Methodenartikel

Bau von synthetischen Phagen Fab Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt angezeigt

DOI:

10.3791/57357

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1. Mai 2018

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1Laboratory of Antibody Engineering, Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, 2Banting and Best Department of Medical Research, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Molecular Genetics, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für den Bau einer synthetischen Antikörper Phagen angezeigt-Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt. Synthetischen Antikörper haben breite Anwendungen von der Grundlagenforschung zur Krankheit Diagnostik und Therapie.

Zusammenfassung

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Nachfrage für monoklonale Antikörper (MAK) in Grundlagenforschung und Medizin steigt jährlich. Hybridom-Technologie wurde die dominierende Methode für mAb Entwicklung seit seinen ersten Bericht im Jahr 1975. Als eine alternative Technologie sind Phagen-Display-Methoden für mAb Entwicklung zunehmend attraktiv, da Humira, der ersten Phagen abgeleitet Antikörper und eines der meistverkauften mAbs, für die klinische Behandlung der rheumatoiden Arthritis im Jahr 2002 genehmigt wurde. Als ein nicht-tierischen mAb Entwicklungstechnologie basiert, umgeht Phagen-Display Antigen Immunogenität, Humanisierung und tierischen Wartung, die von traditionellen Hybridom-Technologie basieren Antikörperentwicklung erforderlich sind. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Bau von synthetischen Phagen angezeigt Fab Bibliotheken mit Vielfalt von 109-1010 mit einem einzigen Elektroporation erhältlich. Dieses Protokoll besteht aus: 1) Hochleistungs-Elektro-kompetente Zellen Vorbereitung; (2) Extraktion von Uracil-haltigen einzelsträngiger DNA (dU-SsDNA); (3) Kunkels Methode basiert Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese; (4) Electroporation und Berechnung der bibliotheksgröße; (5) Protein A/L-based Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) zum Falten und funktionelle Diversität Bewertung; und 6) DNA-Sequenzanalyse der Vielfalt.

Einleitung

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mAbs haben breite Anwendungen von Grundlagenforschung bis hin zu Krankheit, Diagnostik und Therapie. Ab 2016 sind mehr als 60 mAbs durch die U.s. Food and Drug Administration (USFDA) für die klinische Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionskrankheiten1,2zugelassen.

Im Jahr 1975 berichtet, Kohler und Milstein, eine Technik für die kontinuierliche Erzeugung von Antikörpern eine einzelne klonalen Spezifität aus einer zellulären Quelle genannt "hybridome" und diese Technik später ein Eckstein in Medizin und Industrie3 geworden ist ,4. Generation von mAbs durch diese Methode erfordert verschiedene Schritte einschließlich Antigen Produktion, Maus Immunisierung, Gewinnung von B-Lymphozyten, Verschmelzung von B-Zellen mit Myelom-Zellen unsterblich Hybridoma Zellen, Klon-Auswahl, zu bilden und für therapeutische Anwendungen, Humanisierung ist erforderlich, um menschliche Anti-Maus-Antikörper (HAMA)4,5zu vermeiden. Für diese Technologie sind Antigene wie Toxine, Krankheitserreger und hoch konservierte Proteine jedoch relativ unwirksam bei der Auslösung einer Immunantwort in Vivo , mAb Produktion5.

Im Jahr 1978 berichtet Hutchison Et Al. die Verwendung von ein Oligonukleotid, direkte Mutagenese ein Rückstand in eine einsträngige Bakteriophagen Virus6. 1985 berichtete Smith, dass Fremd-gen-Fragmente können im Frame mit dem Gen Kodierung Phagen Hüllprotein III verschmolzen werden und somit auf der Phagen-Oberfläche angezeigt werden, können ohne seine Infektiosität7. Diese bahnbrechenden Werke einen Grundstein für den späteren Bau des Phagen angezeigt Antikörperbibliotheken in immun, naiv und synthetischen bildet mit den Formaten von Single-Chain Variable Fragment (ScFv) und Antigen-bindenen Fragment (Fab) für therapeutische mAb Development8,9. Aus technischer Sicht Phagen-Display-basierten Antikörper-Entwicklung bietet einen ergänzenden Ansatz für mAb Hybridom-basierte Entwicklung, die dazu beitragen kann, um die Beschränkungen zu umgehen, die einige Antigene darstellen können und die Humanisierung zu verarbeiten Hybridom abgeleitet Antikörper erfordern oft5. Ab 2016 6 Phage Display abgeleitet mAbs auf dem Markt, einschließlich Humira, eines der erfolgreichsten mAbs verwendet für die Behandlung der rheumatoiden Arthritis zugelassen und viele Phagen-Display abgeleitet Antikörper-Kandidaten befinden sich in verschiedenen Stadien der klinischen Untersuchung10.

Für immun- und naiv Phagen Antikörperbibliotheken, die Vielfalt der Komplementarität bestimmen Regionen (CDRs) in leichte und schwere Kette leitet sich aus dem natürlichen immun-Repertoire (d.h., von B-Zellen). Im Gegensatz dazu ist die Vielfalt der CDRs in synthetischen Phagen Antikörperbibliotheken völlig künstlich. Synthetische Ansätze zur Bibliotheksbau bieten präzise Kontrolle über das Design der Sequenz Vielfalt und bieten Möglichkeiten für mechanistische Studien der Antikörper-Struktur und Funktion11,12. Darüber hinaus kann der Rahmen für synthetische Bibliotheken vor Bibliotheksbau flussabwärts, groß angelegte industrielle Entwicklung11,12zu erleichtern optimiert werden.

