Summary
Dans cet article, nous démontrons imagerie direct des individuels vers employant un dispositif microfluidique personnalisé. Dans l’appareil, vers plusieurs sont individuellement limités afin de séparer les compartiments, qui permettent des multiplexe surveillance longitudinale des divers processus biologiques.
Abstract
Au cours de la dernière décennie, microfluidique techniques ont été appliquées à l’étude des petits animaux, y compris le nématode Caenorhabditis eleganset sont sont avérés utiles comme une plate-forme d’imagerie live pratique offrant des capacités pour un contrôle précis de la conditions expérimentales en temps réel. Dans cet article, nous démontrons imagerie direct des individuels vers employant WormSpa, un dispositif microfluidique personnalisé précédemment publiés. Dans l’appareil, vers plusieurs sont individuellement limités afin de séparer les compartiments, qui permettent des multiplexe surveillance longitudinale des divers processus biologiques. Pour illustrer la capacité, nous avons effectué des expériences de démonstration du principe dans lequel les vers ont été infectés dans l’appareil avec des bactéries pathogènes, et la dynamique de l’expression des gènes de la réponse immunitaire et la ponte ont été surveillée en continu, en particulier animaux. La conception simple et le fonctionnement de cet appareil le rendent approprié pour les utilisateurs qui n’ont aucune expérience avec des expériences axées sur la microfluidique. Nous proposons que cette approche sera utile pour beaucoup de chercheurs intéressés aux observations longitudinales des processus biologiques dans des conditions bien définies.
Introduction
Changements dans des conditions environnementales peuvent mener à l’activation de programmes génétiques accompagnée d’induction et de la répression de l’expression de gènes spécifiques1,2. Ces changements cinétiques peuvent être variable chez les tissus chez les mêmes animaux et entre les différents animaux. Études de tels programmes génétiques par conséquent appellent des méthodes qui permettent l’imagerie longitudinale de chaque animal et fournissent un contrôle dynamique précis des conditions environnementales.
Ces dernières années, des dispositifs fluidiques microfabriques ont été utilisés pour étudier les nombreux aspects de la réponse et le comportement chez de petits animaux, y compris les vers, les mouches, les ours de l’eau et plus3,4,5,6, 7. Les applications comprennent, par exemple, phénotypage profonde, optogenetic d’enregistrement de l’activité neuronale en réponse à des stimuli chimiques et le suivi des comportements moteurs tels que de la locomotion et pompage8,9,10 , 11.
Approches axées sur la microfluidique détiennent de nombreuses propriétés qui pourraient bénéficier à long terme imagerie longitudinale de la réponse aux signaux environnementaux, y compris un contrôle dynamique précis du microenvironnement local, conception flexible qui permet le maintien de la des animaux dans des quartiers séparés et les attributs favorables pour l’imagerie. Cependant, maintenir les animaux dans une chambre de microfluidique pendant une longue période avec un impact minimal indésirable sur leur bien-être est un défi qui demande une attention particulière à la conception du dispositif microfluidique, ainsi que dans l’exécution de l’expérience.
Nous démontrons l’utilisation de WormSpa, un dispositif microfluidique pour l’imagerie longitudinale de Caenorhabditis elegans. 5 vers individuels sont confinés dans les chambres. Un faible débit constant de suspension liquide et bactérienne garantit que les vers sont bien nourris et suffisamment actif pour rester en bonne santé et réduire le stress, et permet à la structure des chambres vers à pondre des œufs. La simplicité de la conception et l’exploitation de WormSpa devraient permettre des chercheurs qui n’ont aucune expérience en microfluidique à intégrer ce dispositif de leurs propres plans de recherche.
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Protocol
Le protocole ci-dessous utilise WormSpa5, un dispositif microfluidique décrite précédemment pour l’imagerie longitudinale de worms. Fabrication de WormSpa (à partir des fichiers CAO qui peuvent être obtenus auprès des auteurs sur demande) est simple mais nécessite une certaine expertise. Dans la plupart des cas, la fabrication peut être faite facilement par une installation de base ou par une entreprise commerciale qui fournit ces services. Lorsque la fabrication du dispositif, assurez-vous de spécifier que la hauteur des caractéristiques est de 50 µm.
