Summary
في هذه المقالة، نبدي تصوير مباشر من الديدان الفردية التي تستخدم جهاز مخصص موائع جزيئية. منفردة تقتصر الديدان متعددة في الجهاز، لفصل الدوائر، مما يتيح مراقبة طولية متعدد العمليات البيولوجية المختلفة.
Abstract
في العقد الماضي، تم تطبيقها على دراسة الحيوانات الصغيرة، بما في ذلك ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس، تقنيات موائع جزيئية وقد أثبتت جدواها كمنصة تصوير الحي مريحة لتوفير قدرات لمراقبة دقيقة من الظروف التجريبية في الوقت الحقيقي. في هذه المقالة، نبدي تصوير يعيش الفردية الديدان توظيف وورمسبا، جهاز موائع جزيئية مخصصة التي نشرت سابقا. منفردة تقتصر الديدان متعددة في الجهاز، لفصل الدوائر، مما يتيح مراقبة طولية متعدد العمليات البيولوجية المختلفة. لتوضيح القدرة، نحن أجرى تجارب إثبات لمبدأ التي كانت مصابة الديدان في الجهاز مع البكتيريا المسببة للأمراض، والقوى المحركة للتعبير عن الجينات الاستجابة المناعية ووضع البيض تم رصدها بصورة مستمرة في الفرد الحيوانات. تصميم بسيط وتشغيل هذا الجهاز جعلها مناسبة للمستخدمين الذين لديهم أي خبرة سابقة مع التجارب المستندة إلى موائع جزيئية. ونحن نقترح أن هذا النهج سوف تكون مفيدة للعديد من الباحثين المهتمين بالملاحظات طولية للعمليات البيولوجية في ظروف محددة تحديداً جيدا.
Introduction
قد تؤدي التغيرات في الظروف البيئية لتفعيل البرامج الوراثية مصحوبة بتحريض والقمع للتعبير عن جينات محددة1،2. قد تكون هذه التغيرات الحركية متغير بين الأنسجة في الحيوانات نفسها، وبين الحيوانات المختلفة. ولذلك تدعو الدراسات لمثل هذه البرامج الوراثية الأساليب التي تسمح للتصوير الطولي للحيوانات الفردية وتوفير عنصر التحكم الديناميكية الدقيق للظروف البيئية.
في السنوات الأخيرة، استخدمت أجهزة فلويديك ميكروفابريكاتيد لدراسة جوانب كثيرة من الاستجابة والسلوك في الحيوانات الصغيرة، بما في ذلك الديدان والذباب ويتحمل الماء وأكثر3،4،،من56، 7. وتشمل التطبيقات، على سبيل المثال، عميق فينوتيبينج، أوبتوجينيتيك لتسجيل نشاط الخلايا العصبية في الاستجابة للمحفزات الكيميائية، وتتبع للسلوكيات الحركية مثل الحركة وضخ8،،من910 , 11.
النهج القائم على موائع جزيئية عقد العديد من الخصائص التي يمكن أن تستفيد من تصوير طولية طويلة الأجل للاستجابة لمنبهات البيئية، بما في ذلك مراقبة الديناميكية دقيقة من المكروية المحلية، تصميم مرن يسمح للحفاظ على كل من الحيوانات في أماكن منفصلة، وسمات مواتية للتصوير. ومع ذلك، الحفاظ على الحيوانات في دائرة موائع جزيئية لفترة طويلة مع الحد الأدنى من أثر ضار على تلك الكائنات جيدا هو تحديا، الأمر الذي يتطلب عناية خاصة في تصميم الجهاز موائع جزيئية وكذلك في تنفيذ التجربة.