1985, Kunkel berichtet einen einsträngige DNA (SsDNA) Template-basierte Mutagenese Ansatz effizient einzuführen Site-verwiesene Mutationen in Bakteriophage M1313. Dieser Ansatz wurde später für den Bau von Phagen angezeigt Bibliotheken verbreitet. Chemisch synthetisierten DNA Oligonucleotides entwickelt, um Vielfalt in Fab CDRs sind ein Phagemid mit einem Antikörper Rückgrat Template integriert. In diesem Prozess der Phagemid wird als ein Uracil-haltigen SsDNA (dU-SsDNA) ausgedrückt und die Oligonucleotides sind geglüht auf die CDRs und erweitert, um doppelsträngige DNA (DsDNA) im Beisein von T7 DNA Polymerase und T4 DNA-Ligase zu synthetisieren. Schließlich kann generierte ds-DNA durch Elektroporation in Escherichia coli eingebracht werden.

Für hohe Diversität, Phagen angezeigt Bibliotheksbau, Hochspannungs-Elektroporation von einer zwei-Komponenten-Mischung aus Electro-kompetente Zellen und kovalent sollten geschlossene kreisförmige DsDNA (CCC-DsDNA) sorgfältig vorbereitet werden. Sidhu Et Al. modifiziert die Vorbereitung von Electro-kompetente Zellen und DNA von traditionellen Methoden und stark verbesserte Bibliothek Vielfalt14.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Bau von synthetischen Phagen angezeigt Fab Bibliotheken mit Vielfalt von 109-1010 mit einem einzigen Elektroporation erhältlich. Abbildung 1 zeigt eine Übersicht der Bibliothek Bau einschließlich: 1) Hochleistungs-Elektro-kompetente Zellen Vorbereitung; (2) Gewinnung von dU-SsDNA; (3) Kunkels Methode basiert Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese; (4) Electroporation und Berechnung der bibliotheksgröße; (5) Protein A/L-based ELISA zum Falten und funktionelle Diversität Bewertung; und 6) DNA-Sequenzanalyse der Vielfalt. Alle Reagenzien, Stämme und Ausrüstung sind in der Tabelle des Materialsaufgeführt. Tabelle 1 zeigt das Reagenz-Setup.

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Protokoll

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Hinweis: Sterile Filterspitzen müssen im ganzen verwendet werden beim Umgang mit Phagen zur Vermeidung von Kontaminationen, Pipette Pistole und Umgebung. Aseptischen Bereich oder Haube muss beim Umgang mit Bakterien und Phagen Experimente verwendet werden. Phagen-Experiment-Bereich muss mit 2 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) gefolgt von 70 % igem Ethanol zur Vermeidung von Kontaminationen Phagen bereinigt werden. Für die Herstellung von Verdünnungsreihen in diesem Protokoll, sollten neue Tipps für jede Verdünnung verwendet werden.