1. expérimental
- Monter le dispositif microfluidique sur un microscope à fluorescence inversé avec une platine motorisée.
- Placer un agitateur orbital proche du microscope, mais veillez à ce que la vibration de l’agitateur n’affecte pas directement le microscope. Par exemple, mettre le vibreur sur un plateau fixé sur un mur qui ne fait aucun contact avec la table optique.
- Placez un pousse-seringue sur l’agitateur orbital. Scotchez le shaker de la pompe afin qu’il ne pas se trémousser en agitant.
2. préparation de l’environnement de la microfluidique
Remarque : Pendant l’expérience, quatre seringues sont connectés au dispositif microfluidique par des tubes de seringue, tel qu’indiqué dans la Figure 1. Cette étape décrit la préparation de ces seringues. Sauf mention contraire, garder les lampes de seringue aussi courts que possible sans les rendre tendue.
- Préparez une seringue de sortie et un tube de la seringue. Cette seringue (S1 à la Figure 1) sera plus tard branché sur la prise de l’appareil par le tube de la seringue et utilisé pour le stockage temporaire du liquide qui sort de l’appareil.
- Faire une aiguille adaptateur en enlevant les pièces en plastique d’une seringue de 20 x 1/2 pouce, gardant seulement l’aiguille (la partie métallique). Le faire en tenant les pièces en plastique et en métal avec des pinces les latéralement. Résidu de plastique sur l’aiguille peut être brûlé avec un bec Bunsen.
- Plier l’aiguille selon la géométrie de l’expérimental tout en maintenant ses deux extrémités avec une pince. Dans la conception décrite ici, la courbure de l’aiguille en son milieu à un angle de ~ 110° est plus pratique.
- Branchez l’aiguille de l’adaptateur à mi-chemin dans le tube. L’autre moitié sera plus tard être branché à l’appareil. Le tube de la seringue doit être compatible avec une seringue de 20 G sans une fuite (par exemple, les tubes avec un diamètre intérieur de 0,86 mm et un diamètre extérieur de 1,32 mm). La longueur de tube recommandé est de ~ 50 cm.
- Connecter une seringue de 10 mL luer-lock à l’autre extrémité (ouverte) du tube seringue via une seringue de 20 x 1/2 pouce.
- Préparer les seringues de tampon d’arrivée et de seringues des tubes. Un de ces seringues (S2 à la Figure 1) est utilisé comme un réservoir pour le liquide qui va dans le dispositif et pour contrôler le débit d’injection. Autre la seringue (S3 dans la Figure 1) est requis pour l’échange de la mémoire tampon, comme expliqué dans l’étape 3.2.
- Connectez une seringue luer-lock de 10 mL (S2) directement sur un robinet à 3 voies et une autre seringue (S3) à la vanne même via un tube de la seringue (Figure 1) : Branchez le S3 au tube via une seringue et le tube sur la vanne via un autre embout de la seringue.
Remarque : L’ordre dans lequel ces matériaux est connectés est sans importance. - Raccorder un tube de la seringue au port restant de la vanne 3 voies. Préparez une autre aiguille adaptateur comme au point 2.1.2 et branchez l’autre extrémité (ouverte) du tube de la seringue de l’aiguille à mi-chemin.
- Régler la soupape de telle sorte que le tube de la seringue à l’étape 2.2.2 et S2 sont connectés alors que S3 est fermé (Figure 1).
- Connectez une seringue luer-lock de 10 mL (S2) directement sur un robinet à 3 voies et une autre seringue (S3) à la vanne même via un tube de la seringue (Figure 1) : Branchez le S3 au tube via une seringue et le tube sur la vanne via un autre embout de la seringue.
- Préparez une seringue de ver-entrée et un tube de la seringue. Cette seringue (S4 à la Figure 1) est utilisé pour charger les vers dans l’appareil.