هنا نظهر استخدام وورمسبا، جهاز موائع جزيئية للتصوير الطولي من ايليجانس كاينورهابديتيس. 5 الديدان فردية محصورة في الدوائر. ويضمن تدفق منخفض مستمر لتعليق السائل والبكتيرية أن الديدان تغذية جيدة ونشطة بما فيه الكفاية الحفاظ على الصحة الجيدة، والتخفيف من الإجهاد، ويسمح هيكل الدوائر الديدان لوضع البيض. ينبغي أن تسمح بساطة تصميم وتشغيل وورمسبا الباحثين مع عدم وجود خبرة سابقة في ميكروفلويديكس إدماج هذا الجهاز في خططها الخاصة بالبحوث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يستخدم البروتوكول أدناه وورمسبا5, جهاز موائع جزيئية الموصوفة سابقا للتصوير الطولي للديدان. تصنيع وورمسبا (بدءاً من ملفات CAD التي يمكن الحصول عليها من المؤلفين عند الطلب) مباشرة ولكن يتطلب بعض الخبرة. وفي معظم الحالات، يمكن سهولة تصنيع بمنشأة أساسية أو بواسطة شركة تجارية توفر مثل هذه الخدمات. عند افتعال الجهاز، تأكد من تحديد ارتفاع الملامح 50 ميكرومتر.
1-الإعداد التجريبية
- تركيب جهاز موائع جزيئية على مجهر مقلوب الأسفار مع مرحلة إليه.
- ضع شاكر مداري القرب من المجهر، ولكن تأكد من الاهتزاز من شاكر لا يؤثر مباشرة على المجهر. على سبيل المثال، وضع شاكر على رف ثابت على جدار الذي يجعل أي اتصال مع الجدول البصرية.
- وضع مضخة الحقن على شاكر المداري. الشريط للمضخة لشاكر ذلك لأنه ليس تهزهز حين تهتز.
2-إعداد البيئة موائع جزيئية
ملاحظة: أثناء التجربة، المحاقن أربعة موصولة بالجهاز موائع جزيئية عبر أنابيب حقنه، كما هو مبين في الشكل 1. ويصف هذه الخطوة إعداد هذه المحاقن. ما لم يذكر خلاف ذلك، تبقى أنابيب الحقن قصيرة قدر الإمكان دون جعلها مشدود.
- إعداد حقنه مأخذ وأنبوب المحاقن. هذه المحاقن (S1 في الشكل 1) سيتم في وقت لاحق متصل بالمنفذ للجهاز من خلال أنبوب المحاقن، وتستخدم للتخزين المؤقت للسوائل التي تخرج من الجهاز.
- جعل إبرة محول بإزالة الأجزاء البلاستيكية من تلميح محقنة 20 x 1/2 بوصة، الاحتفاظ فقط الإبرة (الجزء المعدني). القيام بذلك بعقد أجزاء بلاستيكية ومعدنية بكماشة وسحبهم بعيداً. يمكن حرق مخلفات البلاستيك المتبقية على الإبرة مع موقد بنسن.
- ثني الإبرة وفقا لهندسة الإعداد التجريبية أثناء الضغط على طرفي بكماشة. في التصميم الموضحة هنا، الانحناء الإبرة في منتصفه بزاوية ° ~ 110 الأكثر ملاءمة.
- قم بتوصيل محول الإبرة نصف الطريق الأنبوب. النصف الآخر سوف بعد توصيل الجهاز. ينبغي أن يكون الأنبوب حقنه متوافقة مع تلميح ز 20 حقنه دون حدوث تسرب (على سبيل المثال، أنابيب مع القطر الداخلي ل 0.86 مم والقطر الخارجي من 1.32 مم). طول أنبوب الموصى به ~ 50 سم.
- قم بتوصيل حقنه 10 مل اللوير لوك نهاية الأنبوب حقنه عبر تلميحه محقنة 20 x 1/2 بوصة (فتح) الأخرى.
- إعداد مدخل المخزن المؤقت للحقن والمحاقن أنابيب. واحدة من هذه المحاقن (S2 في الشكل رقم 1) وتستخدم كخزان للسائل أن يذهب إلى الجهاز، والتحكم في تدفق حقن. المحاقن الأخرى (S3 في الشكل 1) مطلوب ل exchange المخزن المؤقت، كما هو موضح في "الخطوة 3-2".
- توصيل حقنه 10 مل اللوير لوك (S2) مباشرة إلى صمام ثلاثي وتوصيل حقنه أخرى (S3) للصمام نفسه عبر أنبوب المحاقن (الشكل 1): الاتصال S3 بالانبوب عبر تلميحه المحاقن، وتتصل الأنبوب الصمام عن طريق بلاغ المحاقن آخر.