1. E. Coli SS320 Elektro-kompetente Zellen Vorbereitung

  1. Pre-warme LB/Tet nährbodenplatte (vorbereitet und gespeicherte bei 4 ° C für weniger als 1 Woche alt) bei 37 ° C Inkubator für 1 h verwenden einen sterilen Impfschlinge oder sterilen Tipp zu Streifen, einem Glycerin bestand von E. Coli SS320 Zellen auf die vorgewärmten LB/Tet-Agar-Platte in einer Zick-Zack-Richtung Tion sanft entlang der Oberfläche der Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C Inkubator über Nacht für ca. 12-15 h.
  2. Können Sie am folgenden Tag, einen sterilen Impfschlinge oder sterilen Tipp Wählen Sie eine gut getrennte einzelnen Kolonie entlang der Zick-Zack-Linie und impfen in 10 mL 2YT/Tet Medium in einem 50mL Rundboden Röhrchen durch Eintauchen der Schleife in das Medium und kurz rühren.
  3. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für ca. 3-4 Std. bis OD600 bei rund 0,4-0,8 (Phase Vergrößerung) erreicht ist. Monitor OD600 bei 2 h. Während dieser Zeit wärmen Sie 5 LB/Tet Agarplatten (vorbereitet und gespeicherte bei 4 ° C für weniger als 1 Woche alt) in einem Inkubator 37 ° C für mindestens 1 h vor.
  4. Fügen Sie 20 μL M13KO7 Helfer Phagen aus Lab Lager mit Titer ca. 1 x 1013 koloniebildenden Einheit (KBE) /mL in 180 μL der sterilen 1 X PBS in autoklaviert 1,5 mL Röhrchen 10 vorbereiten um das Zehnfache Verdünnungsreihen.
  5. Aliquoten 4 mL autoklaviert und flüssigen 2YT obere Agar in 5 X 14 mL unten Rundrohr, jedes Rohr mit einer Verdünnung von der fünften bis zur neunten der Zehnfache Verdünnung bzw. beschriften und brüten in einem 65 ° C Inkubator 2YT obere Agar in flüssigem Zustand zu halten.
  6. Mix 500 μL der Log-Phase SS320 E. Coli Zellen in M13KO7 Verdünnung Rohr (Wählen Sie der fünfte Zehnfache Verdünnung bis zur neunten Zehnfache Verdünnung) und in einem Inkubator 37 ° C für ca. 5-10 min inkubieren.
  7. Während der Inkubation der Schritt 1.6 übertragen Sie 2YT obere Agar von Schritt 1.5 auf Raumtemperatur (RT) für etwa 5 min auf ca. 42 ° c abkühlen lassen Verwenden Sie inneren Handgelenk, um Temperatur von 2YT obere Agar zu testen; Es sollte bleiben als Flüssigkeit. Übertragen Sie jedes Verdünnung Mischung aus Schritt 1.5 auf jede entsprechende 2YT obere Agar Röhre. Ziehen Sie den Deckel des jedes Rohr und Mischen von auf den Kopf drehen mehrmals sanft und kurz um die Blase zu vermeiden.
  8. Sorgfältig jeden Teig entlang der Kante des Pre-warme LB/Tet Agarplatte (aus Schritt 1.3) und neigen sich die Platte leicht an, um vollständig und gleichmäßig die Platte mit der Mischung füllen, während die Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Halten Sie die Platten bei RT für ca. 5-10 min zu festigen die obere Agar innerhalb jeder Platte und inkubieren Sie die 2YT obere Agar-Platten bei 37 ° C über Nacht für ca. 15-18 Uhr.
  9. Wählen Sie die Verdünnung Platte nach Übernachtung Wachstum Schritt 1,8 mit rund 100-200 durchschnittlicher Größe, einheitliche, gut getrennte Plaketten für Plaque Inokulation. Verwenden Sie einerseits die Agarplatte gegen eine Lichtquelle und andererseits eine Pipette-Pistole mit einer langen sterilen PIPETTENSPITZE, vertikal in die obere Agar zu erstechen geladen zu halten zu halten, und sammeln Sie eine Gedenktafel für Einzel- und gut getrennte zu.
    1. Neigen Sie die PIPETTENSPITZE leicht um obere Agar mit Plakette zu trennen. Pipette nach oben und unten mehrmals, Agar mit Plakette in ein 14 mL Rundboden Kultur Röhrchen mit 1 mL 2YT/kan/Tet Medium vorinstalliertem zu verdrängen (siehe Tabelle 1).
    2. Wiederholen Sie dieses Verfahren, um insgesamt ca. 3-5 Plaketten holen. Der Zweck der Kommissionierung mehrere Plaketten besteht darin erfolgreiche Impfung, wie eine Gedenktafel schwach und relativ gering im Vergleich mit einer Bakterienkolonie sein kann. Die Plaketten für 8 h bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min zu wachsen.
  10. Transfer einer Röhre Kultur in 50 mL 2YT/kan/Tet Medium in einem 250-mL-ratlos-Kolben hineinzuwachsen. Bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für ca. 12 h über Nacht wachsen.
  11. Drei 2-L ratlos Fläschchen mit 900 mL Superbroth/Tet/kan Medium mit 5 mL der Übernacht-Kultur zu impfen. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für ca. 6-7 h OD600 um 0,6-0,8.
  12. Kühlen Sie die drei Kolben der Bakterienkultur im Eisbad für 5 min mit sanften ständige Verwirbelung von hand. Die folgenden Schritte sollten in einem kalten Raum, auf Eis, mit prechilled Lösungen und Ausrüstung erfolgen.
  13. Verwenden Sie Absorption Gewebe Handtuch zum Trocknen Sie des äußere Glas von jedem Kolben; Verwenden Sie einerseits um die autoklaviert Zentrifuge 1-L-Flasche auf Bank und andererseits das Medium leicht aus jeder Flasche in jede Zentrifuge Flasche Gießen schräg.
  14. Drehen Sie bei 5.000 × g und 4 ° C für 10 min bis zum pellet-der Bakterien.
  15. Nach Zentrifugation sanft Dekantieren des Überstands in ein 5-L autoklaviert Abfall Becherglas.