- Raccorder un tube long de seringue à une seringue de luer lock 10 mL (S4). Déterminer la longueur de ce tube sur le volume du fluide qui sera utilisé pour le chargement ; par exemple, 100 cm de tube prend en charge plus de 2 mL de liquide (voir aussi, l’étape 4.2).
- Préparer une autre aiguille adaptateur comme au point 2.1.2 et branchez une moitié de l’aiguille à l’autre extrémité (ouverte) du tube de la seringue.
- Rincez toutes les seringues et tubes avec S-moyenne12 deux fois. Remplir les seringues et les tubes de S-medium, en prenant soin d’enlever toutes les bulles d’air.
- Connecter le tuyau de sortie seringue à la sortie de l’appareil.
- Branchez l’aiguille de l’adaptateur à l’extrémité du tube de la seringue pour l’orifice de sortie.
- Injecter un petit volume de S-moyenne par le biais de la prise pour remplir l’appareil, jusqu'à ce qu’un petit S-moyenne sort aussi bien l’entrée de la mémoire tampon et l’entrée du ver.
- Connecter le tuyau de la seringue tampon-prise sur le port de tampon d’arrivée de l’appareil, tout en branchant le ver-entrée avec une épingle (goupille de serrage en acier inoxydable d’un diamètre de 1/32 de pouce).
- Injecter un flux constant de mémoire tampon dans l’appareil. Chargez la seringue de la mémoire tampon d’arrivée S2 sur une seringue pompe13et mettre la pompe de telle sorte que le milieu en S2 est continuellement injecté dans l’appareil à un débit de 3 µL/min.
3. chargement de bactéries dans le dispositif microfluidique
- Préparer les Escherichia coli OP50 suspendu en S-moyenne de12.
- Suite à un protocole standard, inoculer un ballon de 250 mL avec 50 mL de LB et une seule colonie et incuber une nuit à 37 ° C.
- Centrifuger la culture nuitée à 4000 tr/min pendant 10 minutes et Resuspendre le culot dans 30 mL de S-milieu.
- La suspension filtrer sur un filtre de seringue de 5 µm. Mesurer la concentration de bactéries par sa densité optique à 600 nm (OD600) et ajuster la concentration à une OD600 de 3. Cette densité élevée est nécessaire pour garder les vers bien nourris.
- Échange de la mémoire tampon dans le dispositif avec la suspension OP50.
- Préparez une seringue propre (S5) remplie avec la suspension OP50. Tenez la seringue verticalement et tapoter plusieurs fois pour recueillir toutes les bulles d’air en haut.
- Tournez la vanne 3 voies des seringues tampon-entrée pour fermer la connexion à l’appareil et branchez les deux seringues, S2 et S3. Rester en S2 le pousse-seringue.
- Débrancher le S2 de la valve et S5 à la valve. Faire sortir tout l’air recueillie dans la partie supérieure de la S5 à S3 à travers la valve jusqu'à ce qu’un peu de la mémoire tampon OP50 passe en S3. Pour ce faire, assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne reste en S5 ou la valve.
- Tournez la vanne 3 voies à la position d’origine pour fermer la connexion entre S3 et S5 et connecter S5 à l’appareil. Télécharger S5 sur le pousse-seringue. Allumez l’agitateur orbital qui maintient la pompe. Régler la vitesse d’agitation à environ 200 tr/min.
- Régler le débit à 100 µL/min. Le temps que nécessaire pour la nouvelle mémoire tampon arriver à la worms dans l’appareil dépend de la longueur du tampon d’arrivée seringue tube (environ 5 minutes avec le tube décrit ci-dessus). Un débit plus élevé peut être utilisé si un échange plus rapide de tampon est requis.
- Une fois que le tampon OP50 se répand dans l’appareil, régler le débit à 3 µL/min.
4. chargement de Worms dans le dispositif microfluidique
- Préparer un tube de microcentrifuge de liaison faible petit (650 µL) et remplissez-le avec 100 µL de suspension OP50. Transfert autour de 20-30 synchronisé âge jeune pick de vers adultes (46 heures après l’arrestation de larves L1 à 25 ° C) d’une boîte de gélose NGM (milieu de croissance nématode) au tube en les choisissant un par un avec un ver. Âge-synchronisation peut se faire suite à un protocole standard de12.