ملاحظة: لا يهم الترتيب الذي ترتبط هذه المواد. - قم بتوصيل أنبوب حقنه الميناء المتبقية من صمام ثلاثي. إعداد إبرة محول آخر كما هو الحال في الخطوة 2.1.2، وتوصيل الطرف الآخر (فتح) من الأنبوب حقنه الإبرة في منتصف الطريق.
- تعيين الصمام الأنبوب حقنه في خطوة 2.2.2 و S2 متصلة أثناء إغلاق S3 (الشكل 1).
- توصيل حقنه 10 مل اللوير لوك (S2) مباشرة إلى صمام ثلاثي وتوصيل حقنه أخرى (S3) للصمام نفسه عبر أنبوب المحاقن (الشكل 1): الاتصال S3 بالانبوب عبر تلميحه المحاقن، وتتصل الأنبوب الصمام عن طريق بلاغ المحاقن آخر.
- إعداد حقنه دودة-مدخل وأنبوب المحاقن. هذه المحاقن (S4 في الشكل 1) يستخدم لتحميل الديدان في الجهاز.
- قم بتوصيل أنبوب طويل حقنه حقنه 10 مل اللوير لوك (S4). تحديد طول هذا الأنبوب من حجم السوائل التي سيتم استخدامها لتحميل؛ على سبيل المثال، 100 سم أنابيب يدعم أكثر من 2 مل سائل (انظر أيضا الخطوة 4، 2).
- إعداد إبرة محول آخر كما هو الحال في الخطوة 2.1.2، وقم بتوصيل أحد نصف الإبرة إلى نهاية الأنبوب المحاقن (فتح) الأخرى.
- شطف جميع الحقن والأنابيب مع S-المتوسطة12 مرتين. ملء الحقن والأنابيب مع S-المتوسطة، مع الحرص على إزالة جميع فقاعات الهواء.
- ربط أنبوب حقنه منفذ إلى منفذ الجهاز.
- قم بتوصيل الإبرة محول في نهاية الأنبوب حقنه بمنفذ مخرج.
- حقن كمية صغيرة من S والمتوسطة من خلال منفذ لملء الجهاز، حتى يخرج S المتوسطة قليلاً من مدخل المخزن ومدخل دودة.
- ربط أنبوب حقنه المخزن المؤقت-مدخل إلى منفذ مدخل المخزن المؤقت من الجهاز، بينما يسد الدودة-المدخل مع رقم التعريف الشخصي (pin وتد الفولاذ المقاوم للصدأ مع قطر 1/32-بوصة).
- حقن تدفقا مستمرا من المخزن المؤقت إلى الجهاز. تحميل المخزن المؤقت-مدخل المحاقن S2 على مضخة الحقن13، وتعيين المضخة حيث يتم حقن المتوسطة في S2 باستمرار في الجهاز بمعدل تدفق 3 ميليلتر في الدقيقة.
3-تحميل البكتيريا إلى الجهاز موائع جزيئية
- إعداد OP50 الإشريكيّة القولونية قد علقت في S-المتوسطة12.
- وبعد بروتوكول قياسي، تطعيم قارورة 250 مل مع 50 مل من رطل ومستعمرة واحدة، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- الطرد المركزي في الثقافة بين عشية وضحاها 4000 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقائق وريسوسبيند بيليه في 30 مل من S-المتوسطة.
- تصفية التعليق من خلال عامل تصفية حقنه 5 ميكرومتر. قياس تركيز البكتيريا بكثافته الضوئية في 600 نانومتر (OD600)، وضبط التركيز ل التطوير التنظيمي600 3. مطلوب هذه الكثافة العالية للحفاظ على تغذية جيدة الديدان.
- تبادل المخزن المؤقت في الجهاز مع تعليق OP50.
- إعداد حقنه نظيفة (S5) مليئة بتعليق OP50. عقد المحاقن عمودياً، والاستفادة من ذلك عدة مرات لجمع جميع فقاعات الهواء في الجزء العلوي.
- تشغيل صمام 3-طريقة الحقن مدخل المخزن المؤقت لإغلاق الاتصال إلى الجهاز، والاتصال الحقن اثنين، S2 و S3. فض الاشتباك S2 من مضخة الحقن.