  16. Füllen Sie jede Flasche mit 100 mL steril filtriert 1,0 mM HEPES, pH 7,4, und jede Flasche bei Pellet Wiederfreisetzung bei 200 u/min fügen Sie eine Bar autoklaviert magnetische rühren hinzu. Wirbeln Sie und vertreiben Sie die gesamte Pellet aus der Flaschenwand alle mehrere Minuten während der magnetischen rühren. Wenn die Tablette aufgelöst ist, füllen Sie jede Flasche mit einem zusätzlichen 400 mL steril filtriert 1,0 mm HEPES, pH 7.4.
  17. Zentrifuge bei 5.000 × g und 4 ° C für 10 min. Dekantieren des Überstandes, Beibehaltung der Stir Bar in der Flasche.
  18. Wiederholen Sie die Schritte 1.16, 1.17 einmal.
  19. Jedes Pellet in 500 mL steril filtriert, 10 % ultrapure Glycerin mit Hilfe der rühren Bars aufzuwirbeln. Wirbeln Sie und vertreiben Sie die gesamte Pellet aus der Flaschenwand alle mehrere Minuten während der magnetischen rühren.
  20. Zentrifugieren Sie und Dekantieren Sie wie in Schritt 1.17. Wiederholen Sie Schritt 1.19 einmal. Verwenden Sie Long-Arm autoklaviert Zange um die Stir Bar entfernen.
  21. Zentrifugieren bei 5.000 × g und 4 ° C für 15 min. Dekantieren des Überstandes und verbliebenen Spuren des Überstands von jeder Flasche Zentrifuge mit einer Pipette zu entfernen.
  22. Eine Flasche 3,0 mL 10 % ultrapure Glycerin hinzufügen und leicht Aufschwemmen der Pellets durch pipettieren. Übertragen Sie die Suspension auf die nächste Flasche und wiederholen Sie, bis alle Pellets sind Nukleinsäuretablette und in einer Flasche kombiniert. Ca. 6 mL hochkonzentrierte Zellen werden mit einem Titer von 3 x 1011 KBE/mL erzielt.
  23. Pre-chill 1,5 mL autoklaviert Mikrozentrifugenröhrchen und einer 96-Well-Rohr Aufbewahrungsbox ohne Trennwände bei-80 ° C für mindestens 1 h vor diesem Schritt. Überweisen Sie vorgekühlt Mikrozentrifugenröhrchen in den kalten Raum auf dem Eis vor pipettieren Aliquote Pellet Zellsuspension. Verwenden Sie eine Pipette zum aliquoten 350 μl Zellsuspension in jeder 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  24. Übertragen Sie die Aliquote in einen Schaum Box gefüllten Behälter mit flüssigem Stickstoff für Blitz einfrieren (3-5 min).
    1. Die Schaum-Box mit flüssigem Stickstoff bis-80 ° C Gefrierschrank zu transportieren (siehe Schritt 1,23).
    2. Entfernen Sie die Aufbewahrungsbox 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch von-80 ° C Gefrierschrank (siehe Schritt 1,23) und auf Eis gelegt.
    3. Verwenden Sie schnell ein Metallgitter, um die Aliquote von flüssigem Stickstoff durch ein Sieb und legen Sie sie in die Röhre-Aufbewahrungsbox. Shop bei-80 ° C.
      Achtung: Flüssiger Stickstoff kann zu Verbrennungen führen und muss darauf geachtet werden, für Sicherheitsschutz. Verwenden Sie ein Fab Rückgrat Phagemid, um die Effizienz der vorbereiteten Elektro-kompetente Zellen prüfen (Fab Rückgrat Phagemid Lager sollte in Reinstwasser (MilliQ) bei 400 ng/µL). 1 μg des Fab Rückgrat Phagemid 10 µL Reinstwasser und eine 350 μL Aliquote des Elektro-kompetente SS320 auf Eis Auftauen, und prechill ein Abstand 0,2 cm Elektroporation Küvette auf Eis.
  25. Die 350 μL Elektro-kompetente SS320 Zellen an die 10 µL DNA nach dem Auftauen und mischen durch pipettieren mehrmals unter Beibehaltung der Mischungen auf Eis. Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
  26. Wärmen Sie 15 mL SOC Medium in ein 50-mL-Tube im Wasserbad 37 ° C für mindestens 30 min vor der Elektroporation vor. Übertragen Sie die 360 μl-Mischung auf die Küvette und durchführen Sie Elektroporation nach den Anweisungen des Herstellers.
  27. Sofort retten Sie die Zellen nach Electroporation durch Hinzufügen von 1 mL vorgewärmten SOC-Medium (aus Schritt 1,27) und pipettieren. Übertragen Sie das Medium aus der Küvette auf eine 125-mL-Flasche vorbelastet mit 5 mL vorgewärmten Soc.
  28. Spülen Sie die Küvette zweimal, jeweils mit 1 mL vorgewärmten SOC-Medium und Medium zu übertragen, um die 125-mL-Flasche (siehe Schritt 1,27). Fügen Sie vorgewärmt SOC-Medium zu einem Endvolumen von 10 mL bis 125-mL-Flasche.
  29. Inkubieren Sie die 10-mL-Zellkultur für 30 min bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min.
  30. Stellen Sie Verdünnungsreihen, Transfektion Effizienz und M13KO7 Pre-Infektionsrate zu bestimmen.
    1. Verwenden Sie eine Multi-Kanal-Pipette, 180 μL 2YT Medien in jede Vertiefung einer einzelnen Spalte einer 96 Microwell-Platte hinzuzufügen.
    2. Machen 8 verzehnfacht serielle Verdünnungen: 20 μL der Kultur von 1,29 Schritt zu dem ersten Brunnen der Platte, die Mischung von pipettieren, und übertragen 20 μL der Mischung zum nächsten gut. Wiederholen Sie diesen Schritt bis zum Ende der serielle Verdünnung.
    3. Platte 10 μL jeder serielle Verdünnung auf den LB/Carb, LB/kan und LB/Tet Platten in zweifacher Ausfertigung.
    4. Über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    5. Effizienz-Berechnungsformel: davon ausgehen, dass M die durchschnittliche Kolonie Anzahl gezählt von der verdünnte Falte 10N (N ist von 1-8). Die E. Coli SS320 Elektro-kompetente Transfektion Zelleffizienz von Fab Rückgrat Phagemid von LB/Carb Platte ist gleich 10 M XN + 3 KBE/µg. Die M13KO7 Pre-Infektionsrate wird aus dem Verhältnis der Kolonien in LB/kan und LB/Tet geschätzt. Der Anteil der E. Coli SS320 zuständigen Zellen mit Fab Rückgrat Phagemid transfiziert wird aus dem Verhältnis der Kolonien in LB/Carb und LB/kan geschätzt.

