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अस्थि संक्रमण के एक बेहतर खरगोश मॉडल में vancomycin लोड कैल्शियम सल्फेट और autogenous हड्डी के साथ उपचार

Published: March 14, 2019 doi: 10.3791/57294
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Orthopaedic Surgery, Tongde Hospital of Zhejiang Province, 3Institute of Orthopaedics and Traumatology, First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, 4Department of Clinical Laboratory, Tongde Hospital of Zhejiang Province
* These authors contributed equally

Summary

यह अध्ययन अस्थि मज्जा में बैक्टीरिया की एक ही राशि को अवरुद्ध द्वारा स्टेफिलोकोकस ऑरियस से संक्रमित एक बेहतर खरगोश मॉडल प्रस्तुत करता है । vancomycin लोड कैल्शियम सल्फेट और स्वगत हड्डी एंटीबायोटिक और अस्थि की मरंमत के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है । प्रोटोकॉल अस्थि संक्रमण और उत्थान के अध्ययन के लिए सहायक हो सकता है ।

Abstract

बैक्टीरियल आक्रमण से अस्थि संक्रमण का परिणाम है, जो नैदानिक, आर्थोपेडिक, और दर्दनाक सर्जरी में इलाज के लिए बेहद मुश्किल है । अस्थि संक्रमण निरंतर सूजन, अस्थिमज्जा का प्रदाह, और अंततः अस्थि गैर संघ में परिणाम हो सकता है । एक व्यवहार्य, पुनरुद्मनीय पशु मॉडल की स्थापना अस्थि संक्रमण अनुसंधान और एंटीबायोटिक उपचार के लिए महत्वपूर्ण है । vivo मॉडल में एक के रूप में, खरगोश मॉडल व्यापक रूप से अस्थि संक्रमण अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, खरगोश अस्थि संक्रमण मॉडल पर पिछले अध्ययनों से पता चला है कि संक्रमण की स्थिति असंगत था, के रूप में बैक्टीरिया की मात्रा चर गया था । यह अध्ययन अस्थि मज्जा में बैक्टीरिया को अवरुद्ध करके, एक खरगोश पर हड्डी संक्रमण उत्प्रेरण के लिए एक बेहतर शल्य चिकित्सा पद्धति प्रस्तुत करता है । फिर, मॉडलिंग विधि सत्यापित करने के लिए बहु-स्तरीय मूल्यांकन किए जा सकते हैं ।

सामान्य तौर पर, नेकनेटिक ऊतक और वैन्कोमाइसिन-लोडेड कैल्शियम सल्फेट (vcs) के प्रत्यारोपण के लिए एंटीबायोटिक उपचार में प्रमुख हैं । हालांकि vcs में कैल्शियम सल्फेट osteocyte रेंगने और नए अस्थि विकास, बड़े पैमाने पर अस्थि दोष debriding के बाद होते हैं । autogenous हड्डी (एबी) परिगलन हड्डी debriding के बाद बड़े पैमाने पर अस्थि दोषों के उपचार के लिए अस्थि दोषों को दूर करने के लिए एक अपील की रणनीति है ।

इस अध्ययन में, हम अस्थि दोष में प्रत्यारोपित एक स्वगत हड्डी के रूप में पूंछ की हड्डी का इस्तेमाल किया । अस्थि मरम्मत पशु बलि के बाद माइक्रो-कम्प्यूटेड-टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण का उपयोग कर मापा गया था । नतीजतन, vcs समूह में, अस्थि गैर संघ लगातार प्राप्त किया गया था । इसके विपरीत, vcs-AB समूह में अस्थि दोष क्षेत्रों में काफी कमी आई । वर्तमान मॉडलिंग विधि एक अस्थि संक्रमण मॉडल तैयार करने के लिए एक पुनरुद्भासी, व्यवहार्य, स्थिर विधि का वर्णन किया । vcs-एबी उपचार एंटीबायोटिक उपचार के बाद कम अस्थि गैर संघ दरों में हुई । सुधार अस्थि संक्रमण मॉडल और vcs और स्वगत हड्डी के संयोजन उपचार traumatology आर्थोपेडिक अनुप्रयोगों के लिए उचित अस्थि संक्रमण और अस्थि पुनर्जनन में अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने में सहायक हो सकता है ।

Introduction

अस्थि संक्रमण आमतौर पर आघात, अस्थि भंग, या अन्य अस्थि रोगों के बाद बैक्टीरिया या अन्य सूक्ष्मजीव आक्रमण से परिणाम1. अस्थि संक्रमण सूजन और अस्थि ऊतक विनाश के एक उच्च स्तर को प्रेरित कर सकते हैं । क्लिनिक में, स्टैफिलोकोकस ऑरियस (एस. ऑरियस) अस्थि संक्रमण2,3के प्रमुख कारक एजेंट है । हड्डी संक्रमण दर्दनाक, दुर्बल है, और अक्सर एक पुरानी पाठ्यक्रम है कि अत्यंत4इलाज के लिए मुश्किल है लेता है । वर्तमान में, परिगलन ऊतक और vancomycin-लोड कैल्शियम (vcs) मोती के प्रत्यारोपण के लिए स्थानीय संक्रमण5,6को नियंत्रित करने के लिए एक कुशल रणनीति के रूप में पुष्टि की गई है । हालांकि, 10% से 15% रोगियों के एक लंबे समय तक हड्डी की मरंमत की प्रक्रिया का अनुभव, देरी संघ, या गैर संघ विरोधी संक्रमण उपचार के बाद7। हड्डी दोष के बड़े वर्ग आर्थोपेडिक सर्जन के लिए सबसे कठिन मुद्दा है । एक ऑटोलॉजिकल बोन ग्राफ्ट अस्थि गैर-संघ उपचार8,9में इष्टतम अस्थि प्रतिस्थापन माना जाता है ।

