in einer durchschnittlichen Größe von 200-300 bp zu scheren. Die spezifischen Einstellungen der Sonikator müssen für jede Quelle von Proben und das verwendete Anwendung von Ultraschall-Gerät ermittelt werden. In jedem Fall sicherstellen Sie, dass die DNA effizient geschert wird. Ein Optimierungsschritt für DNA-Scheren ist unter Schritt 5.14 beschrieben. Kühlen Sie die Proben auf Eis während der Anwendung von Ultraschall zur Erwärmung der Probe zu vermeiden.
  3. Zentrifugieren Sie die Probe für 15 min und 13.000 x g bei 4 ° C.
  4. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß. Die Proben in 100 µL-Aliquots aufgeteilt. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C, bei Bedarf.
    Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle unterbrochen werden.

4. de-Vernetzung des Steuerelements DNA

  1. Nehmen Sie 100 µL aliquoten aus Schritt 3.4 die Crosslink umkehren und als Referenz für Gesamt-DNA verwendet werden. Fügen Sie 10 µL RNase-A (10 mg/mL) und 1 h bei 37 ° c inkubieren
  2. Fügen Sie 10 µL Proteinase K (20 mg/mL). Verwenden Sie ein programmierbarer Thermoblock für 4 h bei 37 ° C und dann für 6 h bei 65 ° C, die Proteine Spalten und die Querverbindungen zu inkubieren. Zu guter Letzt die Proben bei 4 ° C zu halten, bis das Protokoll fortgesetzt wird und dann fahren Sie mit Schritt 5 fort.
    Hinweis: Andere FAIRE Protokolle verwenden Chromatin Proben aus Zellen, die nicht vernetzt als Referenz, damit Abschaffung der Notwendigkeit einer de-Vernetzung11gewesen. Die Tatsache, dass diese Beispiele nicht vernetzt zu Unterschieden in der Beschallung Effizienz oder DNA-Stabilität führen könnte, ist die Nutzung der gesamten DNA-Referenzproben, die das gleiche Verfahren wie der Prüflinge unterzogen wurden daher genauer.

5. Tag 3: Phenol: Chloroform Reinigung der DNA

  1. Nehmen Sie die de-unvernetzten aliquoten aus Schritt 3.4. Fügen Sie 10 µL RNase-A (10 mg/mL) und 1 h bei 37 ° c inkubieren
  2. Nehmen Sie die de-unvernetzten aliquoten Form Schritt 5.1 und die de-vernetzt-Probe aus Schritt 4.2 und fahren Sie parallel. Fügen Sie H2O zu einem Endvolumen von 300 µL hinzu.
  3. Fügen Sie energisch 300 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1) in einer Dampfhaube und Wirbel.
    Achtung: Phenol ist korrosiven und toxischen und muss immer unter einem Abzug verwendet werden. Tragen Sie Schutzkleidung (Handschuhe und Kittel), stellen Sie sicher die Reaktionsgefäße sind fest verschlossen, und den Abfall entsprechend zu entsorgen.
  4. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.
  5. Übertragen Sie 280 µL der oberen wässrigen Phase sorgfältig auf ein neues Reaktionsgefäß. Achten Sie darauf, dass keine Ablagerungen aus der Interphase nehmen, die auch Proteine enthält. Entsorgen Sie die verbleibende untere Phase als organischen Lösungsmittelabfälle.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 5.3 bis 5.5 und übertragen Sie 270 µL der oberen wässrigen Phase sorgfältig auf ein neues Reaktionsgefäß.
  7. Fügen Sie 270 µL Chloroform kräftig in einer Dampfhaube und Wirbel.
    Hinweis: Dieser Schritt wird verwendet, um alle verbleibenden Phenol aus der Probe zu beseitigen.
  8. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.
  9. Übertragen Sie sorgfältig 250 µL der oberen wässrigen Phase in ein neues Reaktionsgefäß, kümmert sich nicht um jeglichen Schmutz von der Interphase zu tragen. Entsorgen Sie die restlichen Probe als organischen Lösungsmittelabfälle.
  10. Fügen Sie 25 µL 5 M NaCl und 250 µL Isopropanol. Fügen Sie 5 µL von Glykogen (20 mg/mL) als DNA-Träger. Mischen Sie gut durch invertieren die Röhren und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C, die DNA auszufällen.
  11. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 400 µL Ethanol 70 % (V/V). Zentrifuge für 10 min bei 13.000 x g bei 4 ° C.
  12. Den Überstand vorsichtig abgesaugt und das Pellet für 10 min bei Raumtemperatur trocknen lassen. Aufschwemmen Sie in 100 µL TE-Puffer (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).
  13. Inkubieren Sie de-unvernetzten freie DNA-Probe für 4 h bei 65 ° C, Inter DNA-Querverbindungen zu entfernen. Speichern Sie die Proben bei-20 ° C.
  14. Quantifizieren Sie die Menge an DNA mit einem Spektralphotometer zu und führen Sie eine aliquote überprüfen die Fragmentgröße auf einem Agarose-Gel 2 % (w/V). Passen Sie die Scheren Zeit und Intensität, je nach den Ergebnissen der DNA Größe Analyse von Agarose gel Elektrophorese, um einer durchschnittlichen Größe von 200-300 bp zu erhalten.