- Remplir à l’entrée du ver-seringue et seringue tube (S4 à la Figure 1) avec la suspension OP50. Injecter ~ 500 µL du liquide dans le tube de microcentrifuge avec worms. Dessiner la suspension avec vers dans le tube de seringue ver-entrée. Assurez-vous que le tube de la seringue est assez longue (> 1 m) et que dessiné vers restent dans le tube de la seringue et ne pas faire tout le chemin à la seringue S4.
- Se connecter à S4 au ver-d’eau. Injecter tous les vers dans le tube de seringue ver-entrée dans le dispositif microfluidique. Déconnectez le S4 et le tube de la seringue. Brancher l’entrée-ver avec une épingle.
- Débrayer la seringue de la mémoire tampon d’arrivée S2 de la pompe mécanique ( Figure 1) et contrôler manuellement les S1 et S2 pour pousser tous les vers dans les canaux distincts. Appuyant sur S2 se déplaceront vers dans les canaux, tout en appuyant sur S1 eux se déplace dans le sens inverse. Une fois qu’un canal est chargé, le ver dans chaque canal se bloque l’entrée des autres vers.
- Permet dajuster worms au nouvel environnement pendant 2-3 heures.
5. mise en place d’un protocole d’imagerie
- Trouver tous les vers qui sont solidement intégrés à l’appareil et définir une position d’imagerie pour chacun d’eux dans le logiciel d’acquisition image qui contrôle votre microscope. Notez que dans certains cas (par exemple lorsque vous souhaitez un grossissement supérieur ou lors de l’utilisation de caméras avec un petit capteur CCD) postes d’imagerie multiples sont nécessaires pour chaque canal.
Remarque : Même si cela peut se faire manuellement, certains paquets de logiciels d’acquisition peuvent charger un fichier texte qui répertorie les postes où les images doivent être prises. Étant donné que ces postes sont régulièrement classés en WormSpa, un utilisateur peut écrire un petit script (par exemple, en Python ou des logiciels commerciaux) qui crée automatiquement une telle liste. Le format précis de ce script dépend le format de fichier attendu par le logiciel d’acquisition (voir un exemple dans 1 de matériel supplémentaire). - Définissez la fréquence requise de l’imagerie Time-lapse. Par exemple, l’imagerie de la réponse immunitaire de gène à l’infection se fait à une fréquence de 10 minutes par image. Assurez-vous que tous les canaux nécessaires (p. ex. lumineux-zone et la fluorescence GFP) sont acquis à chaque instant.
6. l’hôte de réponse à l’infection par Pseudomonas
Remarque : Cette étape est spécifique pour l’étude des interactions hôte-pathogène. Alternativement, on peut préparer une mémoire tampon qui contient les autres signaux environnementaux d’intérêt (facteurs de stress biotiques et abiotiques, médicaments, signalisation des molécules, etc.).
- Préparer les Pseudomonas aeruginosa PA14 suspendu dans SK-médium14.
- Ensemencer un ballon de 250 mL avec 50 mL de LB et une seule colonie et incuber une nuit à 37 ° C.
- Ensemencer un autre flacon de 250 mL avec 50 mL de LB et une partie aliquote de la culture et incuber une nuit à 37 ° C.
- Centrifuger la culture nuitée à 4000 tr/min pendant 10 minutes et Resuspendre le culot dans 10 mL de SK-milieu. Mesurer la concentration bactérienne et ajuster la concentration d’OD600 = 4.
- Transférer la suspension dans un ballon propre et incuber à 37 ° C pendant 24 heures et à 25 ° C pendant 24 heures en agitant. Cette étape imite l’étape d’incubation plaque dans la norme tuant test14.
- La suspension filtrer sur un filtre de seringue de 5 µm. Il s’agit pour empêcher des agrégats bactériens de boucher l’appareil.