तिथि करने के लिए, अस्थि संक्रमण और ऑटोलॉगस अस्थि आरोपण पर अध्ययन के अधिकांश इस तरह के चूहों, खरगोश, कुत्तों, सूअर और भेड़10,11के रूप में पशु मॉडल, के विभिन्न प्रकार में आयोजित किया गया है । खरगोश मॉडल सबसे अधिक अस्थि संक्रमण अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है, के रूप में पहली १९७०12,13में norden और कैनेडी द्वारा किया जाता है । हमारे पिछले अध्ययन में, हम norden विधि निम्नलिखित खरगोश मॉडल का इस्तेमाल किया, और हमने पाया कि एस ऑरियस अस्थि मज्जा में इंजेक्शन की मात्रा सही रूप से मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता है, के रूप में रक्त अस्थि मज्जा से बाहर लीक बैक्टीरिया समाधान ओवरफ्लो करने के लिए नेतृत्व.

यह लेख खरगोशों पर अस्थि संक्रमण उत्प्रेरण के लिए एक बेहतर शल्य चिकित्सा पद्धति प्रस्तुत करता है । प्रक्रिया के अंत में, एक रक्त जैव रसायन परीक्षण, एक बैक्टीरियोलॉजिकल परीक्षा, और एक हिस्टोथोलॉजिक परीक्षा अस्थि संक्रमण मॉडल को सत्यापित करने के लिए प्रदर्शन किया गया । फिर, vcs संक्रमण को बाधित करने के लिए प्रत्यारोपित किया गया था, और अस्थि उत्थान को बढ़ावा देने के लिए स्वगत हड्डी प्रत्यारोपित किया गया था ।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त खरगोशों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार इलाज किया गया । सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं पारंपरिक चीनी चिकित्सा के झेजियांग एकेडमी के बायोएथिक्स कमेटी के नियमों के पालन के बाद की गई थीं ।

1. बैक्टीरियल निलंबन की तैयारी

  1. ०.५ मिलीग्राम की luria-बर्टनी संस्कृति माध्यम के ०.३ एमएल के साथ एस auरियस फ्रीज-सुखाने पाउडर (atcc ६५३८) के भंग । सस्पेंशन पूरी तरह से मिक्स ।
  2. ट्रिप्टिक सोया आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया निलंबन स्ट्रीक करें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल कालोनियों को 16 एच के लिए सेते हैं ।
  3. चुनें एक एकल बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने इकाई (cfu) और संस्कृति tryptic सोया शोरबा ट्यूबों में 24 के लिए एच. ३७ डिग्री सेल्सियस पर लगभग 24 एच के लिए एक उपसंस्कृति प्रदर्शन, और 16 से 18 एच के बाद मध्य लघुगणकीय विकास चरण बैक्टीरिया प्राप्त करते हैं, जब ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) मूल्य ६०० एनएम पर ०.६ है 14.
  4. एक अपकेंद्री ट्यूब में बैक्टीरिया निलंबन के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण । ८२५ एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रेसेज, और supernatant त्यागें । resuspend और १०० μl फॉस्फेट buffered खारा (pbs) के साथ बैक्टीरिया को धोने; इस चरण को 3 बार दोहराएं । अंत में, 3 मिलीलीटर पीबीएस के साथ बैक्टीरिया resuspend ।
  5. जीवाणुओं की सांद्रता का अनुमान लगाने के लिए मैकफारलैंड की टर्बिडिमेट्री का उपयोग कर15.
    1. एक वर्णमिति ट्यूब तक बैक्टीरिया निलंबन के ५०० μl करने के लिए १०० स्थानांतरण जब तक कि विषमता एक ०.५ mcfarland मानक के बराबर है.
    2. ०.५ mcfarland, जब बैक्टीरिया की सामग्री लगभग 108 cfu तक पहुँचता है के लिए दृश्य तुलना से अधिक मात्रा में विषमता का आकलन/
      नोट: सुनिश्चित करें कि बैक्टीरिया निलंबन की मात्रा निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त है । हर खरगोश के लिए, बैक्टीरिया निलंबन की मात्रा 1 मिलीलीटर से कम है ।
  6. एक आगर प्लेट को बैक्टीरियल निलंबन के ०.२ मिलीलीटर स्थानांतरण और इसे समान रूप से लागू होते हैं । 16 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं । जीवाणुओं की जांच करने के लिए बैक्टीरिया कालोनियों की गणना करें निलंबन ।