6. Bestimmung der freien Versus Gesamt-DNA durch Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)

  1. Das Verhältnis der Nukleosom-freie DNA (im folgenden als freie DNA bezeichnet) im Vergleich zu insgesamt DNA sich nach qRT-PCR17,18 richtet. Proben können auch von Microarray-Hybridisierung oder Tiefe Sequenzierung für genomweite Bestimmungen quantitativ analysiert werden.
  2. QPCR Primer für die Regionen getestet werden und für positive und negative Kontrollen zu entwerfen.
    Hinweis: Geeignete Positivkontrollen sind Grundierungen befindet sich in der Promoter aktiv transkribierten Housekeeping-Gene wie ACTB, GAPDH, TPI1 oder TUBA1A (β-Aktin, GAPDH, TPI oder α-Tubulin-Kodierung). Entsprechende negative Steuerelemente befinden sich in Heterochromatin Regionen oder gen-Wüsten. Anderen geeigneten Negativkontrollen können genomische Regionen neben den dynamisch geregelten Locus untersuchten Steuern für lokale Kopie Nummer Unterschiede (Tabelle 1) gestaltet werden.
  3. Die DNA-Proben, eine Endkonzentration von 10 ng/µL mit TE-Puffer verdünnen und den Verdünnungsfaktor berücksichtigen bei der endgültigen Berechnungen (siehe Punkt 6.5).
  4. Richten Sie eine qPCR-Reaktion im Triplicates in eine 96-Well-Platte, mit der folgenden Reaktion Mischung pro Bohrloch: Schablone DNA: 20 ng (2 µL), forward Primer 200 nM (0.4 µL einer Aktie 5 µM), rückwärts-Primer 200 nM (0.4 µL einer Aktie 5 µM) , eine kommerzielle gebrauchsfertige Reaktion Mischung mit grünen Farbstoff (5 µL aus einem 2 X bestand) und H2O bis 10 µL.
  5. Laufen in Echtzeit qPCR Gerät, mit dem absoluten Quantifizierung-Modus und die Ct der Proben mit verschiedenen Primer-Paaren zu bestimmen. Berechnen Sie das Verhältnis der Wiederherstellung des freien DNA in Gesamt-DNA für jede Grundierung mit Hilfe der folgenden Formel unter Berücksichtigung der Verdünnungsfaktoren aus Schritt 6.3:
    figure-protocol-1
    Repräsentative Ergebnisse und eine Beispielrechnung sind in Tabelle 2angegeben.
  6. Zum Ausgleich der Unterschiede zwischen den Proben der Positivkontrolle Erholung Verhältnis zu normalisieren:
    figure-protocol-2

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben die FAIRE Methode verwendet, um Unterschiede in der Chromatin-Erreichbarkeit der MHC-Klasse-II-Gene in den HEK293T Zellen als veröffentlichte19messen. MHC-Klasse-II-Kodierung Gene werden in antigenpräsentierende Zellen (APCs), konstitutiv oder als Reaktion auf Cytokine signaling20ausgedrückt. Die Expression von Genen ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG treibt einen Aktivator Komplex an spezifische DNA-Elemente, bezeichnet XY-Boxen, befindet sich in der Projektträger und der von diesen Genen21,22-Enhancer bindet. Dies spiegelt sich auf der Ebene der Chromatin, wie durch unsere FAIRE Analyse ausgewählter Regionen in den MHC-Klasse-II-Gene HLA-DPB1 und HLA-DMA offenbart. Diese Experimente zeigten, dass das Chromatin ist rund um die Regionen umfasst die XY-Boxen, während es kompakter in den gen-Gremien (Abbildung 2 ist).