- Remplacer la suspension OP50 dans le dispositif avec la suspension de PA14, suivant la même procédure que dans l’étape 3.2. Garder l’imagerie pendant 10 heures.
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Representative Results
Âge-synchronisée jeunes adultes vers (46 heures après arrestation larve L1 à 25 ° C)12 ont été chargés dans l’appareil, tel que décrit dans le protocole. Les vers se trouvaient individuellement dans des canaux séparés, ce qui permet de mesure longitudinale de la réponse des animaux à l’agent pathogène. Quand l’expérience est réussie, la plupart vers restent dans leurs rainures pour la durée de l’expérience. Dans ce cas, les images de worms individuelles sont prises simplement en plaçant leur chaîne dans le chemin d’accès d’imagerie, en évitant de rechercher activement l’animal. Figure 2 A montre les images de champ lumineux d’un seul ver représentatif au cours de dix heures dans l’appareil. Alors que les vers sont confinés dans leurs canaux, ils peuvent se déplacer vers le haut - et en aval et peut tourner librement leurs têtes. Ceci est crucial pour garantir que l’appareil lui-même ne pas causer un stress ou blesser les animaux.
Nous avons mesuré la réponse vers à une infection bactérienne par P. aeruginosa, un des mieux étudiés bactériennes pathogènes de c. elegans. C’est aussi un pathogène humain opportuniste qui provoque une infection dans la fibrose kystique et les patients immunodéprimés. Nourrir les vers avec des souches particulières P. aeruginosa, tels que la clinique isoler PA14, conduit à une infection intestinale mortelle, et les facteurs de virulence impliqués dans ce processus sont également impliqués dans l’infection des hôtes mammifères. 14 , 15
Pour examiner le plan des changements dans l’expression des gènes au cours de l’infection bactérienne, reporters fluorescents peuvent être employées. Parmi de nombreux gènes qui affichent une réponse dynamique aux infections, nous avons mesuré la réponse transcriptionnelle de l' irg-1 (gène de réponse infection 1), par imagerie de fluorescence GFP vers transgéniques exprimant GRI-1::GFP (AU0133 [agIs17 () PIRG-1::GFP ; PMYO-2::mCherry)], obtenu du labo Ausubel). IRG-1 est connu pour être fortement induite dans l’intestin des animaux infectés au stade précoce de l’infection par P. aeruginosa PA14. 16 , 17 Figure 2 B montre des images d’un ver représentatif (le même animal comme dans la Figure 2A). Chaque image de fluorescence a été prise immédiatement après l’image de lumineux-zone correspondante. Dans la premier 5 heures après l’infection, la fluorescence GFP augmente seulement légèrement dans le corps de milieu et de la queue. Alors, une augmentation substantielle de la fluorescence est observée, à partir du corps du milieu. La fluorescence totale dans chaque ver est représentée dans la Figure 2C en fonction de l’infection de post de temps. Ces données illustrent non seulement de l’induction décrit précédemment de l' irg-1 PA14 infectées, mais aussi de la variabilité du ver-à-vis sans fin dans le calendrier et l’ampleur de l’induction.
La conception du dispositif microfluidique WormSpa comprend des filtres qui collectent les oeufs pondus par chaque ver individuel5. Une fois que les œufs éclosent, les larves L1 sont lavés à travers le filtre et dans le tube de sortie. Cela nous a permis de contrôler manuellement la cinétique de Ponte de worms individuels au cours de l’infection bactérienne. Les images de laps de temps des oeufs pondus par le ver même comme dans la Figure 2 sont indiqués dans la Figure 3A. Ces images ont été prises juste après les images de lumineux-zone correspondants à la Figure 2A. Le nombre cumulé de œufs pondus par chaque ver apparaît en fonction du temps après infection dans la Figure 3B, tandis que la moyenne et l’écart-type sur l’ensemble de la population sont illustrés à la Figure 3C. Ces données capturent la variabilité de l’animal à l’autre ainsi que la baisse de ponte à mesure que progresse l’infection décrits précédemment. En revanche, chez les animaux sains, taux de Ponte ne décline pas jusqu'à ce qu’il culmine à ~ 54 heures post L1 à 25 ° C5,18.