- قطع S2 الصمام وتوصيل S5 الصمام. طرد جميع الهواء جمعت في الجزء العلوي من S5 إلى S3 عبر الصمام حتى قليلاً من المخزن المؤقت OP50 يذهب إلى S3. في القيام بذلك، تأكد من أن يظل لا فقاعة هواء في S5 أو الصمام.
- تشغيل صمام ثلاثي مرة أخرى إلى الموقع الأصلي إغلاق الاتصال بين S3 و S5 و S5 الاتصال بالجهاز. تحميل S5 على مضخة الحقن. قم بتشغيل شاكر المداري الذي يحتفظ بالمضخة. تعيين سرعة الهز إلى حوالي 200 لفة في الدقيقة.
- تعيين معدل التدفق لتكون 100 ميليلتر/دقيقة. يعتمد الوقت المستغرق للمخزن المؤقت الجديد ليصل إلى الديدان في الجهاز على طول أنبوب حقنه مدخل المخزن المؤقت (حوالي 5 دقائق مع الأنابيب المذكورة أعلاه). ويمكن استخدام معدل تدفق أعلى إذا كان مطلوب تبادل المخزن مؤقت بشكل أسرع.
- بمجرد المخزن المؤقت OP50 الذي ينتشر في جميع أنحاء الجهاز، تعيين معدل التدفق إلى 3 ميليلتر/دقيقة.
4-تحميل الديدان في الجهاز موائع جزيئية
- إعداد أنبوب ميكروسينتريفوجي ملزمة منخفضة صغيرة (650 ميليلتر) وملء مع 100 ميليلتر من تعليق OP50. نقل حوالي 20-30 مزامنة سن الشباب البالغين الديدان (46 ساعة بعد اعتقال اليرقات L1 عند 25 درجة مئوية) من صفيحة أجار NGM (متوسط نمو السلكية) إلى الأنبوبة بانتقاء منهم واحداً تلو الآخر مع دودة بيك. يمكن أن يتم سن-المزامنة بعد بروتوكول قياسي12.
- ملء الدودة-المدخل أنبوب الحقن والمحاقن (S4 في الشكل 1) مع تعليق OP50. حقن ~ 500 ميليلتر من السائل في الأنبوب ميكروسينتريفوجي مع الديدان. رسم التعليق مع الديدان في أنبوب حقنه دودة-مدخل. تأكد من أن الأنبوب المحاقن طويلة بما يكفي (> 1 متر) والبقاء في أنبوب حقنه الديدان مرسومة ولا تجعل كل وسيلة للمحاقن S4.
- قم بتوصيل S4 الدودة-المدخل. حقن جميع الديدان في أنبوب حقنه دودة-مدخل في الجهاز موائع جزيئية. قطع S4 وأنبوب المحاقن. قم بتوصيل الدودة-مدخل بدبوس.
- فك الارتباط مع المحاقن مدخل المخزن المؤقت S2 من مضخة ميكانيكية ( الشكل 1) والتحكم يدوياً في S1 و S2 بدفع جميع الديدان إلى قنوات منفصلة. سيتم نقل الضغط S2 الديدان في القنوات، بينما الضغط S1 سيتم نقلها في اتجاه عكسي. الدودة في كل قناة حالما يتم تحميل قناة، سيتم منع دخول الديدان الأخرى.
- واسمحوا الديدان التكيف مع البيئة الجديدة لمدة 2-3 ساعات.
5-إعداد بروتوكولا التصوير
- العثور على جميع الديدان الموجودة في الجهاز بشكل أمن، وتعيين موقع تصوير لكل واحد منهم في صورة اقتناء البرمجيات الذي يتحكم بالمجهر الخاص. لاحظ أنه في بعض الحالات (مثلاً عند أعلى التكبير هو المطلوب، أو عند استخدام كاميرات مع أصغر أجهزة استشعار CCD) مواقع التصوير متعددة مطلوبة لكل قناة.