Als Beispiel für die Berechnungen in diesem besonderen Experiment verdünnt wir die gesamte DNA-Probe 10 Mal (Verdünnungsfaktor 10), und die freie DNA-Probe wurde nicht verdünnt (Verdünnungsfaktor 1) für die qRT-PCR. Das Cts erhalten für die verschiedenen Regionen getestet und die Berechnungen, die endgültigen Verwertung Verhältnisse und relativen Erholung Verhältnisse zu erhalten finden Sie in Tabelle 2. Diese relativen Erholung-Verhältnisse wurden mittels des ACTB Projektträgers als die positive Kontrolle erhalten. Beachten Sie, dass diese Berechnungen für eines der Replikate verwendet, um die in Abbildung 2dargestellten Ergebnisse zu generieren.

In einem anderen Kontext wurde Chromatin Zugänglichkeit zu einem Modell für induzierbaren Genexpression getestet. In diesem Fall wurden die rasche Veränderungen des Chromatins Verdichtung als Reaktion auf die Pro-Entzündungsreiz Tumor Nekrose Faktor (TNF) gemessen. HeLa-Zellen blieben unbehandelt oder angeregt mit TNF für 1 h, gefolgt von Jahrmarkt, Chromatin Verdichtung an den Promotor Region steuernden Expression des Gens Codierung der TNF-responsive Zytokin Interleukin 8 (IL8) zu messen. Diese Ergebnisse zeigten eine stark erhöhte Chromatin Zugänglichkeit bei der IL8 Promotor des TNF-stimulierten Zellen (Abbildung 3). Die Erreichbarkeit auf der IL-8-Veranstalter nach TNF-Stimulation ist sogar höher als die in der ACTB Projektträger zeigt eine dramatische Chromatin Umbau in dieser regulatorischen Region gefunden. Wie die Wiederherstellung Verhältnis erhalten in diesem Fall höher als die in der Region als Positivkontrolle (ACTB Promotor) erhalten ist das relative Erholung Verhältnis größer als 1.

figure-results-1
Abbildung 1: die FAIRE Workflow. Zellen sind vernetzt direkt in die Zelle Kultur Kolben oder Schüssel durch Zugabe von Formaldehyd (A). Zellen sind nach dem abschrecken von der Formaldehyd, mit Eis kaltem PBS (B) drei Mal gewaschen und in ein Reaktionsgefäß, wo sie Nukleinsäuretablette in FAIRE Lyse Puffer und beschallt, um die DNA (C) Scheren, übertragen. Ein Aliquot des extrahierten Chromatins ist de-querverbunden durch Erhitzen bei 65 ° C, um die gesamte DNA Referenz (D), zu erhalten und danach ist die freie DNA extrahiert, mit Phenol: Chloroform, sowohl aus der vernetzt und de-vernetzte Aliquote (E). Zu guter Letzt die DNA quantifiziert und das Verhältnis der freien vs. insgesamt, die DNA ist berechnet (F). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-2
Abbildung 2: Ermittlung der Chromatin-Barrierefreiheit in den MHC-Klasse-II-gen-cluster in HEK293T Zellen. HEK293T Zellen wurden durch FAIRE ausgewertet. Das Verhältnis zwischen frei versus Gesamt-DNA (i.e., das Verhältnis der relativen Erholung) wurde für den Promotor des Gens ACTB als Positivkontrolle, eine Heterochromatin Region auf Chr. 12 als Negativkontrolle, und die regulatorischen Regionen und gen Gremien des MHC ermittelt Klasse II-Gene HLA-DMA und HLA-DPB1. Der obere Teil zeigt eine schematische Darstellung der Ort und die Positionen der Primer. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen von zwei biologischen Wiederholungen in Triplicates gemessen. Die Figur wurde aus einem veröffentlichten Bericht19geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-3
Abbildung 3: Veränderungen der DNA-Barrierefreiheit bei der IL8 Projektträger in Reaktion auf die Behandlung von TNF. HeLa-Zellen wurden mit TNF stimuliert (20 ng/mL) für 1 h und durch FAIRE analysiert. Das Verhältnis zwischen kostenlos gegen insgesamt, die DNA für die Förderer der ACTB (Positivkontrolle), eine Heterochromatin Region auf Chr. 12 (Negativkontrolle) und dem IL8 Projektträger bestimmt war. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwertes (SEM) aus drei biologische Wiederholungen in Duplikate gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-4
Abbildung 4: Optimierung der Beschallung Bedingungen. Chromatin aus 293T Zellen extrahiert wurde sonifiziert mit einer fokussierten Sonikator mit geeigneten Rohren (Table of Materials). Das Chromatin sonorisiert wurde, für die angegebene Zeit mit Wiederholungen von 30 s mit den folgenden Einstellungen: Spitzenleistung 150, Einschaltdauer 15 Zyklen pro Burst 500, gefolgt von 30 s: Spitzenleistung 2.5, Einschaltdauer 15 Zyklen pro 500 platzen. Die daraus resultierende Chromatin war de-vernetzt, durch Phenol: Chloroform Extraktion gereinigt und in einem 2 % Agarose-Gel geladen. Eine Interkalation-Bromid, die gebeizt Gel wird angezeigt, und die Positionen der Molekulargewicht Marker sind in bp angegeben. In diesem Experiment wurde die optimale Chromatin-Größe (200-300 bp) nach 20 min der Zellulite erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

