Summary
Denne undersøgelse præsenterer en forbedret kanin model smittet med Staphylococcus aureus ved at blokere den samme mængde af bakterier i knoglemarven. Vancomycin indlæst calciumsulfat og autogen knogle bruges til antibiotika og knogle reparation behandling. Protokollen kunne være nyttigt for at studere knoglen infektion og regenerering.
Abstract
Knoglen infektion resultaterne fra bakteriel invasion, som er meget vanskelige at behandle i klinisk, ortopædisk og traumatisk kirurgi. Knoglen infektion kan resultere i vedvarende inflammation, osteomyelitis og eventuel knogle ikke-union. Etablering af en gennemførlig, reproducerbare dyremodel er vigtigt for knogle infektion forskning og behandling med antibiotika. Som en in vivo model, er kanin modellen almindeligt anvendt i knoglen infektion forskning. Men tidligere undersøgelser på kanin knogle infektion modeller viste, at infektion status inkonsekvent, da mængden af bakterier var variabel. Denne undersøgelse præsenterer en forbedret kirurgiske metode for at fremkalde knoglen infektion på en kanin, ved at blokere bakterier i knoglemarven. Derefter, kan multi-level evalueringer udført efterprøvning det modellering.
Generelt er er debriding nekrotisk væv og implantation af vancomycin-loaded calciumsulfat (VCS) fremherskende i antibiotisk behandling. Calciumsulfat i VCS fordele osteocyte kravler og nye knoglevækst, opstå massive knogledefekter efter debriding. Autogen knogle (AB) er en tiltalende strategi for at overvinde knogledefekter til behandling af massive knogledefekter efter debriding nekrotisk knogle.
I denne undersøgelse brugte vi hale ben som en autogen knogle implanteret i knoglen defekt. Knogle reparation blev målt ved hjælp af mikro-beregnet-tomografi (mikro-CT) og histologiske analyse efter animalske offer. Som et resultat, i gruppen VCS blev knogle ikke-union konsekvent opnået. Derimod var knogle defekt områder i gruppen VCS-AB faldet betydeligt. Den nuværende modellering metode beskrevet en reproducerbar, gennemførlige, stabil metode for at forberede en knogle infektion model. VCS-AB behandlingen resulteret i lavere ben ikke-union efter behandling med antibiotika. Forbedret knoglen infektion model og kombinationsbehandling af VCS og autogen knogle kunne være nyttige i at studere de underliggende mekanismer i knoglen infektion og knogle regenerering relevant at traumatologi ortopædisk applikationer.
Introduction
Knoglen infektion resultater normalt fra bakterier eller andre mikroorganisme invasion efter traumer, knoglebrud eller andre knogle sygdomme1. Knoglen infektion kan fremkalde et højt niveau af betændelse og knogle væv destruktion. I klinikken er Staphylococcus aureus (S. aureus) den fremherskende agens af knoglen infektion2,3. Knoglen infektion er smertefuld og invaliderende, og ofte tager en kronisk kursus, der er meget vanskelige at behandle4. På nuværende tidspunkt er debridering af nekrotisk væv og implanterer af vancomycin-loaded calcium (VCS) perler blevet bekræftet som en effektiv strategi til styring af lokal infektion5,6. Men 10-15% af patienterne oplevede en langvarig knogle reparationsprocessen, forsinket heling, eller ikke-union efter anti-infektion behandling7. Det store segment af en knogle defekt er det vanskeligste problem for ortopædiske kirurger. En autolog knogletransplantation anses for optimal knogle udskiftning i knoglen ikke-union behandling8,9.
Til dato, de fleste af undersøgelser af knoglen er infektion og autolog knogle implantation blevet gennemført i forskellige former for dyremodeller, som rotter, kaniner, hunde, grise og får10,11. Kanin modeller er mest almindeligt anvendt til knoglen infektion undersøgelser, som første udført af Norden og Kennedy i 197012,13. I vores tidligere undersøgelse, brugte vi kanin modeller efter Nordens metode, og vi fandt, at mængden af S. aureus indsprøjtes i knoglemarven ikke kan kvantificeres præcist, som blodet siver ud af knoglemarven førte til bakterier løsning overløb.