2. अस्थि संक्रमण मॉडल की तैयारी

  1. पुरुष ंयूजीलैंड सफेद खरगोश, 3 महीने की आयु, व्यक्तिगत पिंजरों में, हवा के तहत नियंत्रित शर्तों (20 ± 1 ° c) और 12 h/12 एच प्रकाश-अंधेरे रोशनी चक्र रखो । नियमित आहार की पेशकश और नल का पानी दैनिक ।
  2. सुनिश्चित करें कि सर्जरी के समय कि खरगोश 3 किलो से अधिक वजन ।
  3. pentobarbital सोडियम के साथ intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा एनेस्थेटाइज़ खरगोशों (शरीर के वजन के प्रति १०० ग्राम 3 मिलीग्राम) । सुनिश्चित करें कि खरगोश पूरी तरह से एक पंजा चुटकी करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए एक विफलता से एनेस्थेटाइज्ड कर रहे हैं । ऑपरेशन प्रक्रिया के दौरान ऑपरेटिंग तालिका पर खरगोशों को ठीक करें ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि modeling प्रक्रिया अवधि 1 ज से कम है ।
  4. बाल विकास की दिशा के खिलाफ एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करते हुए समीपपाल टिबिया क्षेत्र दाढ़ी । एक पोविटोन-आयोडीन समाधान लागू करके त्वचा को कीटाणुरहित करना ।
  5. टिबिया के ऊपरी छोर को चिह्नित करें और एस. ऑरियस के साथ इंजेक्शन के लिए ड्रिलिंग होल स्थिति (टिबिया के ऊपरी छोर से दूरी १.५ सेमी है) कलम और शासक के साथ । सुनिश्चित करें कि ड्रिलिंग होल स्थितियां क्षैतिज पठार के बीच में हैं (चित्र 1A) ।
  6. एक No .11 स्केलपेल का उपयोग कर टिबिया त्वचा में कटौती और periosteum में एक 1 सेमी चीरा बनाने (चित्रा 1बी, सी) । एक बिजली की हड्डी ड्रिल इकाई (चित्रा 1डी) का उपयोग कर टिबिया में एक 2 मिमी व्यास छेद पंच ।
  7. 2 मिमी व्यास और 2 मिमी ऊंचाई (चित्रा 1ई) की हड्डी मोम के एक सिलेंडर के साथ टिबियल पठार में 2 मिमी व्यास छेद दबाएं । टिबियल पठार के क्षैतिज तल के साथ स्पेयर बोन वैक्स निकालें (चित्रा 1एफ) । जांच करें कि 2 मिमी छेद हड्डी मोम से भरा है (चित्रा 1जी) ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि छेद के साथ या रक्त अतिप्रवाह के बिना छेद की जांच करके हड्डी मोम से भरे हुए हैं ।
  8. एक ऊर्ध्वाधर गद्दे सीवन में अवशोषित शल्य सीवन के साथ periosteum और त्वचा सीना को सिलाई (चित्रा 1ज) चबाने से पशु को रोकने के लिए ।
  9. 1 मिलीलीटर एसेप्सिस इंजेक्टर (चित्रा 1I) के साथ एस. ऑरियस सॉल्यूशंस (शरीर के वजन का १०० ग्राम प्रति 30 μl) के 108 cfu/एमएल सुई । सुनिश्चित करें कि सुई हड्डी मोम में घुसना और एस. ऑरियस सॉल्यूशन को अस्थि मज्जा में धीरे से सुई लगाना ।
  10. मॉडलिंग के बाद गर्मी घटाने से बचने के लिए जानवरों को गर्म और साफ स्थिति में रखें । श्वसन दर और दिल की दर पर नजर रखें । जागने के बाद, भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ व्यक्तिगत पिंजरों में खरगोशों को घर करें ।

3. अस्थि संक्रमण मॉडल का मूल्यांकन

  1. दिन में 7, 14, 21 और 28 संक्रमण के बाद, खरगोश फिक्सर के सिर और कान के बाहर फिक्सर के बाहर के साथ खरगोशों में जगह है ।
  2. एक dipotassium एथिलिनेडिअम्मिनेटेट्राएसिटिक एसिड (edta-K2) एंटीकोगुलेंट रक्त कंटेनर में ऑरिकुलर नसों से 2 मिलीलीटर रक्त ड्रा । रक्त वाहिकाओं से रक्त के कंटेनर में 1 मिलीलीटर रक्त खींचें । कमरे के तापमान पर ६५१ एक्स जी की गति के साथ 10 मिनट के लिए सीरम को अपकेंद्रिकृत करना ।
    1. एक रक्त जैव रासायनिक विश्लेषक का उपयोग कर पूरे रक्त में सफेद रक्त कोशिका गिनती (wbc) का निर्धारण, और सी-रिएक्टिव प्रोटीन (सीआरपी) एक एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (elisa) विधि16.
  3. दिन में 7, 14, 21 और 28 संक्रमण के बाद, एनेस्थेटाइज़ एक मॉडल खरगोश pentobarbital सोडियम के साथ 3 मिलीग्राम प्रति १०० जी शरीर के वजन की खुराक पर । एक No .11 स्केलपेल का उपयोग कर टिबिया त्वचा में कटौती और periosteum में एक 2 सेमी चीरा बनाने (चित्रा 2ए) ।
  4. साफ हड्डी मोम । एक इलेक्ट्रिक बोन ड्रिल यूनिट (चित्रा 2बी) का उपयोग कर दो आसन्न ४.८ मिमी व्यास छेद छिद्रण द्वारा debride परिगलन हड्डी । debride परिगलन अस्थि मज्जा और कणिकायन ऊतक एक हड्डी चंमच का उपयोग (चित्रा 2सी) ।
    नोट: अस्थि मज्जा में शेष अस्थि ऊतक से बचने के लिए debridement के दौरान अस्थि ऊतक साफ ।
  5. दो छिद्रों के बीच अस्थि ऊतक को कुरेदना और साफ करना (चित्र 2घ) ।
  6. भेड़ रक्त आगर प्लेटों पर अस्थि मज्जा का प्रसार 1 मिलीलीटर । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते प्लेट । 30-300 कॉलोनियों की प्लेटें चुनें, और कालोनियों की संख्या की गणना करें ।
  7. संक्रमण के बाद 28 दिन के अंत में, घुटने और टखने के जोड़ों के किनारों के साथ टिबिया नमूनों को निकालें । टिबिया के नमूनों को 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में ठीक करें 24 घंटे के लिए 10% edta में टिबिया नमूनों को 8 सप्ताह के लिए decalcify ।
  8. इथेनॉल dilutions की एक वर्गीकृत श्रृंखला में टिबिया नमूनों dehydrate, और फिर पैराफिन मोम में एंबेड । कोरोनल विमानों से 4 लगातार 5 μm वर्गों में कटौती । एक hematoxylin और eosin (एच & ई) धुंधला किट के साथ दाग वर्गों ।
  9. एक खुर्दबीन का प्रयोग करें दाग वर्गों और रिकॉर्ड मानक सॉफ्टवेयर के साथ प्रकाश छवियों प्रसारित देखने के लिए ।