2. Vorbereitung von Uracil-haltigen SsDNA (dU-SsDNA) aus der Phagemid Vorlage

Hinweis: A berichtete zuvor, dass Fab Rückgrat Phagemid diente als Vorlage für dU-SsDNA Vorbereitung15. Die Architektur des Fab Rückgrat Phagemid ist in Abbildung 2dargestellt. Eine Plasmid-Spin-Kit (QIAprep Spin M13) dient zur Gewinnung von dU-SsDNA mit geringfügigen Änderungen.

  1. Vorwärmen einer LB/Cmp-Platte (vorbereitet und gespeicherte bei 4 ° C für weniger als 1 Woche alt) in einem Inkubator 37 ° C für 1 h Streifen aus einem Glycerin bestand von E. Coli CJ236 Zellen (oder eine andere Dut−/Ung− Belastung) mit sterilen Schleifen oder Tipps auf den vorgewärmten Teller LB/Cmp. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C über Nacht für ca. 12-15 h.
  2. Wählen Sie eine einzelne Kolonie mit einer sterilen Spitze und in 2 mL 2YT/Cmp Medium in einem 14-mL Polypropylen Rundboden Röhrchen zu impfen.
  3. Inkubieren Sie das Medium bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für 3-4 h bis OD600 bei rund 0,4-0,8 (Phase Vergrößerung) erreicht ist.
  4. 5-10 μL Phagen Fab Rückgrat Vorlage hinzufügen, in die Kultur und Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für 30 min Phagen Infektion zu ermöglichen.
  5. Verwenden Sie nach der Inkubation eine sterile Spitze zu Streifen, 10 μL der Kultur auf einem vorgewärmten Teller LB/Carb bei 37 ° C. Inkubation bei 37 ° C über Nacht für ca. 12-15 h.
  6. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von E. Coli CJ236 enthaltenden Fab Rückgrat Phagemid impfen eine Starterkultur von 3 mL 2YT/Carb/Cmp in einem 14-mL Polypropylen Rundboden Röhrchen, und bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für ca. 12 h über Nacht wachsen.
  7. Impfen Sie die 0,3 mL Starterkultur in 30 mL 2YT/Carb/Cmp in einer verblüfft 250-mL-Flasche.
  8. Inkubieren Sie die Zellkultur bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für 3-4 h bis OD600 bei rund 0,4-0,8 (Phase Vergrößerung) erreicht ist.
  9. Fügen Sie die M13KO7 (Lab Lager, Titer von ca. 1 x 1013 KBE/mL) auf die Kultur von Schritt 2.8 mit einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von ca. 10 und die endgültige Titer von M13KO7 ist ca. 1 x 1010 KBE/mL.
  10. Bei 200 u/min und 37 ° C für 1 h inkubieren.
  11. Pellet-die Kultur durch Zentrifugieren in einem 50 mL Rundboden Röhrchen bei 5.000 × g und 25 ° C für 20 Minuten.
  12. Überstand abgießen und das Pellet mit 30 mL frische 2YT/Carb/kan/Uridin aufzuwirbeln. Übertragen Sie die Wiederfreisetzung in eine neue verblüfft 250-mL-Flasche.
  13. Bei 200 u/min und 25 ° C für 22-24 h inkubieren.
  14. Übertragen Sie die Kultur von Schritt 2.13 in ein 50 mL Rundboden Röhrchen und Zentrifugieren der Kultur bei 12.000 × g für 20 min um die Phagen überstand von Bakterienzelle Pellet zu trennen. Übertragen Sie die Phagen überstand in ein neues 50 mL Rundboden Röhrchen geben und 1/5 der letzte Band der PEG/NaCl-Lösung, die Phagen auszufällen. Mischen Sie gut und inkubieren Sie für 30 min, überstürzen sich die Phagen Partikel auf Eis.
  15. Zentrifuge bei 12.000 × g und 4 ° C für 30 min. Dekantieren des Überstandes und Zentrifuge bei 4.000 × g und 4 ° C für 2 min. Aspirieren den restlichen überstand.
  16. Das Phagen-Pellet in 2 mL steril gefiltert 1 X PBS und Übertragung auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aufzuwirbeln. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 5 min in einem Benchtop Microcentrifuge alle übrigen bakteriellen Ablagerungen zu entfernen und die Phagen überstand auf neue 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und speichern bei 4 ° c
  17. Prüfen Sie Uracil Einbindung in E. Coli CJ236 durch Gegenüberstellung mit E. Coli SS320.
    1. Geben Sie 180 μL 2YT Medien in jeweils einer einzelnen Zeile einer 96-Well-Platte.
    2. Machen zehn 10-fach serielle Verdünnungen: 20 μL der Phagen überstand zum ersten Brunnen der Platte zu übertragen, durch pipettieren mischen und 20 μL der Mischung gut zur nächsten zu übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt bis zum Ende der serielle Verdünnung.
    3. Fügen Sie 10 μL des Phagen aus letzten acht Verdünnungsreihen, 90 μL der E. Coli CJ236 und E. Coli SS320 in Log-Phase zu infizieren (OD600 = 0,4-0,8). Inkubation bei 37 ° C für 30 min mit sanft schütteln.
    4. Platte 10 μL aus die serielle Verdünnung der jede Infektion in E. Coli CJ236 und E. Coli SS320 auf 2YT/Carb Platten in zweifacher Ausfertigung.
    5. Über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    6. Titer Berechnungsformel: davon ausgehen, dass M die durchschnittliche Kolonie Anzahl gezählt von der verdünnte Falte 10N (N ist von 1 bis 10). Der Titer von E. Coli CJ236 oder E. Coli SS320 entspricht 10 M XN + 2 KBE/mL. Schätzen Sie die Effizienz von Uracil-Aufnahme aus dem Titer-Verhältnis von E. Coli CJ236 und E. Coli SS320.
  18. Volumen Sie 1/100 des Phagen Niederschlag Puffers MP in der Phagen überstand in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie Kopf vorsichtig, um mehrmals zu mischen. Mindestens 2 min. Phagen Partikel aus dem Kulturmedium ausgefällt werden bei RT inkubieren, und daher sollte eine trübe Lösung an dieser Stelle sichtbar sein.
  19. Die Probe aus Schritt 2.18 auf ein Plasmid-Spin-Spalte (z. B.QIAprep) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch anwenden. Die Bindungskapazität von einem Dreh-Spalte für SsDNA erreichen mindestens 10 µg. Zentrifuge bei 6.000 × g und 25 ° C für 30 s in einem Benchtop Microcentrifuge. Entsorgen Sie den Durchfluss in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Phagen Partikel bleiben in diesem Stadium auf die Spalte Matrix gebunden.
  20. Die Spalte 0,7 mL der UT-MLB-Phagen-Lyse und Bindung Puffer (siehe Diskussion) hinzufügen und mindestens 1 min bei RT inkubieren.  Zentrifugieren Sie bei 6.000 x g und 25 ° C für 30 s und entsorgen der durchströmten.
  21. Fügen Sie eine weitere 0,7 mL des Puffers UT-MLB und mindestens 1 min bei RT inkubieren.
  22. Zentrifugieren Sie bei 6.000 × g 30 S. verwerfen der durchströmten. In diesem Stadium ist die Phagen-Hüllprotein von dU-SsDNA, getrennt, die an der Spalte Matrix gebunden bleibt.
  23. Fügen Sie 0,7 mL waschen Puffer PE mit Ethanol nach den Anweisungen des Herstellers. Zentrifugieren Sie bei 6.000 × g für 30 s und entsorgen der durchströmten.
  24. Wiederholen Sie Schritt 2.23, dann nochmals Zentrifugieren bei 6.000 × g für 30 s, verbleibende Puffer PE zu entfernen.
  25. Übertragen Sie die Spalte zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch geben Sie und 100 μL der Elution Puffer EB (10 mM Tris· CL, pH 8,5) in die Mitte der Spalte Membran.
  26. Inkubation bei RT für 10 min und Zentrifuge bei 6.000 × g für 1 min zum dU-SsDNA eluieren. Rund, erhalten Sie 1,5-2,5 μg dU-SsDNA/mL Kultur.
  27. Analysieren der eluierten DNS electrophoresing 1 μl auf ein 1 % Agarose gel-TAE. Die DNA sollte als ein überwiegend single-Band kein Verschmieren angezeigt werden.
  28. Die DNA-Konzentration zu bestimmen, durch Messung der Extinktion auf einem Spektralphotometer Nanodrop bei 260 nm (ein260 = 1,0 für 33 ng/μl SsDNA). Typisch dU SsDNA Konzentrationen sind innerhalb von 200-500 ng/μl.