Denne artikel præsenterer en forbedret kirurgiske metode for at fremkalde knoglen infektion på kaniner. I slutningen af proceduren, blev en blodprøve biokemi, en bakteriologisk undersøgelse og en histopatologisk undersøgelse udført for at kontrollere knoglen infektion model. Derefter, VCS blev implanteret for at hæmme infektion, og autogen knogle blev implanteret for at fremme bone regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kaniner anvendes i den foreliggende undersøgelse blev behandlet i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle de eksperimentelle procedurer blev fulgt af regler for bioetik Udvalget af Zhejiang Academy af traditionel kinesisk medicin.
1. forberedelse af den bakterielle Suspension
- Opløs 0,5 mg af S. aureus frysetørring pulver (ATCC 6538) med 0,3 mL af næringssubstratet Luria-Bertani. Bland suspension helt.
- Streak bakterier suspension på tryptic soja agar plader og inkuberes i bakteriel kolonier ved 37 ° C i 16 h.
- Vælg en enkelt bakteriel kolonidannende enheder (CFU) og kultur i tryptic soja bouillon rør til 24 h. udføre en subkultur i cirka 24 timer ved 37 ° C, og få midt-logaritmisk vækst fase bakterier efter 16 til 18 h, når den optiske density (OD) værdi er 0,6 på 600 nm 14.
- 1 mL af bakterier suspension overføres til et centrifugeglas. Der centrifugeres i 5 min på 825 x g og 4 ° C, og supernatanten. Resuspend og vaske bakterier med 100 µL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS); Gentag dette trin 3 gange. Endelig resuspend bakterier med 3 mL PBS.
-
Anslå bakterier koncentrationen ved hjælp af Mcfarland's turbidimetry15.
- Overfør 100 til 500 µL af bakterier suspension til en kolorimetrisk tube, indtil turbiditet er svarende til en 0,5 McFarland standard.
- Vurdere turbiditet af visuelle sammenligning til 0,5 McFarland, når indholdet af bakterier når ca 108 CFU/mL.
Bemærk: Sørg for mængden af bakterier suspension er tilstrækkelig for de følgende protokoller. For hver kanin er mængden af bakterier suspension mindre end 1 mL.
- Overføre 0,2 mL af bakteriel suspension til en agar plade og anvende det jævnt. Inkuber plade ved 37 ° C i 16 h. Count bakterier-kolonier for at kontrollere CFU af bakterier suspension.
2. forberedelse af knoglen infektion modeller
- Holde mandlige New Zealand hvide kaniner, 3 måneder, i individuelle bure under air-kontrollerede betingelser (20 ± 1 ° C) og 12 h/12 h lys-mørke belysning cyklusser. Tilbyder rutinemæssig kost og vand fra hanen dagligt.
- Sikre, at på tidspunktet for kirurgi, kaninen vejer mere end 3 kg.
- Anaesthetize kaniner ved intraperitoneal injektion med pentobarbital natrium (3 mg / 100 g kropsvægt). Kontroller, at kaniner er fuldt bedøvede af en manglende evne til at reagere på en pote knivspids. Fix kaniner på operationsbordet under operation procedure.
Bemærk: Sørg for, at modellering procedure varighed er mindre end 1 time. - Barbere proksimale tibia regionen ved hjælp af en elektrisk barbermaskine imod hårenes vækstretning. Desinficere huden ved at anvende en povidon-jodopløsning.
- Markere den øvre ende af skinnebenet og bore hul holdning til injektion med S. aureus (afstanden til den øvre ende af skinnebenet er 1,5 cm) med blyant og lineal. Sørg for at bore hul positioner er midt i den tibial plateau vandret (fig. 1A).
- Skære tibia huden ved hjælp af en No. 11 skalpel og gøre en 1 cm incision i periosteum (figur 1B, C). Punch et 2 mm diameter hul i skinnebenet ved hjælp af en elektrisk knogle drill enhed (fig. 1D).
- Tryk på 2 mm hullerne i den tibial plateau med en cylinder af knogle voks af diameter 2 mm og 2 mm højde (figur 1E). Fjern den overskydende knogle voks langs det vandrette plan af den tibial plateau (figur 1F). Kontroller, 2 mm hul er fuld af knogle voks (figur 1G).