Figure 1: régime expérimental de l’imagerie direct vers dans un dispositif microfluidique. Vers sont chargés dans l’appareil via l' entrée de veret sont par la suite poussés dans des canaux séparés. Suspension bactérienne est injectée dans l’appareil de l' entrée du tampon par une pompe mécanique montée sur un agitateur orbital. Le tampon sort par l' orifice de sortie du dispositif. Quatre seringues (S1, S2/S5, S3 et S4) sont utilisés pour faire fonctionner l’appareil. Les lignes en pointillés rouges sont des tubes de seringue reliant les seringues et le périphérique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2: cinétique d’expression de gène représentant. Images d’un ver représentant prises par microscopie de fluorescence GFP champ Bright (A) et (B) . Les images à l’extrême gauche ont été prises juste avant l’introduction de l’agent pathogène, alors que les images à droite ont été prises 10 heures après l’infection par PA14. L’intervalle de temps entre les images est 1 heure. (C) l’évolution temporelle du total irg-1:: fluorescence GFP à worms individuels. Chaque ligne correspond à un seul animal. Les lignes sont triées par ordre décroissant de fluorescence moyenne. Intensité de la fluorescence est codé par couleur, et la balance de couleur est indiquée à droite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3: cinétique représentatif de ponte. (A) le temps des images du nombre de œufs pondus par le ver même illustré à la Figure 2A et B. Les images à l’extrême gauche ont été prises juste avant l’introduction de l’agent pathogène, alors que les images à droite ont été prises 10 heures après l’infection par PA14. L’intervalle de temps entre les images est 1 heure. (B) l’évolution temporelle du nombre cumulé de œufs à worms individuels. Chaque ligne correspond à un seul animal. Les lignes sont triées dans l’ordre décroissant du nombre de œufs pondus par ver. Le nombre de œufs est codé par couleur, et la balance de couleur est indiquée à droite. (C) le nombre moyen de œufs déposés par ver en fonction du temps. La zone grise indique un écart de ±. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
1 de matériel supplémentaire : un exemple de script qui crée un fichier texte contenant les positions d’imagerie pour tous les canaux dans le dispositif de WormSpa. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Microfluidique outils offrent plusieurs avantages dans l’étude de worms. Imagerie dans un PDMS dispositif offre une meilleure qualité d’imagerie par rapport à une norme gélose NGM. Plusieurs images peuvent provenir d’un seul ver, contrairement aux méthodes traditionnelles dans lesquelles les animaux est cueillies sur la plaque et montée sur une lame de microscope pour l’imagerie. En outre, le microenvironnement dans lequel résident les vers peut être maintenu constant ou modulé comme vous le souhaitez, permettant le mappage entre la composition de l’environnement et de la réponse des animaux précis.
Ici, nous avons montré comment effectuer une mesure longitudinale de la réponse de l’hôte à l’infection bactérienne par imagerie de la réponse des multiples vers individuels au pathogène opportuniste de P. aeruginosa PA14 utilisant un dispositif microfluidique personnalisé (WormSpa). Lumineux-zone et la fluorescence des images ont été prises à plusieurs reprises sans perturber l’expérience en cours. En particulier, la cinétique de la ponte et l’expression du gène irg-1 ont été sondé toutes les 10 minutes, une augmentation significative dans la résolution temporelle plus les méthodes traditionnelles de14,15.
Dans ce dispositif, des mesures longitudinales vers de multiples peuvent être réalisées en revisitant l’emplacement d’enregistrement de chaque ver à un moment donné. Cela a été démontré dans les Figures 2C et 3 b, où nous quantifier l' irg-1:: fluorescence GFP et les oeufs pondus par worms individuels. Ces chiffres montrent que vers affichent large éventail de profils cinétiques. Comme précédemment indiqué dans études unicellulaires19,20,21, cette individualité permet de comprendre la conception de circuits génétiques, ainsi que la corrélation entre des voies distinctes19, 22.