4. vcs मोती की तैयारी

  1. वैन्कोमाइसिन हाइड्रोक्लोराइड पाउडर का 1 ग्राम मेडिकल ग्रेड कैल्शियम सल्फेट के ९.५ ग्राम में जोड़ें, और फिर मिश्रित शक्ति के लिए सामान्य खारा के 3 मिलीलीटर जोड़ें । 30 से ४५ एस के लिए एक रंग के साथ अच्छी तरह से मिक्स ।
  2. एक लचीला सिलिका जेल मोल्ड में मिश्रित उत्पाद प्लेस (४.८ मिमी व्यास और ४.८ मिमी ऊंचाई के सिलेंडर), और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखी. मोल्ड ठोके से vcs मोती निकालें ।

5. एंटीबायोटिक उपचार और autogenous हड्डी के आरोपण

  1. एनेस्थेटाइज़ मॉडल खरगोशों के साथ pentobarbital सोडियम की खुराक पर 3 मिलीग्राम प्रति १०० जी शरीर के वजन 28वें दिन संक्रमण के बाद. समीपस् थ टिबिया क्षेत्र को एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करते हुए दाढ़ी । पोविटोन-आयोडीन सॉल्यूशन लागू करके त्वचा को कीटाणुरहित करना ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि मॉडलिंग प्रक्रिया 1 h से कम है ।
  2. एक इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग करके पूंछ क्षेत्र को दाढ़ी करें और पोविटोन-आयोडीन समाधान लगाने से पूंछ को कीटाणुरहित किया जाए ।
  3. सर्जिकल कैंची का उपयोग कर पूंछ नीचे कट । कट पूंछ त्वचा का उपयोग कर एक No .11 स्केलपेल और प्रकट पूंछ हड्डी । एक ऊर्ध्वाधर गद्दे सीवन में अवशोषण शल्य सिलाई के साथ पूंछ क्षेत्र में त्वचा सीना ऊपर सीवन चबाने से पशु को रोकने के लिए ।
  4. किसी भी मांसपेशी, कोमल ऊतक और periosteum निकालें । प्रत्येक संयुक्त पर पूंछ की हड्डी को अलग करें और एक १०० मिमी प्लास्टिक डिश को बाँझ खारा युक्त अस्थि टुकड़ा स्थानांतरित करें ।
  5. implant 4 vcs मोती के टुकड़े (४.८ मिमी व्यास और ४.८ मिमी ऊंचाई के सिलेंडर, १.२५ मनका का टुकड़ा प्रति मिलीग्राम vancomycin) मज्जा गुहा में घुमावदार चिमटी का उपयोग (चित्रा 2ई) ।
  6. घुमावदार चिमटी (चित्रा 2ई) का उपयोग कर (2 मिमी व्यास और प्रत्येक टुकड़ा प्रति 4 मिमी ऊंचाई के सिलेंडर) स्वगत हड्डियों के 8 टुकड़ों के साथ हड्डी दोष भरें ।
  7. एक गद्दे सीवन तरीके से अवशोषक सर्जिकल सिलाई के साथ periosteum और त्वचा सीना (चित्रा 2एफ) ।
    नोट: सर्जरी के दौरान तापमान 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
  8. सर्जरी के बाद गर्मी घटाने से बचने के लिए जानवरों को गर्म और साफ स्थिति में रखें । श्वसन दर और दिल की दर पर नजर रखें । जागने के बाद, भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ व्यक्तिगत पिंजरों में खरगोशों को घर करें ।

6. एंटीबायोटिक गतिविधि का आकलन

  1. खरगोशों को एक खरगोश फिक्सर में रखें, और उपचार के बाद 2, 4, 6 और 8 सप्ताह में फिक्सर के बाहर सिर और कान लगाएं ।
  2. ईटीए-K2 एंटीकोगुलेंट रक्त वाहिका के साथ ऑक्युलर नसों से रक्त ड्रा करें । रक्त वाहिकाओं से रक्त के कंटेनर में 1 मिलीलीटर रक्त खींचें । कमरे के तापमान पर ६५१ एक्स जी की गति के साथ 10 मिनट के लिए सीरम को अपकेंद्रिकृत करना ।
  3. रक्त जैव रासायनिक विश्लेषक का उपयोग करके पूरे रक्त में सफेद रक्त कोशिका गिनती (wbc) का निर्धारण, और सी-रिएक्टिव प्रोटीन (सीआरपी) एक elisa विधि द्वारा16.