Bemærk: Sikre at hullerne er fuld af knogle voks ved at kontrollere hul med eller uden blod overløb. - Sy op periosteum og hud med resorberbare kirurgiske sutur i en lodret madras sutur at forhindre dyret fra tygge suturer (figur 1H).
- Injicér 1 x 108 CFU/mL af S. aureus løsninger (30 µL pr. 100 g kropsvægt) med en 1 mL aseptik injektor (figur 1jeg). Sørg for nåle trænge knogle voks og injicere S. aureus løsning i knoglemarven langsomt.
- Holde dyret varm og ren betingelser at undgå varmetab efter modellering. Monitor respirationsfrekvens og puls. Efter at vågne, hus kaniner i individuelle bure med fri adgang til mad og vand.
3. evaluering af knoglen infektion Model
- På dag 7, 14, 21 og 28 efter infektion, skal du placere kaniner i kanin fixer med hoved og øre uden for fixer.
-
Tegne 2 mL blod fra auricular venerne i en dikalium ethylendiamintetra syre (EDTA-K2) antikoagulerende blod beholder. Trække 1 mL af blodet fra et blodkar i en beholder, blod. Der centrifugeres serum i 10 min med en hastighed af 651 x g ved stuetemperatur.
- Bestemme hvide blodlegemer (WBC) i fuldblod ved hjælp af en blod biokemiske analyzer, og C - reaktivt protein (CRP) af en enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) metode16.
- På dag 7, 14, 21 og 28 efter infektion, anaesthetize en model kanin med pentobarbital natrium med dosis på 3 mg pr. 100 g kropsvægt. Skære tibia huden ved hjælp af en No. 11 skalpel og gøre en 2 cm indsnit i periosteum (fig. 2A).
- Ren knogle voks. Debridér nekrotisk knogle af stansning to tilstødende 4,8 mm huller ved hjælp af en elektrisk knogle drill enhed (fig. 2B). Debridér nekrotisk knoglemarven og granulationsvæv ved hjælp af en knogle skeen (figur 2C).
Bemærk: Ren knoglevæv under debridering at undgå knoglevævet forbliver i knoglemarven. - Skrabe og rense knoglevæv mellem de to huller (figur 2D).
- Sprede 1 mL af knoglemarv på får blod agar plader. Inkuber plader natten over ved 37 ° C. Vælg plader af 30-300 kolonier, og beregne antallet af kolonier.
- I slutningen af dagen 28 efter infektion, udtrække tibia enheder langs kanterne af knæ og ankel samlinger. Fix tibia modellerne i 4% PARAFORMALDEHYD for 24 h. Decalcify tibia prøver i 10% EDTA i 8 uger.
- Dehydrere tibia modellerne i en gradueret serie af ethanol fortyndinger, og integrer derefter i paraffin voks. Skær 4 træk 5 µm sektioner fra de koronale fly. Pletten sektioner med en hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning kit.
- Bruge et mikroskop til at se de farvede dele og registrere transmitteres lys billeder med standard-software.
4. forberedelse af VCS perler
- Tilføje 1 g af vancomycin hydrochlorid pulver til 9,5 g af medicinsk kvalitet calciumsulfat, og derefter tilsættes 3 mL normale saltvand til blandet magt. Bland dem grundigt med en spatel for 30 til 45 s.
- Placere den blandet produkt i en fleksibel silica gel mug (cylinder 4,8 mm diameter og 4,8 mm højde), og tørt ved stuetemperatur for 15 min. Fjern VCS perler af nedbøjning formen.
5. antibiotisk behandling og Implantation af autogen knogle
- Anaesthetize model kaniner med pentobarbital natrium med dosis på 3 mg pr. 100 g kropsvægt på de 28th dag efter infektion. Barbere proksimale tibia regionen ved hjælp af en elektrisk barbermaskine. Desinficere huden ved at anvende povidon-jodopløsning.
Bemærk: Sørg for at den modellering procedure er mindre end 1 time. - Barbere hale regionen ved hjælp af en elektrisk barbermaskine og desinficere halen ved at anvende povidon-jodopløsning.
- Skære ned halen ved hjælp af kirurgiske saks. Klip hale huden ved hjælp af en No. 11 skalpel og afsløre halen knoglen. Sy op huden på halen region med resorberbare kirurgiske suturer i en lodret madras sutur at forhindre dyret fra tygge suturer.