(3) Kunkels Methode basiert Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese

Hinweise: Es ist ratsam, kleine Reaktionen vor Vollausschlag Reaktionen um die Qualität der mutagenen Oligonukleotid und Reaktion führen. Eine Karikatur von Kunkels Methode basiert directed Oligonukleotid-Mutagenesis in Abbildung 3dargestellt ist. Verschiedenen Aminosäure Unterschiede sind in CDRH1, CDRH2, CDRH3 und CDRL3 Regionen mit IMGT Nummerierung Nomenklatur16 (Tabelle 2) eingeführt. Die theoretische Aminosäure Vielfalt der einzelnen CDR, total theoretische Aminosäure Vielfalt und Oligonukleotid-Sequenzen sind in Tabelle 2aufgeführt.

  1. Oligonukleotid Phosphorylierung mit T4-Polynukleotid-kinase
    1. 0.6 μg Mutagene Oligonukleotide, entworfen, um eine einzelne CDR mit 2 μl 10 X TM-Puffer, 2 μl 10 mM ATP und 1 μl 100 mM DTT mutieren zu kombinieren. Einem Gesamtvolumen von 18 μl in einem 1,5-mL-Tube ultrapure H2O hinzufügen. Für den Bibliotheksbau sind 4 separate und parallele Phosphorylierung Reaktionen richten Sie entsprechend CDRH1, CDRH2, CDRH3 und CDRL3.
    2. Fügen Sie 20 U (2 uL) der T4-Polynukleotid-Kinase zu jedem Rohr und inkubieren Sie für 1 h bei 37 ° C (Reaktion 1 in Tabelle 3). Einsatz sofort zum Glühen.
  2. Glühen von der Oligonukleotide an der Vorlage
    1. 20 μg dU SsDNA Vorlage fügen Sie 25 μl 10 X TM-Puffer, 20 μL jeder phosphorylierten Oligonukleotid-Lösung und hochreinen H2O zu einem Endvolumen von 250 μl in einem 0,5 mL Röhrchen hinzu. Gut mischen und als Reaktion 2 in Tabelle 3in 0,20 mL PCR Tubes (50 μL) übertragen. Diese DNA-Mengen bieten eine molare Verhältnis von 3:1 zwischen Oligonukleotid und Vorlage, vorausgesetzt, dass das Längenverhältnis Oligonukleotid und Vorlage 1: 100.
    2. Die Reaktion in einer PCR-Maschine bei 90 ° C für 3 min, 50 ° C für 3 min inkubieren und 20 ° C für 5 Minuten.
  3. Enzymatische Synthese der CCC-dsDNA
    1. Die 250 μL geglüht Oligonukleotid/Vorlage Mischung fügen Sie 10 μl 10 mm ATP, 10 μl 25 mM dNTP-Mix, 15 μl 100 mm DTT, 30 Weiss Einheiten T4 DNA-Ligase und 30 U T7 DNA-Polymerase als Reaktion 3 in Tabelle 3 hinzu.
    2. Inkubieren Sie die Reaktion in der 1,5-mL-Tube bei 20 ° C über Nacht.
    3. Waschen Sie und konzentrieren Sie die synthetisierte CCC-DsDNA in einem 0,5 mL zentrifugale Filter-Gerät mit einer 30 kDa Pore Größe Membran bei RT
      1. 400 µL Endvolumen ultrapure H2O hinzufügen und über Nacht Reaktionsgemisch auf das Filter-Gerät übertragen. Drehen Sie mit 14.000 × g für 10 min.; das Volumen beträgt weniger als 50 μL.
      2. Verwerfen der Durchströmung, 400 µL des hochreinen H2O in den Filter hinzufügen und mit 14.000 × g für 10 min. drehen.
      3. Wiederholen Sie Schritt 3.3.3.2 einmal mehr.
      4. Legen Sie den Filter umgedreht in einem sauberen Microcentrifuge Schlauch CCC-DsDNA wiederherstellen. Schleudern Sie bei 1000 × g für 2 min; Das wiederhergestellte Volumen beträgt normalerweise rund 20-40 μL. Die wiederhergestellten CCC-DsDNA kann sofort für Elektroporation von E. Coli verwendet oder bei-20 ° C für eine spätere Verwendung eingefroren. CCC-DNA erhalten Sie normalerweise 20-40 μg.
    4. Electrophorese 1,0 µL des eluierten reaktionsproduktes neben dU SsDNA Vorlage, um das Ergebnis der Reaktion visualisieren.