7. अस्थि उत्थान का आकलन

  1. उपचार के बाद 8 या 12 सप्ताह के अंत में, pentobarbital सोडियम की एक से अधिक खुराकों के साथ इंजेक्शन द्वारा euthanize खरगोशों ।
  2. घुटने और टखने के जोड़ों के किनारों के साथ, टिबिया नमूनों को निकालें । debride मांसपेशियों और फासियल परतों ।
  3. माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) का उपयोग करके टिबिया की संरचना का विश्लेषण करें । एक अंडाकार क्षेत्र ४.८ मिमी व्यास और ९.६ मिमी लंबे समय के रूप में ब्याज (रॉय) के क्षेत्र चुनें । बिटमैप डेटा का उपयोग करके 3d मॉडल छवियों को फिर से संगठित करें ।
  4. अस्थि उत्थान का आकलन करने के लिए the3D मॉडलों से अस्थि आयतन/ऊतक आयतन (बीवी/टी. वी.), ट्राइकोकुलर मोटाई (Tb.Th), ट्राबेकुला नंबर (टीबी. एन.) और ट्राबेकुलर पृथक्करण (टीबी. एसपी) के अनुपात का स्कोर चुनें ।

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Representative Results

अस्थि संक्रमण मॉडल का मूल्यांकन
एस ऑरियसके साथ संक्रमण के बाद, खरगोश के रोग अभिव्यक्तियां क्लिनिक में क्रोनिक ऑस्टियोमाइलाइटिस के प्रतिनिधि लक्षण के समान थे । हमारे अध्ययन में, 30 खरगोश संक्रमित थे, और एक मॉडल समूह के रूप में किए गए, और 10 खरगोश नियंत्रण जानवरों के रूप में किया गया । सभी मॉडल खरगोशों ने टिबिया स्थानीय साइट के साइनस को संक्रमित किया है, जो साइनस से सफेद और पीले रंग के प्रवाह से अधिक है (चित्रा 3ए) । एच & ई धुंधला के परिणाम संकेत मिलता है कि बैक्टीरियल समुच्चय मॉडल समूह में मृत हड्डी के आसपास स्थित हैं, और सामान्य osteocytes पहचाना नहीं जा सकता. नियंत्रण समूह (चित्रा 3बी) की तुलना में मॉडल समूह में सीआरपी और डब्ल्यूबीसी का स्तर अधिक है । नेकटिक अस्थि मज्जा lysates आगर प्लेटों पर streaked हैं, जो संक्रमण के बाद मॉडल समूह के लिए कालोनियों की वृद्धि हुई संख्या में परिणाम (चित्रा 3सी) । मॉडलिंग के अंत में, गंभीर संक्रमण के कारण 3 खरगोश मर गए थे । शेष संक्रमित खरगोशों को अस्थि संक्रमण मॉडल के रूप में पहचाना गया था और 3 समूहों में विभाजित किया गया था: मॉडल समूह, vcs समूह और vcs-AB समूह ।

एंटीबायोटिक गतिविधि और अस्थि उत्थान के आकलन
2, 4, 6, और 8 सप्ताह vcs या vcs-एबी के साथ उपचार के बाद, सीआरपी और wbc के स्तर काफी कम कर रहे हैं (चित्रा 4ए). vcs और अस्थि allograft के आरोपण के 12 सप्ताह के बाद, vcs-एबी समूह के टिबियाल दोष पूरी तरह से coalescent लग रहा था । टिबियल पठार vcs-AB समूह की सतहों कि vcs समूह की तुलना में चापलूसी कर रहे हैं । 2d पुनर्निर्माण छवियां vcs-AB और vcs के साथ उपचार के बाद 12 सप्ताह की अवधि के दौरान हड्डी की मात्रा में एक प्रगतिशील वृद्धि का संकेत है, जबकि हड्डी हानि मॉडल समूह में महत्वपूर्ण है (चित्रा 4बी) । अस्थि पुनर्जनन मात्रात्मक अनुक्रमित विश्लेषण करने के लिए, एक अंडाकार क्षेत्र ४.८ मिमी व्यास और ९.६ मिमी लंबे ब्याज के क्षेत्र के रूप में चुना गया था (रॉय) (चित्रा 4सी), और 3 डी मॉडल छवियों बिटमैप डेटा का उपयोग कर खंगाला गया । माइक्रो-सीटी इंडेक्स bv/टीवी मॉडल समूह में vcs और vcs-अटल बिहारी समूहों में काफी कम थे । टीबी. एन और vcs में Tb.Th स्कोर-अटल बिहारी समूह मॉडल और vcs समूह में उन लोगों की तुलना में काफी अधिक थे । इसके अलावा, टीबी. एसपी स्कोर में vcs-एबी समूह मॉडल समूह और vcs समूह (चित्रा 4डी) की तुलना में स्पष्ट रूप से कम कर रहे हैं ।

इन परिणामों का सुझाव है कि एस ऑरियस के साथ संक्रमण wbc और crp मॉडल समूह में वृद्धि का कारण बनता है, जो vcs का उपयोग कर कम किया जा सकता है । vcs के प्रत्यारोपण इष्टतम एंटीबायोटिक उपचार के रूप में माना जाता है । हालांकि, अस्थि दोष vcs समूह में नमूनीय है । कुलपतियों और स्वगत हड्डी उपचार trabeculae मोटाई और trabeculae संख्या में वृद्धि और घरनदार जुदाई में कमी । vcs-एबी उपचार अस्थि चिकित्सा को बढ़ावा देने की क्षमता से पता चला ।