Pour des expériences réussies, il est essentiel de charger vers dans le dispositif microfluidique rapidement. Alors que vers rampent sur la surface de la gélose, ils ont tendance à thrash en milieu liquide, et ce comportement induit un programme d’amélioration génétique dans lequel AMP activé protéines kinases sont impliquées23,24. Pour minimiser cette perturbation indésirable, il est important de placer les vers dans leurs chambres séparées rapidement, comme les microstructures dans la chambre et la perméabilité à l’air du PDMS fournissent vers un environnement qui imite la surface solide. 5 même si exerçant une pression plus élevée permet de worms de chargement plus rapide, mise sous pression de l’appareil trop pouvait induire des contraintes mécaniques sur les vers. Vers qui sont gravement éprouvés ne pas de œufs se nourrissent ou laïcs, ayant pour résultat un ensachage clairement observable phénotype25. Après le chargement, vers sont nourris d’e. coli OP50 pendant 2-3 heures, qui a accueilli les vers pour s’adapter à l’environnement de la microfluidique et offrant le chercheur l’occasion d’observer les animaux et jetez ceux qui ont été endommagés.
La taille et l’espacement des microstructures dans chaque chambre sont optimisés pour les vers cultivés pendant 46 heures de l’arrestation de L1 à 25 ° C. Les structures peuvent être transposés pour étudier plus âgés vers ou réduites pour examiner des larves de L4 qui sont plus petits en taille. Cependant, les vers ne sont pas capables de muer avec succès dans la chambre, excluant l’étude du développement postembryonnaire dans cet appareil. Pour ces applications, on peuvent considérer les méthodes telles que WorMotel26 . Étant donné que les vers sont limités mais pas immobilisées dans WormSpa, une expérience durable réussie dépend de savoir si les animaux restent dans la chambre. Nous trouvons que cela peut être difficile pour les larves de stade précoce, pour les hommes adultes et pour certains hermaphrodites mutants.
Au lieu d’utiliser une entrée seul tampon (au centre du sommet, Figure 1), les deux prises de tête en bas en forme de ballon peuvent être utilisés simultanément. Remplissant les deux seringues avec différents tampons, on peut générer des environnements temporellement structurés en appuyant sur les seringues différentes à différents temps. Cela, permet par exemple, étude sur l’adaptation aux changements d’environnement. 27 , 28
Comme mentionné ci-dessus, le dispositif microfluidique décrit ici peut être utilisé pour un large éventail d’autres applications. Citons notamment étudier les réponses aux autres signaux environnementaux. De telles réactions peuvent inclure des changements dans l’expression des gènes et la ponte des comportements, comme illustré ici, mais aussi des changements dans l’accumulation du métabolisme et des graisses (par exemple par le biais de graisse la coloration par le rouge du Nil), physiologie neuronale et signalisation (par exemple par calcium d’imagerie et d’optogenetic perturbations), changements dans les comportements moteurs telles que le pompage, mouvement de défécation et la tête (via l’imagerie quantitative automatique de séquences de Time-lapse) et plus encore.
Enfin, cette approche est en grande partie automatisée et réduit la main-d'oeuvre requise pour longues expériences pendant plusieurs heures, voire des jours. Une fois que les emplacements de worms individuels sont enregistrés dans le logiciel d’acquisition de données, l’expérience se compose d’enregistrement automatique des images, tandis que le contrôleur de pompe mécanique maintient le flux constant de mémoire tampon dans l’appareil. Ce qui est important, fabrication d’un dispositif de WormSpa ne nécessite pas de n’importe quel protocole de lithographie douce plus que la norme, et sa conception et l’exploitation sont assez simples même aux chercheurs qui n’ont aucune expérience en microfluidique. Avec les différents avantages susmentionnés et les étapes de préparation relativement simple, cette approche peut être utile à ceux qui envisagent une mesure longitudinale vers vivants dans des conditions contrôlées avec précision.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la National Science Foundation, par le biais de subventions PHY-1205494 et MCB-1413134 (EL) et par la 2017R1D1A1B03035671 de subvention National Research Foundation of Korea (KSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
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