- Fjerne enhver muskel, bløddele og periost. Frigøre halen knoglen på hvert fælles og overføre knogle fragment til en 100 mm plast parabol der indeholder sterilt saltvand.
- Implantatet 4 stykker af VCS perler (cylinder 4,8 mm diameter og 4,8 mm højde, 1,25 mg vancomycin pr. stykke perle) ind i marv hulrum med buet pincet (figur 2E).
- Fylde knogle defekt med 8 stykker af autogen knogler (cylinder med diameter på 2 mm og 4 mm højde pr. hvert stykke) bruger buet pincet (figur 2E).
- Sy op periosteum og hud med resorberbare kirurgiske suturer i en madras sutur måde (figur 2F).
Bemærk: Holde en temperatur på 25 ° C under operationen. - Holde dyret varm og ren betingelser at undgå varmetab efter operationen. Monitor respirationsfrekvens og puls. Efter at vågne, hus kaniner i individuelle bure med fri adgang til mad og vand.
6. vurderinger af antibiotiske aktivitet
- Sætte kaniner i en kanin fixer, og placere hovedet og øre uden for fixer på 2, 4, 6-8 uger efter behandling.
- Trække blod fra auricular vener med EDTA-K2 antikoagulerende blodkar. Trække 1 mL af blodet fra et blodkar i en beholder, blod. Der centrifugeres serum i 10 min med en hastighed af 651 x g ved stuetemperatur.
- Bestemme de hvide blodlegemer (WBC) i fuldblod ved hjælp af blod biokemiske analyzer, og C - reaktivt protein (CRP) ved en ELISA-metoden16.
7. vurderinger af knogle regenerering
- Aflive kaniner ved indblæsning med en over doser af pentobarbital natrium, i slutningen af 8 eller 12 uger efter behandling.
- Uddrag tibia prøver, langs kanterne af knæ og ankel samlinger. Debridér muskler og fascial lag.
- Analysere strukturen i skinnebenet ved hjælp af mikro-beregnet tomografi (mikro-CT). Vælg et ovalt område 4,8 mm diameter og 9,6 mm længe region af interesse (ROI). Rekonstruere 3D model billeder ved hjælp af bitmap data.
- Vælg snesevis af forholdet mellem knogle volumen/væv bind (BV/TV), trabekulær tykkelse (Tb.Th), trabecula nummer (Tb.N) og trabekulær separation (Tb.Sp)from the3D modeller til at vurdere knogle regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluering af knoglen infektion Model
Efter infektion med S. aureusblev de patologiske manifestationer af kaniner svarer til de repræsentative symptom på kronisk osteomyelitis i klinikken. I vores undersøgelse, 30 kaniner blev smittet, og udsat for som en modelgruppe, og 10 kaniner blev udsat som kontroldyr. Alle model kaniner har inficeret bihuler af tibia lokale site, med hvide og gule pus over flow fra bihuler (fig. 3A). Resultaterne af H & E farvning tyder på bakteriel aggregater er placeret i nærheden af død knogle i modelgruppen som normale osteocytes ikke kan identificeres. For CRP og WBC er højere i modelgruppen end kontrolgruppen (figur 3B). Nekrotisk knoglemarv lysates er stribet på agar plader, hvilket resulterer i en øget antallet af kolonier for modelgruppen efter infektion (figur 3C). I slutningen af modellering var der 3 kaniner døde på grund af alvorlig infektion. De resterende smittede kaniner blev identificeret som knoglen infektion model og var opdelt i 3 grupper: model gruppe, VCS gruppe og VCS-AB gruppen.
Vurderinger af antibiotiske aktivitet og knogle regenerering
2, 4, 6 og 8 uger efter behandling med VCS eller VCS-AB, niveauer af CRP og WBC er reduceret betydeligt (figur 4A). Efter 12 uger af implantation af VCS og knogle allograft syntes tibial defekter af VCS-AB-Gruppen fuldt coalescent. Tibia plateauet overflader af gruppen VCS-AB er fladere end gruppen VCS. 2D genopbygning billeder viser en gradvis stigning i knoglen volumen i 12 uger efter behandling med VCS-AB og VCS, mens knogletab er betydelig i modelgruppen (fig. 4B). For at analysere knogle regenerering kvantitative indeks, et ovalt område 4,8 mm diameter og 9,6 mm lang blev valgt som regionen af interesse (ROI) (fig. 4C), og 3D model billeder blev rekonstrueret ved hjælp af bitmap data. Mikro-CT indekser BV/TV i modelgruppen var betydeligt lavere end at i VCS og VCS-AB grupper. Tb.N og Tb.Th scores i gruppen VCS-AB var betydeligt højere end i model og VCS gruppe. Desuden er Tb.Sp scorer i gruppen VCS-AB markant lavere end i den model og VCS gruppen (figur 4D).