4. Electroporation und Berechnung der Größe der Bibliothek

  1. Die gereinigten CCC-DsDNA Chill (20 μg in einem maximalen Volumen von 50 μL) in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und einem Abstand 0,2 cm Elektroporation Küvette auf Eis.
  2. Wärmen Sie 20 mL SOC Medien in ein 50mL Polypropylen konische Zentrifugenröhrchen in 37 ° C Wasserbad mindestens 30 min lang vor.
  3. Tauwetter ein 350 μL aliquoten von Electro-kompetente E. Coli SS320 auf Eis. Hinzufügen der Zellen die DNA und die Mischung gründlich durch pipettieren mehrmals. Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
  4. Übertragen Sie die Mischung auf die Küvette und durchführen Sie Elektroporation nach den Anweisungen des Herstellers. Wenn das BTX ECM-630-Elektroporation-System verwendet wird, sind die entsprechenden Einstellungen beispielsweise 2,5 kV Feldstärke, 125 Ω Widerstand und 50 µF Kapazität.
  5. Sofort zu retten die elektroporiert Zellen durch Hinzufügen von 1 mL vorgewärmten SOC-Medium und in 17 mL SOC Medium in einem 125-mL-Kolben übertragen. Spülen Sie die Küvette zweimal mit 1 mL der SOC-Medium und Übertragung in den gleichen Kolben (Endvolumen beträgt 20 mL).
  6. 30 min bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min inkubieren.
  7. Die Elektroporation Effizienz zu bestimmen.
    1. Jede Vertiefung einer einzelnen Spalte einer 96 Microwell-Platte 180 μL 2YT Medien hinzufügen.
    2. Machen 8 um das Zehnfache serielle Verdünnungen: 20 μL der 20-mL-Kultur auf die erste Bohrung der Platte übertragen, mischen mit pipettieren und 20 μL der Mischung gut zur nächsten zu übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt bis zum Ende der serielle Verdünnung.
    3. Platte 10 μL der einzelnen Verdünnungsreihen auf einer LB/Carb-Platte in doppelter Ausführung. Platte 100 µL verbleibenden aller Verdünnungsreihen auf separaten LB/Carb-Teller für Kolonie Graf Cross-Check. Diese Platten bieten auch einzelne Klone für ELISA und Sequenz-Analyse (siehe Abschnitt 5).
    4. Über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    5. Zählen Sie die Kolonien von 10 μL Duplikate auf dem Teller LB/Carb. Davon ausgehen Sie, dass M der durchschnittliche Kolonie Zahl gezählten auf 10N Falten LB/Carb Platte ist (N ist von 1-8). Die gesamte bibliotheksgröße ist gleich 2 M X 10N + 3 Kolonien.
  8. Aliquot der Kultur vom Schritt 4.6 ebenso in zwei 2-L ratlos Fläschchen, jeweils mit 500 mL 2YT/Carb/kan Medium für Phagen-Bibliothek-Generation.
  9. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min über Nacht für ca. 16 h.
  10. Übertragen Sie die Kultur auf zwei 1-L autoklaviert Zentrifuge Flaschen und Zentrifuge für 30 min bei 12.000 × g bei 4 ° c
  11. Übertragen den überstand zwei neue autoklaviert Zentrifuge 1-L-Flaschen und fügen Sie 1/5 der letzte Band der PEG/NaCl-Lösung, die Phagen auszufällen. Inkubation für 30 min auf Eis.
  12. Zentrifuge für 30 min bei 12.000 × g und 4 ° C. Sorgfältig abgießen Sie den überstand und nicht zu stören des Pellet-Phagen. Für 1 min bei 4.000 x g drehen und Entfernen des restlichen Überstands mit einer Pipette.
  13. Aufschwemmen des Phagen-Pellets mit 20 mL 1 X PBS-Puffer steril filtriert und Übertragung auf eine neue 50-mL-Tube.
  14. Pellet-die Unlösliche Angelegenheit durch Zentrifugieren für 5 min bei 12.000 × g und 4 ° C. Übertragen Sie den überstand auf eine neue 50-mL-Tube.
  15. Die Phagen-Konzentration von Spektralphotometer Messen (OD268 = 1,0 für eine Lösung von 5 X 1012 Phagen/mL).
  16. Passen Sie die Phagen-Konzentration bis 5 X 1012 Phagen/mL in 1 X PBS mit 10 % ultrapure Glycerin.
  17. Aliquoten 1 mL der Lösung Phagen pro 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Die Bibliotheken für Schwenken sofort verwenden oder speichern bei-80 ° C.