ملاحظة: بينما يمكن أن يتم ذلك يدوياً، يمكن تحميل بعض حزم البرمجيات اقتناء ملف نصي يسرد المواقف التي ينبغي أن تؤخذ فيها الصور. حيث يتم ترتيب هذه المواقف بصورة منتظمة في وورمسبا، مستخدم يمكن كتابة برنامج نصي صغيرة (مثلاً في بايثون أو البرمجيات التجارية) التي يقوم تلقائياً بإنشاء قائمة من هذا القبيل. بالتنسيق الدقيق للبرنامج النصي هذا سيتوقف على تنسيق الملف المتوقع باقتناء البرمجيات (انظر مثال في 1 المواد التكميلية). - ضبط تردد مطلوب من الوقت الفاصل بين التصوير. على سبيل المثال، يتم تصوير لاستجابة الجينات المناعية للعدوى بتردد لمدة 10 دقائق لكل إطار. تأكد من أن يتم الحصول على كافة القنوات الضرورية (مثل مشرق الميدان والأسفار بروتينات فلورية خضراء) عند كل نقطة في الوقت.
6-المضيف استجابة للعدوى Pseudomonas
ملاحظة: هذه الخطوة محددة لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض. بدلاً من ذلك، يمكن إعداد واحد المخزن مؤقت الذي يحتوي على أخرى منبهات البيئية ذات الاهتمام (عوامل الإجهاد الحيوية وغير الحيوية، والمخدرات، مما يشير إلى جزيئات، إلخ).
- إعداد PA14 الزائفة الزّنجاريّة علقت في المتوسط كورونا14.
- تطعيم قارورة 250 مل مع 50 مل من رطل ومستعمرة واحدة، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- تطعيم آخر قارورة 250 مل مع 50 مل رطل وقاسمه الثقافة، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- الطرد المركزي في الثقافة بين عشية وضحاها 4000 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقائق وريسوسبيند بيليه في 10 مل من كورونا-المتوسطة. قياس تركيز البكتيرية وضبط تركيز OD600 = 4.
- نقل التعليق إلى قارورة نظيفة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة وعند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أخرى حين تهتز. يحاكي هذه الخطوة خطوة لوحة الحضانة في المعيار مما أسفر عن مصرع14من المقايسة.
- تصفية التعليق من خلال عامل تصفية حقنه 5 ميكرومتر. وهذا لمنع المجاميع البكتيرية من انسداد الجهاز.
- يستعاض عن تعليق OP50 في الجهاز بتعليق PA14، اتباع نفس الإجراء كما هو الحال في "الخطوة 3، 2". الاحتفاظ بالتصوير لمدة 10 ساعات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مزامنة سن الشباب البالغين الديدان (بوست 46 ساعة اعتقال L1 اليرقات عند 25 درجة مئوية)12 تم تحميلها في الجهاز، كما هو موضح في البروتوكول. وتقع الديدان منفردة في قنوات منفصلة، مما يتيح قياس طولية من استجابة الحيوانات لمسببات المرض. عند نجاح التجربة، تظل معظم الديدان في قنواتهم طوال فترة التجربة. وفي هذه الحالة، يتم أخذ صور ديدان الفردية ببساطة عن طريق وضع هذه القناة في مسار التصوير، تجنب الحاجة إلى تحديد نشاط الحيوان. الشكل 2 يظهر صور مشرقة ميدان دودة ممثل واحد على مدى 10 ساعات في الجهاز. بينما تقتصر الديدان داخل قنواتها، يمكن أن تتحرك حتى-والمتلقين للمعلومات، ويمكن أن تتحول بحرية رؤوسهم. هذا أمر بالغ الأهمية لضمان أن الجهاز نفسه لا تسبب الإجهاد أو إيذاء الحيوانات.