Disse resultater tyder at infektion med S. aureus årsager stigende WBC og CRP i modelgruppen, der kan nedskrives ved hjælp af VCS. Implantation af VCS er betragtet som den optimale behandling med antibiotika. Men ben defekt er observerbare i gruppen VCS. VCS og autogen knogle behandling øge bjælkerne tykkelse og bjælkerne antallet og mindske den trabekulær adskillelse. VCS-AB-behandling viste evne til at fremme knogleheling.
Figur 1 . Kirurgisk forberedelse af knoglen infektion model. (A) viser den stansning position på skinnebenet. Afstanden mellem positionen bore hul til injektion med S. aureus til den øvre ende af tibia er 1,5 cm. (B) lavet snit i huden for at eksponere periosteum. (C) viser indsnit foretaget gennem periosteum at udsætte tibia. (D) Punch et 2-mm diameter hul i skinnebenet. (E) fyld 2 mm diameter hul fuld af knogle voks. (F) afskære overskydende knogle voks. (G) Vis knogle voks påfyldning knogle defekt. (H) sy op periosteum og hud. (jeg) Inject med S. aureus løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Forberedelse af knogle allograft og antibiotika behandling. (A) indsnit foretages i huden til at eksponere periosteum. (B) Punch to tilstødende 4,8 mm huller. (C) Debridér nekrotisk knogle og inflammatoriske knoglemarv. (D) skrabe og rense knoglevæv mellem de to huller til at gøre en lang cirkel af 4,8 mm diameter og 9,6 mm lang. (E) fyld hullet med VCS og knogle allograft. (F) sy op periosteum og hud. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Evaluering af knoglen infektion model. (A) udseende funktioner af kanin ben inficeret med S. aureus, og typiske histopatologiske billeder af kanin skinnebenet i model og kontrol grupper. Blå pil: osteocyte; Pink pil: knogle bjælkerne; gul pil: bakteriel aggregater; grøn pil: død knogle. (B) WBC og CRP resulterer i kaninserum ved tid før modellering, 7, 14, 21 og 28 dage efter infektion. Kolonnerne repræsenterer den gennemsnitlige ±SE, *p < 0,05 kontra kontrolgruppen. (C) antallet af bakteriel kolonier i tibia marv medregnet efter natten inkubation. Kolonnerne repræsenterer den gennemsnitlige ±SE, *p < 0,05 vs kimtal på dag 0. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Vurderinger af antibiotiske aktivitet og knogle regenerering. (A) resultaterne af WBC og CRP i kaninserum på tidspunkter af 2, 4, 6-8 uger efter implantation af VCS og VCS-AB, punkterne, der repræsenterer den gennemsnitlige ±SE, #p < 0,05 og *p < 0,05 i forhold til modelgruppen. (B) den koronale del billeder af tibia analyseret af mikro-CT. (C) placeringen af ROI. (D) histogrammer Vis knoglen volumen/væv bind (BV/TV), trabekulær tykkelse (Tb.Th), trabecula nummer (Tb.N) og trabekulær separation (Tb.Sp) vurdering af Investeringsafkast fra fem kaniner pr. gruppe. Kolonnerne repræsenterer den gennemsnitlige ±SE, *p < 0,05 vs kontrolgruppen eller den model. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Tidslinjen af alle procedurerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de tidligere undersøgelser, blev forskellige slags dyremodeller bygget for at studere både akutte og kroniske knoglen infektion; søgning efter den ideelle model eksisterer dog stadig17,18. Desuden forventes ideelle knoglen infektion model at simulere de patologisk Karakteristik af knoglen infektion i kliniske omgivelser, mens de modellering perioder, forblive lave omkostninger og let at gennemføre. Hidtil, er kanin knoglen infektion model den mest almindelige model i inflammatoriske knogle sygdom forskning, som kaniner er tilgængelige, gennemførlige og billig. I vores tidligere undersøgelse sammenlignede vi den død og infektion sats af kaniner med varierende krop vægte. Resultaterne viste, at kropsvægten bør være mere end 3 kg. ellers, ville der være en høj dødelighed eller en høj forekomst af haematosepsis og en højere dødelighed efter operation.