GrundierungSequenz
ACTB-Promoter-FAAAGGCAACTTTCGGAACGG
ACTB-Promoter-RTTCCTCAATCTCGCTCTCGC
Chr. 12 negative Kontrolle-FATGGTTGCCACTGGGGATCT
Chr. 12 negative Kontrolle-RTGCCAAAGCCTAGGGGAAGA
HLA-DMA-XY-Box-FCATCAGTCACTGGGGAGACG
HLA-DMA-XY-Box-RGCTTCCCAGCCCAGTTACAT
HLA-DMA-5'-FGGAGAGAACAATCTCCGCTTCA
HLA-DMA-5'-RAGCTGCTATGTGTGGTTGGT
HLA-DMA-3'-FTGGGGACCTAGTTAGGGAGC
HLA-DMA-3'-RAGATCCATGGGAGGAGGCTT
HLA-DPB1-XY-Box-FGTCCAATCCCAGGGTCACAG
HLA-DPB1-XY-Box-RTGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA
HLA-DPB1-5'-FGCGTGTTCATGTCTGCATCC
HLA-DPB1-5'-RTGATCCTCAGAGCCTGGACA
HLA-DPB1-3'-FCCAGCCTAGGGTGAATGTTT
HLA-DPB1-3'-RGCCTGGGTAGAAATCCGTCA
IL8 Promoter-FGTGATGACTCAGGTTTGCCCT
IL8 Promoter-RCTTATGGAGTGCTCCGGTGG

Tabelle 1: Primer für qPCR.

figure-results-5
Tabelle 2: Beispielrechnungen FAIRE Relative Erholung Verhältnisse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jahrmarkt ist eine robuste und kostengünstige Methode zur Identifizierung von Nukleosom-freien Regionen. Es basiert auf dem Prinzip, dass DNA umwickelt Nukleosomen vernetzt an den Histonen problemlos. Eine Phenol: Chloroform Extraktion wird verwendet, um die unvernetzten und eiweißfreie DNA-Fragmente aus der Protein-gebundenen DNA trennen, die in der unteren Phenol-Phase und in gewissem Maße in der Interphase (Abbildung 1) zu finden ist. Daher sind die Nukleosom-freien Regionen in der wässrigen Phase in der Fraktion der freien DNA überrepräsentiert. Eine Anzahl von Publikationen beschreiben ausführliche Protokolle der FAIRE Methode23,24,25,26, die zur Ergänzung der hier beschriebenen Vorgehensweise konsultiert werden können.