نحن رصد الاستجابة للديدان للعدوى البكتيرية من P. الزّنجاريّة، واحدة من مسببات الأمراض البكتيرية درس أفضل من C. ايليجانس. كما أنها مسببات الأمراض بشرية انتهازية الذي يتسبب في الإصابة بالتليف الكيسي ومرضى المناعة. تغذية الديدان مع سلالات معينة من P. الزّنجاريّة، مثل عزل السريرية PA14، يؤدي إلى الإصابة المعوية المميتة، وعوامل الفوعة تشارك في هذه العملية أيضا متورطين في عدوى المضيفين الثدييات. 14 , 15
دراسة نمط التغيرات في التعبير الجيني أثناء العدوى البكتيرية، ويمكن توظيف الصحفيين الفلورسنت. بين العديد من الجينات التي تعرض دينامية واستجابة للعدوى، نحن رصد استجابة النسخي سيبحث-1 (العدوى استجابة الجينات 1)، بالتصوير fluorescence بروتينات فلورية خضراء من الديدان المعدلة وراثيا معربا عن 1::GFP أسندت (AU0133 [agIs17 ( بيرج-1::GFP؛ pmyo-2::mCherry)]، والتي تم الحصول عليها من مختبر Ausubel). 1-أسندت المعروف لتكون بشدة الناجمة في الأمعاء للحيوانات المصابة في المرحلة المبكرة من العدوى PA14 P. الزّنجاريّة . 16 , 17 الشكل 2 ب يبين الوقت الفاصل الصور من دودة الممثل (الحيوان نفسه كما هو الحال في الشكل 2أ). واتخذ كل صورة الأسفار فورا بعد صورة مشرقة الحقل المطابق. في العدوى بعد 5 ساعات الأولى، يزيد fluorescence بروتينات فلورية خضراء فقط أقل ما يقال في منتصف الجسم والذيل. ثم، يلاحظ حدوث زيادة كبيرة في الأسفار، بدءاً من منتصف الجسم. صف الإجمالي في كل دودة المرسومة في الشكل 2ج كدالة للوقت بعد الإصابة. وتوضح هذه البيانات استحثاث سيبحث-1 عند الإصابة PA14 الموصوفة سابقا، ليس فقط، بل أيضا تباين دودة إلى دودة في توقيت ومدى التعريفي.
ويشمل تصميم الجهاز موائع جزيئية وورمسبا عوامل التصفية الذي جمع البيض وضعت بكل دودة الفردية5. عندما يفقس البيض، اليرقات L1 غسلها عن طريق التصفية وفي أنبوب منفذ. وهذا سمح لنا برصد حركية وضع البيض من الديدان الفردية يدوياً أثناء العدوى البكتيرية. صور انقضاء الوقت البيض زرعتها الدودة نفسها كما في الشكل 2 مبينة في الشكل 3ألف. وقد اتخذت هذه الصور الحق بعد الصور مشرق الحقل المطابق في الشكل 2أ. يظهر العدد التراكمي للبيض زرعتها كل دودة كدالة للوقت بعد الإصابة في الشكل 3ب، وترد في الشكل 3جالمتوسط والانحراف المعياري على جميع السكان. التقاط هذه البيانات تقلب الحيوان للحيوان، فضلا عن انخفاض الموصوفة سابقا في وضع البيض كما تقدم الإصابة. وفي المقابل، في الحيوانات مصابة لم ينخفض معدل وضع البيض حتى أنها قمم في ساعات ~ 54 وظيفة L1 في 25 درجة مئوية5،18.