I modsætning til tidligere undersøgelser er kanin knoglen infektion modeller og antibiotisk behandling i vores undersøgelse i overensstemmelse med de patologisk Karakteristik af menneskers sygdom og den kirurgiske behandling. I den tidligere undersøgelse havde dyr injiceres med natrium morrhuate og S. aureus patologiske status mere end 60 dage. Dødeligheden var desuden mere end 20%12,19. Overløb S. aureus løsning fra knogledefekter havde vist sig for at fremkalde en lav infektion sats. Vi brugte knogle voks til at fylde 2 mm hul på skinnebenet, for at blokere S. aureus løsningen i knoglemarven og sørget for, at hullerne var fulde af knogle voks ved at kontrollere hul med eller uden blod overløb. Som en kanin tibia tykkelse 2 mm, vi pressede en cylinder med diameter på 2 mm og 2 mm højde knogle voks ind i de 2 mm huller, der sikrede knogle voks fyldt hullet og kunne ikke infiltrere knoglemarven. Desuden, som knogle voks var fleksibel og stabil, det fyldt hullerne og kunne ikke smelte eller reagere med knoglemarv. I vores undersøgelse, på 28 dagen efter infektion, knogle voks var stadig komplet og fyldt hullerne fuldt ud. Som vægte af kaniner var mere end 3 kg og mindre end 3,2 kg, var mængden af bakterier suspension 900 µL til 960 µL. På grund af den langsomme hastighed af injektion og blokering funktion af knogle voks, kunne denne mængde af bakterier suspension injiceres i knoglemarven uden højtryk. Resultaterne viste, at denne protokol sikrer mængden af S. aureus inficeret i knoglemarven. En 2 mm diameter hul blev slået i skinnebenet at sikre, at afstanden til den øvre ende af skinnebenet er 1,5 cm, som lokaliserer i hullet på den tibial plateau, sikre tilstrækkelig plads til at Debridér og implantat VCS perler og autogen knogle i den følgende behandling. Under modelleringsprocessen døde 3 kaniner på grund af alvorlig infektion. De forblev kaniner identificeret som knoglen infektion kaniner, og infektion sats i de resterende kaniner var 100%. Sammenlignet med andre knogle infektion protokoller, såsom implantation af svampe vædet med S. aureus eller implantation af fremmedlegemer, vores protokoller tæt simulere knoglen infektion i kliniske omgivelser, og har kun ringe effekt på procedurer, sådan som debriding nekrotisk knogle og antibiotisk behandling.
Diagnosticering af knoglen infektion er en udfordring at kirurger. Laboratorium testresultater, herunder serum betændelse markør registrerings, mikrobiologi analyse og histopatologi analyse blev brugt til at evaluere knoglen infektion i klinisk indstillinger20. Også, billeddiagnostik, såsom ultralyd, radiologi, computertomografi, magnetisk resonans imaging eller Raman spektroskopi var anvendes til påvisning af knogle infektion21. Diagnosticering osteomyelitis gennem imaging metoder er desværre ofte forsinket fordi knoglen nekrose er vanskelige at påvise ved almindelig røntgenfotografering indtil uge 3 af infektion. I vores undersøgelse brugte vi serum betændelse markør påvisning og histopatologi analyse for at evaluere knoglen infektion modeller, som disse metoder var effektiv, betjenes og indeksene blev følsomme. Følgende var de vigtigste trin i den kirurgiske procedure til at oprette en knogle infektion model i vores undersøgelse. Vælg kaniner med passende kropsvægt til at udføre kirurgi og behandling. Opretholde et sterilt miljø under den hæve og kirurgisk procedure, og sikre varme betingelser efter kirurgisk procedure-protokollen. Punch et 2 mm diameter hul i skinnebenet, og sikre afstanden til den øvre ende af skinnebenet er 1,5 cm. Fyld hullet med knogle voks, og sy op periosteum og huden for at hindre bakterier løsning. De vigtigste trin i antibiotisk behandling er følgende. Sikre patologiske knoglen infektion af kaniner ved at afsløre WBC i fuldblod og CRP i serum. Debridér nekrotisk knogle helt, punch to tilstødende 4,8 mm huller og skrabe og rense knoglevæv mellem de 2 huller. Implantatet 4 stykker af VCS perler og 8 stykker af autogen knogle i knoglemarven og knogle defekt.