Figure 1
चित्रा 1 . अस्थि संक्रमण मॉडल की शल्य तैयारी । (क) टिबिया पर छिद्रण स्थिति दिखाता है । टीबिया के ऊपरी छोर पर एस ऑरियस के साथ इंजेक्शन के लिए ड्रिलिंग होल स्थिति के बीच की दूरी १.५ सेमी है । (ख) पेरिस्टीयम का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा में किया गया चीरा । (ग) टिबिया को बेनकाब करने के लिए periosteum के माध्यम से किए गए चीरा से पता चलता है । (घ) टिबिया में एक 2 मिमी व्यास छेद पंच । (ई) 2 मिमी व्यास हड्डी मोम से भरा छेद भरें । (च) स्पेयर बोन मोम की कटौती । (छ) हड्डी के दोष को भरने वाली अस्थि मोम दिखाएँ. (ज) periosteum और त्वचा सीना । (I) एस. ऑरियस सॉल्यूशन के साथ इंफूक्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . अस्थि allograft और एंटीबायोटिक उपचार की तैयारी । (क) periosteum को बेनकाब करने के लिए त्वचा में किए गए चीरा । (ख) पंच दो आसन्न ४.८ मिमी व्यास छेद. (ग) देवदुल्हन परिगलन अस्थि और सूजन अस्थि मज्जा । (घ) दो छिद्रों के बीच अस्थि ऊतक को ४.८ मिमी व्यास और ९.६ मिमी लंबी वृत्त बनाने के लिए परिमार्जन और साफ करें । (ई) vcs और अस्थि allograft के साथ छेद भरें । (च) periosteum और त्वचा सीना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . अस्थि संक्रमण मॉडल का मूल्यांकन । (क) एस ऑरियससे संक्रमित खरगोश के पैरों की उपस्थिति की विशेषताएं, और मॉडल और नियंत्रण समूहों में खरगोश टिबिया के ठेठ हिस्टोथोलॉजी छवियों । नीला तीर: अस्थिकोशिका; गुलाबी तीर: हड्डी trabeculae; पीला तीर: बैक्टीरियल समुच्चय; हरा तीर: मृत हड्डी । (ख) डब्ल्यूबीसी और सीआरपी का परिणाम रैबिट सीरम में मॉडलिंग, 7, 14, 21 और 28 दिनों के संक्रमण के बाद के समय बिंदुओं पर होता है । कॉलम मतलब ± एसई, *पी < ०.०५ बनाम नियंत्रण समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग) टिबिया मज्जा में बैक्टीरिया की कालोनियों की संख्या रात भर ऊष्मायन के बाद गिना । कॉलम माध्य ± एसई का प्रतिनिधित्व करते हैं, *p < 0.05 बनाम कॉलोनी गणना 0 दिन में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4 . एंटीबायोटिक गतिविधि और अस्थि उत्थान का आकलन । (A) vcs और vcs-AB के प्रत्यारोप के बाद 2, 4, 6 और 8 सप्ताह के समय बिंदुओं पर खरगोश सीरम में wbc और crp के परिणाम, अंक माध्य ± SE, #p < ०.०५ और *p < ०.०५ मॉडल समूह की तुलना में प्रतिनिधित्व करते हैं । (ख) टिबिया के कोरोनल अनुभाग छवियों माइक्रो-सीटी द्वारा विश्लेषण किया । (C) ROI का स्थान. (घ) हिस्टोग्राम हड्डी की मात्रा/ऊतक की मात्रा (bv/टीवी), घरनदार मोटाई (Tb.Th), घरनदार संख्या (टीबी. एन), और घरनदार जुदाई (टीबी. Sp) प्रति समूह पांच खरगोशों से रॉय के स्कोर दिखा । कॉलम मतलब ± एसई, *पी < ०.०५ बनाम नियंत्रण समूह या मॉडल समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . सभी प्रक्रियाओं की समयरेखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

पिछले अध्ययनों में, दोनों तीव्र और जीर्ण अस्थि संक्रमण का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडलों के विभिन्न प्रकार का निर्माण किया गया; हालांकि, आदर्श मॉडल के लिए खोज अभी भी17,18बनी हुई है । इसके अलावा, आदर्श अस्थि संक्रमण मॉडल नैदानिक सेटिंग में हड्डी संक्रमण के रोग विशेषताओं अनुकरण करने की उम्मीद है, जबकि मॉडलिंग के समय, कम लागत और बाहर ले जाने के लिए आसान रहते हैं. अब तक, खरगोश अस्थि संक्रमण मॉडल भड़काऊ अस्थि रोग अनुसंधान में सबसे आम मॉडल है, खरगोशों के रूप में उपलब्ध हैं, व्यवहार्य और सस्ती । हमारे पिछले अध्ययन में, हम मृत्यु दर और शरीर के अलग वजन के साथ खरगोशों की संक्रमण दर की तुलना में । परिणाम से पता चला कि शरीर का वजन 3 किलो से अधिक होना चाहिए; अन्यथा, एक उच्च मृत्यु दर या हेमेटोसेप्सिस की एक उच्च घटना और सर्जरी के बाद एक उच्च मृत्यु दर होगी ।