الشكل 1: المخطط التجريبي لتصوير مباشر من الديدان في جهاز موائع جزيئية. الديدان يتم تحميلها إلى الجهاز عن طريق مدخل دودة، ويتم دفع بعد ذلك إلى قنوات منفصلة. يتم حقن تعليق البكتيرية في الجهاز من مدخل المخزن المؤقت بمضخة ميكانيكية محمولة على شاكر مداري. المخزن المؤقت الذي يخرج عن طريق المنفذ منفذ الجهاز. وتستخدم أربعة محاقن (S1 و S2/S5، S3 و S4) لتشغيل الجهاز. خطوط متقطع أحمر حقنه أنابيب تربط المحاقن والجهاز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: حركية التعبير الجيني الممثل. الوقت الفاصل صور دودة الممثل اتخذتها مجهرية fluorescence بروتينات فلورية خضراء برايت-الحقل (أ) و (ب) . الصور الموجودة في أقصى اليسار اتخذت قبل عرضه الممرض، بينما تم نقل الصور الموجودة في أقصى اليمين 10 ساعات آخر عدوى PA14. الفاصل الزمني بين الصور 1 ساعة. (ج) مسار الوقت الإجمالي سيبحث-1:: fluorescence التجارة والنقل في الديدان الفردية. كل صف يناظر حيوان واحدة. تم فرز الصفوف بترتيب تنازلي للأسفار يعني. كثافة fluorescence مرمزة ويظهر مقياس اللون على اليمين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: حركية تمثيلية وضع البيض. (أ) الوقت الفاصل صور عدد من البيض زرعتها الدودة نفسها هو مبين في الشكل 2A و B. الصور الموجودة في أقصى اليسار اتخذت قبل عرضه الممرض، بينما تم نقل الصور الموجودة في أقصى اليمين 10 ساعات آخر عدوى PA14. الفاصل الزمني بين الصور 1 ساعة. (ب) دورة الوقت للعدد التراكمي للبيض في الديدان الفردية. كل صف يناظر حيوان واحدة. تم فرز الصفوف في ترتيب تنازلي من إجمالي عدد البيض تضعه كل دودة. عدد البيض مرمزة ويظهر مقياس اللون على اليمين. (ج) متوسط عدد البيض وضعت كل دودة كدالة للزمن. ويشير إلى المساحة الرمادية ± انحراف معياري واحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية مادة 1: عينة البرنامج نصي يقوم بإنشاء ملف نصي يحتوي على مواقع التصوير لجميع القنوات في الجهاز وورمسبا- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر أدوات موائع جزيئية فوائد متعددة في دراسة الديدان. التصوير في PDMS الجهاز يوفر أعلى جودة التصوير مقارنة بصفيحة أجار NGM قياسية. يمكن أن تؤخذ صور متعددة من دودة واحدة، على النقيض من الأساليب التقليدية التي التقطت من اللوحة الحيوانات والتي شنت على شريحة مجهر للتصوير. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الاحتفاظ المكروية التي يقيم فيها الديدان ثابتة أو التضمين كما هو مطلوب، تسمح بدقة الخرائط بين تكوين البيئة والاستجابة للحيوانات.
هنا دللنا على كيفية إجراء قياس طولي لاستجابة المضيف للعدوى البكتيرية بالتصوير رد الديدان فردية متعددة لمسببات الأمراض الانتهازية PA14 P. الزّنجاريّة باستخدام جهاز مخصص موائع جزيئية (وورمسبا). تم أخذ صور مشرقة الميدانية والأسفار في عدة مرات دون مقاومة التجربة الجارية. على وجه الخصوص، الحركية من وضع البيض والتعبير الجيني سيبحث-1 تم سبر كل 10 دقائق، زيادة كبيرة في الأزمنة عبر الطرق التقليدية14،15.
في هذا الجهاز، يمكن إجراء قياسات طولية من الديدان متعددة بإعادة زيارة الموقع المحفوظة لكل دودة في أي وقت من الأوقات. وقد ظهر ذلك في الأرقام 2ج و 3B، حيث يمكننا قياس سيبحث-1:: fluorescence بروتينات فلورية خضراء والبيض زرعتها الديدان الفردية. وتبين هذه الأرقام أن الديدان عرض مجموعة واسعة من التشكيلات الحركية. كما هو موضح سابقا في الدراسات خلية واحدة19،،من2021، يمكن استخدام هذه الفردية لفهم تصميم الدوائر الوراثية، فضلا عن الترابط بين مسارات متميزة19، 22.
للتجارب الناجحة، من المهم لتحميل الديدان في الجهاز موائع جزيئية بسرعة. بينما الديدان تزحف على سطح أجار، فإنهم يميلون إلى التهيج في البيئة السائلة، ويدفع هذا السلوك برنامج وراثية التي هي مؤنزم البروتين أمبير تنشيط المشاركة23،24. لتقليل هذا اضطراب غير مرغوب فيه، من المهم وضع الديدان في تلك الدوائر منفصلة بسرعة، المجهرية في الدائرة ونفاذيه الهواء PDMS توفر الديدان مع بيئة يحاكي سطح صلب. 5 على الرغم من أن الضغط العالي يساعد على الديدان تحميل أسرع، ممارسة ضغوط الجهاز كثيرا يمكن حمل الضغط الميكانيكي على الديدان. الديدان شدة وأكد لا تغذية أو وضع البيض، أسفر عن النمط الظاهري التعبئة واضحة يمكن ملاحظتها25. بعد التحميل، ويتم تغذية الديدان OP50 كولاي عن 2-3 ساعات، مما يسمح الديدان التكيف مع بيئة موائع جزيئية وتقديم الباحث فرصة لمراقبة الحيوانات وتجاهل تلك التي أصيبت بأضرار.