Efter behandling med antibiotika konstaterede vi, at kaniner i gruppen VCS-AB havde en højere osteogenic potentiale end i gruppen VCS. Dette kan være fordi autogen knoglen indeholder aktiveret osteocytes og knogle dannelsen vækstfaktorer, der producerer knoglematrix hele graft overflade, der henviser degradering af VCS inducerer knappe knogle matrix på regionen defekt. Vores resultater viser, at autogen knoglen har overlegen osteogenic kapacitet. Selvom autogen knogle høst er begrænset i mængde og indebærer sygelighed til webstedet donor, er betydningen af autogen knogle ikke ubetydelig22,23,24. I vores undersøgelse, var autogen knoglen erhvervet fra halen knoglen, som undgår systemiske skade, og formindsker dødelighed i forhold til at få autogen knogle fra iliaca knogle. Autograft knogle fra halen knoglen er kan være den foretrukne pode materiale i de dyr undersøgelse af knoglen infektion.
Afslutningsvis blev en forbedret kanin model af knoglen infektion etableret i denne undersøgelse. Betændelse indekser og blod biokemiske indeks blev brugt til at estimere knoglen infektion model. Også, efter behandling med antibiotika, multi-niveau analyser blev udført for at opdage antibiotiske aktivitet og knogle regeneration evne. Modellering, behandling protokoller og evalueringsmetoder er gennemførlig og pålidelige. Yderligere undersøgelser vil blive fokuseret på at drage fordel af multimodalitet visuelle hjælpemidler til at overvåge den patologiske proces af knoglen infektion og knogle reparationsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapport ingen interessekonflikter i dette arbejde.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81803808, 81873062), Zhejiang provinsens medicinsk og Sundhedsvidenskab og teknologi Fund (2017KY271) og videnskab og teknologi projekt i Zhejiang provinsen (2017C 37181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absorbable surgical suture | Jinghuan | 18S0604A | |
| asepsis injector | Jinglong | 20170501 | |
| bone wax | ETHICON | JH5CQLM | |
| CCD camera | Olympus | DP72 | |
| EDTA-K2 anticoagulant blood vessel | XINGE | 20170802 | |
| Electric bone drill unit | Bao Kang | BKZ-1 | |
| Electric shaver | Codos | 3800 | |
| flexible silica gel mold | WRIGHT | 1527745 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime | 20170523 | |
| Luria-Bertani culture medium | Baisi Biothchnology | 20170306 | |
| Medical-grade calcium sulphate | WRIGHT | 1527745 | |
| microcomputed tomography (micro-CT) | Bruker | SkyScan 1172 | |
| Microscope | Olympus | CX41 | |
| New Zealand white rabbits | Zhejiang Experimental Animal Center | SCXK 2014-0047 | |
| No. 11 scalpel | Yuanlikang | 20170604 | |
| normal saline | Mingsheng | 20170903 | |
| PBS | TBD(Jingyi) | 20170703-0592 | |
| pentobarbital sodium | Merk | 2070124 | |
| povidone-iodinesolution | Lierkang | 20170114 | |
| S. aureus freeze drying powder | China General Microbiological Culture Collection Center | ATCC 6538 | |
| sheep blood agar | HuanKai Microbial | 3103210 | |
| tryptic soy agar plates | HuanKai Microbial | 3105697 | |
| tryptic soy broth tubes | HuanKai Microbial | 3104260 | |
| Vancomycin | Lilly | C599180 |
References
- Malizos, K. N. Global Forum: The Burden of Bone and Joint Infection: A Growing Demand for More Resources. Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 99, 20 (2017).