पहले के अध्ययनों के विपरीत, हमारे अध्ययन में खरगोश अस्थि संक्रमण मॉडल और एंटीबायोटिक उपचार मानव रोग और शल्य चिकित्सा की रोगजनक विशेषताओं के अनुरूप हैं । पिछले अध्ययन में, पशुओं के साथ सोडियम morrhuate इंजेक्शन और एस ऑरियस ६० दिनों से अधिक पैथोलॉजिकल स्थिति नहीं थी । इसके अलावा, मृत्यु दर 20%12,19से अधिक थी । अस्थि दोषों से ओवरफ्लो एस ऑरियस समाधान के लिए एक कम संक्रमण दर प्रेरित साबित किया गया था । हम हड्डी मोम का इस्तेमाल किया 2 मिमी छेद को भरने के लिए टिबिया पर, आदेश में एस ऑरियस अस्थि मज्जा को ब्लॉक करने के लिए और सुनिश्चित करें कि छेद के साथ या रक्त अतिप्रवाह के बिना छेद की जाँच करके हड्डी मोम से भरे थे. एक खरगोश टिबिया की मोटाई 2 मिमी था के रूप में, हम 2 मिमी व्यास और 2 मिमी की ऊंचाई की हड्डी मोम के एक सिलेंडर दबाया दो मिमी व्यास छेद है, जो सुनिश्चित हड्डी छेद भरा मोम और अस्थि मज्जा में घुसपैठ नहीं कर सका. इसके अलावा, के रूप में हड्डी मोम लचीला और स्थिर था, यह छेद भर दिया और पिघल या अस्थि मज्जा के साथ प्रतिक्रिया नहीं कर सकता. हमारे अध्ययन में, संक्रमण के बाद 28वें दिन, हड्डी मोम अभी भी पूरा हो गया था और पूरी तरह से छेद भर दिया । खरगोशों के वजन के रूप में 3 किलो से अधिक और ३.२ किलो से कम थे, बैक्टीरिया निलंबन की मात्रा ९६० μl को ९०० μl था । इंजेक्शन की धीमी गति और हड्डी मोम की अवरुद्ध समारोह की वजह से, बैक्टीरिया निलंबन की इस मात्रा उच्च दबाव के बिना अस्थि मज्जा में इंजेक्ट किया जा सकता है । परिणामों से पता चला कि यह प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा में संक्रमित एस. ऑरियस की मात्रा सुनिश्चित करता है । एक 2 मिमी व्यास छेद टिबिया में छिद्रित करने के लिए सुनिश्चित करें कि टिबिया के ऊपरी छोर से दूरी १.५ सेमी है, जो टिबियल पठार पर छेद रेखांकित है, के लिए पर्याप्त स्थान सुनिश्चित करने के लिए debride और प्रत्यारोपण vcs मोती और निंनलिखित उपचार में स्वगत हड्डी । मॉडलिंग की प्रक्रिया के दौरान, गंभीर संक्रमण के कारण 3 खरगोशों की मृत्यु हो गई । अस्थि संक्रमण खरगोशों के रूप में पहचाने गए खरगोश, और शेष खरगोशों में संक्रमण की दर १००% थी । अंय अस्थि संक्रमण प्रोटोकॉल के साथ तुलना में, जैसे एस ऑरियस या विदेशी मामले के आरोपण के साथ लथपथ स्पंज की आरोपण, हमारे प्रोटोकॉल बारीकी से नैदानिक सेटिंग में अस्थि संक्रमण अनुकरण, और प्रक्रियाओं पर थोड़ा प्रभाव है, ऐसे परिगलन हड्डी और एंटीबायोटिक उपचार के रूप में debriding ।

अस्थि संक्रमण का निदान सर्जनों के लिए एक चुनौती है । प्रयोगशाला परीक्षण के परिणाम, सीरम सूजन मार्कर का पता लगाने सहित, माइक्रोबायोलॉजी विश्लेषण और हिस्टोथोलॉजी विश्लेषण नैदानिक सेटिंग्स में अस्थि संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया20. इसके अलावा, नैदानिक इमेजिंग, जैसे अल्ट्रासाउंड, रेडियोलॉजी, कंप्यूटेड टोमोग्राफी, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग या रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी अस्थि संक्रमण21का पता लगाने के लिए लागू किए गए थे । दुर्भाग्य से, इमेजिंग तरीकों के माध्यम से अस्थिमज्जा का रोग निदान अक्सर देरी है क्योंकि अस्थि परिगलन के संक्रमण के 3 सप्ताह तक सादे रेडियोग्राफी द्वारा पता लगाने के लिए मुश्किल है । हमारे अध्ययन में, हम अस्थि संक्रमण मॉडल का मूल्यांकन करने के लिए सीरम सूजन मार्कर का पता लगाने और हिस्टोथोलॉजी विश्लेषण का इस्तेमाल किया, के रूप में इन तरीकों प्रभावी थे, निष्पादन योग्य और अनुक्रमित संवेदनशील थे. निंनलिखित शल्य प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण कदम थे हमारे अध्ययन में एक अस्थि संक्रमण मॉडल बनाने के लिए । शल्य चिकित्सा और उपचार करने के लिए उचित शरीर के वजन के साथ खरगोशों का चयन करें । स्थापना और शल्य प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ वातावरण बनाए रखें, और शल्य प्रक्रिया प्रोटोकॉल के बाद गर्म शर्तों को सुनिश्चित करें । टिबिया में एक 2 मिमी व्यास छेद पंच, और सुनिश्चित करें कि टिबिया के ऊपरी छोर से दूरी १.५ सेमी है । हड्डी मोम के साथ छेद भरें, और periosteum और त्वचा सीना को बैक्टीरिया समाधान ब्लॉक करने के लिए । एंटीबायोटिक उपचार के सबसे महत्वपूर्ण कदम निम्नलिखित हैं । सीरम में पूरे रक्त और सीआरपी में wbc का पता लगाने के द्वारा खरगोशों के पैथोलॉजिकल अस्थि संक्रमण को सुनिश्चित करें । debride परिगलन हड्डी पूरी तरह से, पंच दो आसन्न ४.८ मिमी व्यास छेद और परिमार्जन और 2 छेद के बीच अस्थि ऊतक साफ. अस्थि मज्जा और अस्थि दोष में vcs मोती के 4 टुकड़े और स्वगत हड्डी के 8 टुकड़े प्रत्यारोपण ।

