In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmer mit einem benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht.
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Methodenartikel
Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In den letzten zehn Jahren mikrofluidischen Techniken angewendet wurden, um kleine Tiere, einschließlich der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans, zu studieren und haben sich bewährt als praktisch live imaging Plattform bietet Funktionen für präzise Steuerung der experimentellen Bedingungen in Echtzeit. In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmern beschäftigt WormSpa, ein zuvor veröffentlichten benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht. Um die Funktion zu veranschaulichen, haben wir Proof of Principle Experimenten, in denen Würmer im Gerät mit pathogenen Keimen infiziert wurden, und die Dynamik des Ausdrucks der Immunantwort Gene und Eiablage wurden in einzelnen kontinuierlich überwacht Tiere. Einfache Planung und Betrieb dieses Gerätes machen es für Benutzer ohne Vorkenntnisse mit mikrofluidischen basierenden Experimente geeignet. Wir schlagen vor, dass dieser Ansatz nützlich für viele Forscher in Längsrichtung Beobachtungen biologischer Prozesse unter genau definierten Bedingungen interessiert sind.
Einleitung
Veränderungen der Umweltbedingungen führen zu einer Aktivierung des genetischen Programme, die begleitet von Induktion und Unterdrückung der Expression bestimmter Gene1,2. Diese kinetische Änderungen möglicherweise Variable unter Gewebe in den gleichen Tieren und zwischen den verschiedenen Tieren. Studien über solche genetische Programme fordern daher Methoden, die ermöglichen längs-Bildgebung einzelner Tiere und dynamische Kontrolle der Umweltbedingungen.
In den letzten Jahren wurden Microfabricated fluidischen Geräten verwendet, um viele Aspekte der Reaktion und Verhalten bei klei....
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Protokoll
Das Protokoll unten verwendet WormSpa5, ein zuvor beschriebenen mikrofluidischen Gerät für die longitudinale Bildgebung von Würmern. Herstellung von WormSpa (beginnend mit CAD-Dateien, die von den Autoren auf Anfrage erreicht werden können) ist einfach aber erfordert einiges an Fachwissen. In den meisten Fällen kann Fertigung ohne weiteres erfolgen, durch eine zentrale Anlage oder von einem gewerblichen Unternehmen, das solche Dienste bereitstellt. Wenn das Gerät herstellen, stellen Sie sicher, um anzugeben, dass die Höhe der Features 50 µm beträgt.
1. Versuchsaufbau
- Montieren Sie das mikrofluidischen Gerät....
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Ergebnisse
Alter-synchronisierte jungen Erwachsenen Würmer (46 Stunden Post L1 Larven Verhaftung bei 25 ° C)12 wurden in das Gerät geladen, wie im Protokoll beschrieben. Die Würmer befanden sich einzeln in separaten Kanälen ermöglichen längs der Tiere als Reaktion auf den Erreger zu messen. Wenn der Versuch erfolgreich ist, bleiben die meisten Würmer in ihren Kanälen für die Dauer des Experiments. In diesem Fall sind Bilder von einzelnen Würmer genommen, einfach indem man ihr.......
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Diskussion
Mikrofluidische Tools bieten mehrere Vorteile bei der Untersuchung von Würmern. Bildgebung in einem PDMS bietet Gerät höhere Bildqualität im Vergleich zu einer standard NGM-Agar-Platte. Mehrere Bilder können ein einziger Wurm, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden entnommen werden, in denen Tiere abgeholt von der Platte und montiert auf einen Objektträger für die Bildgebung. Darüber hinaus kann der Mikroumgebung, in denen Würmer befinden sich, konstant oder modulierte wie gewünscht, erlaubt präzise Zuordnung zwischen de.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Science Foundation durch Zuschüsse PHY-1205494 und MCB-1413134 (EL) und die National Research Foundation of Korea Grant 2017R1D1A1B03035671 (KSL).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| WormSpa | N/A | N/A | Die CAD-Datei für WormSpa ist im Levine-Labor erhältlich. |
| Zusammengesetztes Mikroskop | Zeiss | AxioObserver Z1 | Ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit motorisiertem Tisch |
| Spritzenpumpe | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0,034" (0,86 mm) Innendurchmesser x 0,052" (1,32 mm) Außendurchmesser |
| Spritzenspitze | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2" stumpfe Spitze Edelstahl-Canula |
| Spritzenvorsatzfilter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Spritzenvorsatzfilter mit 5 μm Supor Membran |
| Spritze | Qosina | C3307 | 10 mL männliche Luer-Lock-Spritze |
| 3-Wege-Ventil | ColeParmer | FF-30600-23 | 3-Wege-Sperre mit großer Bohrung, Absperrhähne, 10/Packung, Unsteriler |
| Passstift | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Edelstahl-Passstifte (1/32" Durchmesser x 1/2" Lg.) |
| Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Bindung | Corning | CL S3206 | 0,65 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss mit niedriger Bindung |
Referenzen
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress.
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Nachdrucke und Genehmigungen