Ähnlich wie bei anderen Methoden zur Bestimmung der Chromatinstruktur verwendet, hängt die FAIRE Methode auch optimale Scheren der DNA. Wenn die Fragmente zu lang sind, wird jeder Nukleosom-freie Region durch die angrenzenden Chromatin-gebundene DNA maskiert werden. Wenn die Fragmente zu klein sind, wird die Erkennung von qPCR oder Tiefe Sequenzierung sehr schwierig. Aus diesem Grund ist die Beschallung der DNA eine entscheidende Parameter, der muss kontrolliert und optimiert, um Fragmente um erhalten 200-300 bp Länge, die 1-2 Nukleosomen (Abbildung 4) darstellen.

Ein weiterer Parameter, der das Endergebnis beeinflussen kann ist die Vernetzung der Probe. Obwohl das hier beschriebene Verfahren der Fixierung für die meisten Zelllinien gilt, der Forscher muss sorgfältig bewerten diesen Schritt für die besondere Probe untersucht, insbesondere bei Verwendung von Geweben, wo möglicherweise länger Fixierung erforderlich, damit die Formaldehyd, die Zellen in der Gewebeprobe zu erreichen.

Im Gegensatz zu anderen Methoden, wie z. B. DNase I oder micrococcal Nuklease Überempfindlichkeit, ChIP oder ATAC, FAIRE verlässt sich nicht auf eine enzymatische Aktivität oder spezifische Antikörper, und daher benötigt es keine Titration oder Optimierung der Reaktionsbedingungen. Dadurch FAIRE eine ideale Methode, Chromatin Zugänglichkeit für Labore mit wenig Erfahrung auf dem Gebiet des Chromatins zu messen. Darüber hinaus Pilotprojekte sind nur erforderlich, um die DNA Scheren Schritt und gleichzeitig Vernetzung optimieren bei Bedarf.

Die Methode wurde ursprünglich in Hefe6entwickelt, aber auch für Säugerzellen erweitert. Die DNA mit der FAIRE Methode gereinigt einsetzbar für tiefe Sequenzierung die genomweiten Charakterisierung der Chromatin-Status ermöglicht. Dies hat bereits bewährt sich eine Reihe von Studien8,9,10,11,12,13,19,27, 28.

Ergebnisse aus Jahrmarkt-Seq Experimente zeigen eine große Überschneidung mit Ergebnissen aus anderen Methoden wie DNase-Seq14, obwohl einige Unterschiede entstehen. Dies ist aufgrund der methodischen Unterschiede wie zum Beispiel, dass Nukleosomen entspanntere oder umgebaute noch die Spaltung durch DNase behindern könnten, während diese DNA-Regionen weniger anfällig wäre für DNS-Eiweiß-Querverbindungen zu produzieren und somit werden als Nukleosom-frei bestimmt würde Regionen mit Jahrmarkt-9. Auch das Vorhandensein von nicht-Histon-Proteine wie RNA-Polymerasen oder Leser Proteine für die epigenetischen Markierungen kann dazu führen, dass die DNA/Protein Querverbindungen und somit als Protein verpackt Regionen FAIRE Experimente interpretiert werden würde. Diese Einschränkungen sind jede Methode für die Bestimmung des Staates Chromatin, wodurch die Notwendigkeit, eine Kombination von verschiedenen Methoden verwenden, um einen umfassenden Einblick zu erhalten.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchte Tilman Borggrefe (Universität Gießen) für das bitte teilen das Ultraschall-Gerät. Die Arbeit von M.L.S. wird unterstützt durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, das Excellence Cluster Cardio-Pulmonale System (ECCPS, EXC 147/2), der Deutschen Krebshilfe (111447) und der IMPRS-HLR-Programm der Max-Planck-Gesellschaft.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol 25:24:1Carl RothA156.1
Glykogen, 20 mg/mlThermo FisherR0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, RoxThermo FisherAB1162B
Proteinase K, 20 mg/mlThermo FisherEO0491
RNase A, 10 mg/mlThermo FisherEN0531
LeupeptinSigmaL8511
AprotininSigmaA1603
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Sigma78830
milliTUBE 1 ml AFA FaserCovaris520130
Halter milliTUBE 1mlCovaris500371
Covaris S220 Fokussierter UltraschallgerätCovaris
StepOnePlus Real-Time PCR SystemAngewandte Biosisteme4376600

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
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