- Peeters, O. Teicoplanin - based antimicrobial therapy in Staphylococcus aureus bone and joint infection: tolerance, efficacy and experience with subcutaneous administration. BMC Infectious Diseases. 16, 622 (2016).
- Sugaya, H., et al. Percutaneous autologous concentrated bone marrow grafting in the treatment for nonunion. European Journal of Orthopeadic Surgery and Traumatology. 24, 671-678 (2014).
- Birt, M. C., Anderson, D. W., Bruce, T. E., Wang, J. Osteomyelitis: Recent advances in pathophysiology and therapeutic strategies. Journal of Orthopeadics. 14, 45-52 (2017).
- Walter, G., Kemmerer, M., Kappler, C., Hoffmann, R. Treatment algorithms for chronic osteomyelitis. Deutsches Arzteblatt International. 109, 257-264 (2012).
- Henriksen, K., Neutzsky-Wulff, A. V., Bonewald, L. F., Karsdal, M. A. Local communication on and within bone controls bone remodeling. Bone. 44, 1026-1033 (2009).
- Mendoza, M. C., et al. The effect of vancomycin powder on bone healing in a rat spinal rhBMP-2 model. Journal of Neurosurgery Spine. 25, 147-153 (2016).
- Cohn Yakubovich, D., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. Journal of Visualized Experiments. (106), e53459 (2015).
- Brecevich, A. T., et al. Efficacy Comparison of Accell Evo3 and Grafton Demineralized Bone Matrix Putties against Autologous Bone in a Rat Posterolateral Spine Fusion Model. Spine Journal. 17, 855-862 (2017).
- Jensen, L. K., et al. Novel porcine model of implant-associated osteomyelitis: A comprehensive analysis of local, regional, and systemic response. Journal of Orthopeadic Research. 35, 2211-2221 (2016).
- de Mesy Bentley, K. L., et al. Evidence of Staphylococcus Aureus Deformation, Proliferation, and Migration in Canaliculi of Live Cortical Bone in Murine Models of Osteomyelitis. Journal of Bone and Mineral Research. 32, 985-990 (2017).
- Norden, C. W., Kennedy, E. Experimental osteomyelitis. I: A description of the model. Journal of Infectious Diseases. 122, 410-418 (1970).
- Mistry, S., et al. A novel, multi-barrier, drug eluting calcium sulfate/biphasic calcium phosphate biodegradable composite bone cement for treatment of experimental MRSA osteomyelitis in rabbit model. Journal of Controlled Release. 239, 169-181 (2016).
- Bernthal, N. M., et al. Combined In vivo Optical and µCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51612 (2014).
- Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. Journal of Visualized Experiments. (103), e53028 (2015).
- Uttra, A. M., et al. Ephedra gerardiana aqueous ethanolic extract and fractions attenuate Freund Complete Adjuvant induced arthritis in Sprague Dawley rats by downregulating PGE2, COX2, IL-1β, IL-6, TNF-α, NF-kB and upregulating IL-4 and IL-10. Journal of Ethnopharmacology. 224, 482-496 (2018).
- Harrasser, N., et al. A new model of implant-related osteomyelitis in the metaphysis of rat tibiae. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 152 (2016).
- Abedon, S. T. Commentary: Phage Therapy of Staphylococcal Chronic Osteomyelitis in Experimental Animal Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1251 (2016).
- Tan, H. L., Ao, H. Y., Ma, R., Lin, W. T., Tang, T. T. In vivo effect of quaternized chitosan-loaded polymethylmethacrylate bone cement on methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis infection of the tibial metaphysis in a rabbit model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 6016-6023 (2014).
- Chiara, L., et al. Detection of Osteomyelitis in the Diabetic Foot by Imaging Techniques: A Systematic Review and Meta-analysis Comparing MRI, White Blood Cell Scintigraphy, and FDG-PET. Diabetes Care. 40, 1111-1120 (2017).
- Khalid, M., et al. Raman Spectroscopy detects changes in Bone Mineral Quality and Collagen Cross-linkage in Staphylococcus Infected Human Bone. Scientific Reports. 8, 9417 (2018).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, 513-517 (2015).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7, 1169-1171 (2014).
- Takehiko, S., et al. Preliminary results of managing large medial tibial defects in primary total arthroplasty: autogenous morcellised bone graft. International Orthopaedics. 41, 931-937 (2017).