एंटीबायोटिक उपचार के बाद, हमने देखा कि वीसीएस-एबी समूह में खरगोशों में vcs समूह की तुलना में उच्च ऑस्टियोजेनिक क्षमता थी । यह हो सकता है क्योंकि स्वगत हड्डी सक्रिय osteocytes और अस्थि गठन वृद्धि कारक है, जो भ्रष्टाचार की सतह भर में अस्थि मैट्रिक्स का उत्पादन होता है, जबकि vcs के क्षरण दोष क्षेत्र में दुर्लभ अस्थि मैट्रिक्स लाती । हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि स्वगत हड्डी बेहतर osteogenic क्षमता है. हालांकि स्वगत अस्थि संचयन मात्रा में सीमित है और दाता साइट के लिए रुग्णता पर जोर देता है, स्वगत हड्डी का महत्व नगण्य22,23,24नहीं है । हमारे अध्ययन में, स्वगत हड्डी पूंछ हड्डी, जो प्रणालीगत चोट से बचा जाता है से प्राप्त किया गया था, और श्रोणि हड्डी से स्वगत हड्डी पाने की तुलना में मृत्यु दर कम हो जाती है । पूंछ की हड्डी से autograft हड्डी अस्थि संक्रमण के पशु अध्ययन में पसंदीदा कलम बांधने की सामग्री हो सकता है ।

अंत में, इस अध्ययन में अस्थि संक्रमण का एक बेहतर खरगोश मॉडल स्थापित किया गया था । सूजन इंडेक्स और ब्लड बायोकेमिकल इंडेक्स का इस्तेमाल बोन इंफेक्शन मॉडल का अनुमान लगाने के लिए किया गया । इसके अलावा, एंटीबायोटिक उपचार के बाद, एंटीबायोटिक गतिविधि और हड्डियों के उत्थान की क्षमता का पता लगाने के लिए बहु-स्तरीय विश्लेषण किया गया । मॉडलिंग, उपचार प्रोटोकॉल और मूल्यांकन के तरीके व्यवहार्य और विश्वसनीय हैं । इसके अलावा अध्ययन बहु-साधन दृश्य उपकरणों का लाभ लेने के लिए अस्थि संक्रमण की पैथोलॉजिकल प्रक्रिया की निगरानी और हड्डी की मरंमत की प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा ।

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Disclosures

लेखक इस काम में हितों का कोई टकराव की रिपोर्ट ।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१८०३८०८, ८१८७३०६२), झेजियांग प्रांतीय चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी कोष (2017ky271) और zhejiang प्रांत (2017c37181) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable surgical suture Jinghuan 18S0604A
asepsis injector Jinglong 20170501
bone wax ETHICON JH5CQLM
CCD camera Olympus DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel XINGE 20170802
Electric bone drill unit Bao Kang BKZ-1
Electric shaver Codos 3800
flexible silica gel mold  WRIGHT 1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit Beyotime 20170523
Luria-Bertani culture medium Baisi Biothchnology 20170306
Medical-grade calcium sulphate WRIGHT 1527745
microcomputed tomography (micro-CT) Bruker SkyScan 1172 
Microscope Olympus CX41
New Zealand white rabbits Zhejiang Experimental Animal Center  SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel  Yuanlikang 20170604
normal saline Mingsheng 20170903
PBS TBD(Jingyi) 20170703-0592
pentobarbital sodium Merk 2070124
povidone-iodinesolution Lierkang 20170114
S. aureus freeze drying powder China General Microbiological Culture Collection Center ATCC 6538
sheep blood agar HuanKai Microbial 3103210
tryptic soy agar plates HuanKai Microbial 3105697
tryptic soy broth tubes HuanKai Microbial 3104260
Vancomycin Lilly C599180

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References

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चिकित्सा अंक १४५ अस्थि संक्रमण खरगोश मॉडल staphylococcus ऑरियस टिबिया vancomycin लोड कैल्शियम सल्फेट स्वगत हड्डी
अस्थि संक्रमण के एक बेहतर खरगोश मॉडल में vancomycin लोड कैल्शियम सल्फेट और autogenous हड्डी के साथ उपचार
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Zhang, Y., Shen, L., Wang, P., Xi, W., Yu, Z., Huang, X., Wang, X., Shou, D. Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection. J. Vis. Exp. (145), e57294, doi:10.3791/57294 (2019).

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