الحجم والتباعد من المجهرية في كل دائرة هي الأمثل للديدان نمت لساعات 46 من اعتقال L1 عند 25 درجة مئوية. يمكن الارتقاء بدراسة الديدان كبار السن الهياكل أو خفضت إلى دراسة L4 اليرقات التي أصغر في الحجم. ومع ذلك، الديدان ليست قادرة على تساقط بنجاح في الدائرة، النافية لدراسة التنمية بعد طور في هذا الجهاز. لمثل هذه التطبيقات، يمكن النظر في أساليب مثل وورموتيل26 . منذ يقتصر الديدان لكن ليس المعطل تداولها في وورمسبا، تجربة ناجحة لدائم يعتمد على ما إذا كانت الحيوانات البقاء في الدائرة. ونجد أن هذا يمكن أن يكون تحديا لليرقات في مرحلة مبكرة، للذكور البالغين، وبعض طفرات خنثي.
بدلاً من استخدام مدخل المخزن مؤقت واحد (في مركز الأعلى، الشكل 1)، يمكن استخدام مداخل رأسا على شكل بالون اثنين في وقت واحد. ملء المحاقن اثنين مع المخازن المؤقتة مختلفة، واحد يمكن أن تولد بيئات منظم وقتيا بالضغط على الحقن مختلفة في أوقات مختلفة. على سبيل المثال، يسمح هذا، دراسة للتكيف مع البيئة المتغيرة. 27 , 28
وكما ذكر أعلاه، يمكن استخدام الجهاز موائع جزيئية الموصوفة هنا لمجموعة واسعة من التطبيقات الأخرى. وهذه تشمل دراسة الاستجابات لمنبهات البيئية الأخرى. مثل هذه الاستجابات قد تشمل تغييرات في التعبير الجيني ووضع البيض السلوكيات، كما يتضح هنا، لكن أيضا تغييرات في تراكم الأيض والدهون (مثلاً عن طريق الدهون تلطيخ بالأحمر النيل)، فسيولوجيا الخلايا العصبية والإشارات (مثل قبل الكالسيوم أوبتوجينيتيك وتصوير الاضطرابات)، التغيرات في السلوكيات الحركية مثل الضخ والتغوط ورئيس حركة (عن طريق التصوير الآلي الكمية الوقت الفاصل بين تسلسلات) والمزيد.
وأخيراً، هذا النهج الآلي إلى حد كبير ويقلل من حزب العمل اللازمة لتجارب طويلة على مدى ساعات عديدة، حتى أيام. حالما يتم حفظ مواقع الديدان الفردية في البرنامج الحصول على البيانات، التجربة تتألف من التسجيل الآلي للصور، بينما تحتفظ وحدة تحكم مضخة ميكانيكية تدفق مستمر من المخزن المؤقت إلى الجهاز. الأهم من ذلك، صنع جهاز وورمسبا لا تتطلب أي بروتوكول الطباعة الحجرية لينة أكثر من معيار، ويتم تصميمها وعملية بسيطة بما يكفي حتى للباحثين مع عدم وجود خبرة سابقة في ميكروفلويديكس. مع مختلف المزايا التي نوقشت أعلاه وخطوات إعداد بسيطة نسبيا، يمكن أن يكون هذا النهج مفيداً لأولئك الذين يفكرون في قياس طولية من الديدان يعيش تحت ظروف خاضعة للرقابة تحديداً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا البحث بتأييد من "المؤسسة الوطنية للعلوم" من خلال منح فيز-1205494 والمجلس-1413134 (ش) ومن 2017R1D1A1B03035671 منحة "مؤسسة البحوث الوطنية في كوريا" (KSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T.
- NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J.
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