(5) Qualitätsbeurteilung von Protein A / L direkte Bindung ELISA-Assay und Sequenzierung

  1. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie 96 einzelne Kolonien auf LB/Carb Teller aus Schritt 4.7.3 in eine 96-tief gut Kultur-Platte mit 800 μl 2YT/Carb in jede Vertiefung aus. 3-4 h bei 37 ° C mit schütteln bei 1.000 u/min OD600 inkubieren = 0,4-0,8.
  2. 100 μl der M13KO7 hinzufügen (1 X 1011 KBE/mL) in jede Vertiefung eines 96-tiefen Kultur gut Platte mit einer Mehrkanal-Pipette. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 1.000 u/min für 1 h.
  3. Fügen Sie 100 μL der 2YT mit 10 X Konzentration von Kanamycin (500 μg/mL) in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette. Über Nacht bei 37 ° C mit schütteln bei 1.000 u/min inkubieren.
  4. 1 µg/mL in 1 X PBS-Protein L auflösen. 3/4 Mantel der Brunnen eine 384-Well hohe Proteinbindung Polystyrol-Platte mit 30 µL/Well die Proteinlösung L. Über Nacht bei 4 ° c inkubieren
  5. Entsorgen Sie die Übernachtung L Beschichtung Proteinlösung aus Schritt 5.4. Fügen Sie 50 µL M-PBST (die blockierende Lösung) aller Brunnen in der 384-Well hohen Proteinbindung Polystyrol-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette. Inkubieren Sie die Platten auf einer Mikrotestplatte Shaker für 1 h bei RT
  6. Spin-down über Nacht Kultur aus Schritt 5.3 in einer Kultur tief 96-Well-Platte bei 3.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Das Bakterium ist im überstand.
  7. Entsorgen Sie die blockierende Lösung aus Schritt 5.5. 3 der Protein L beschichtet Brunnen als dreifacher Ausfertigung und 1 unbeschichteten auch negative Steuerung mit einem Mehrkanal-Pipette fügen Sie 15 μl des M-PBST und 15 μl jeder Phage überstand (Schritt 5.6 hinzu). 1 h unter Schütteln bei 200 u/min bei RT inkubieren.
  8. Die Phagen-Lösung zu verwerfen. Waschen Sie die Platte 6 Mal mit 80 μL der PBST durch eine automatisierte Platte Scheibe.
  9. Jeder Brunnen mit einer Mehrkanal-Pipette 15 μl des M-PBST und 15 μl der Protein A-HRP (1:1, 500 in 1 X PBS verdünnt) hinzu, und 1 h unter Schütteln bei ca. 200 u/min bei RT inkubieren.
  10. Die Protein A-HRP/M-PBST-Lösung zu verwerfen. Waschen Sie die Platte 6 Mal mit 80 μL der PBST.
  11. Fügen Sie TMB-Substrat (30 μl/Well) mit einer Mehrkanal-Pipette hinzu und 2-3 min inkubieren Sie, bis die Farbe entwickelt. Stoppen Sie die Reaktion mit 1,0 M H3PO4 (30 μl/Well).
  12. Lesen Sie die Platten spektralphotometrisch bei 450 nm. Positive Klone sind definiert als diejenigen, die eine durchschnittliche Verhältnis der OD450 Absorption von Protein L-Brunnen, der auch größer als 3,0 M-PBST aufweisen.
  13. Infizieren Sie in einer 96-tiefen, 50 μL der SS320 in 2YT/Tet bei Log-Phase mit 5 μL der gleichen Phagen verwendet für ELISA (Schritt 5.6) für 30 min bei RT
  14. 950 μL der 2YT/Carb in den 96-Tiefe gut aus Schritt 5.13 hinzufügen und über Nacht bei 37 ° C mit schütteln bei 1.000 u/min inkubieren.
  15. Extrahieren Sie die Phagemid DNA durch Mini-Vorbereitung DNA-Extraktion Kit. Verwenden Sie die upstream Primer VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3 ") und VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3") für die Sequenzanalyse, die Bibliothek Sequenz Vielfalt zu schätzen.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nach dem Flussdiagramm der Fab Bibliotheksbau (siehe Abbildung 1), wir vorbereitet M13KO7 Helfer Phagen bereits infiziert E. Coli SS320 Elektro-kompetente Zellen. Die Effizienz dieser Electro-kompetente Zellen wird als 2 X 109 KBE/µg geschätzt, wenn das Fab Phagemid Rückgrat für Bibliotheksbau verwendet wurde (Abbildung 4).

Die Uracil Einbeziehung Ef...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hohe Diversität, Phagen angezeigt Fab Bibliotheken, Qualitätskontrolle zu konstruieren sind Check-Points nötig, um verschiedene Phasen des Bauprozesses, einschließlich die Kompetenz der Elektro-kompetente Zellen, Qualität der Vorlage dU SsDNA, Effizienz der Überwachung CCC-DsDNA Synthese, Titer nach Elektroporation, Fab Falten und Aminosäure-Vielfalt der CDRs durch Sequenzanalyse der Fab-Phagen-Klone.

Hohe Ausbeute und Reinheit des dU-SsDNA ist wichtig für hohe Mutagenese Rate. Nach unserer Er...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren schätzen Dr. Frederic Fellouse aus dem Sidhu Labor für kritische Anmerkungen auf Kunkels beruhende Methode synthetische Fab Phagen Bibliotheksbau. Die Autoren schätzen Frau Alevtina Pavlenco und weiteren Mitgliedern aus dem Sidhu Labor für wertvolle Hilfe von Hochleistungs-Elektro-kompetente Vorbereitung E. Coli Zellen und hochwertige dU-SsDNA. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006), DW und der ShanghaiTech Universität (Grant No.: F-0301-13-005) Labor der Antikörper Technik.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
1,0 M H3PO4FisherAC29570
1,0 M Tris, pH 8,0Invitrogen15568-025
10 mM ATPInvitrogen18330-019
100 mM DithiothreitolFisherBP172
100 mM dNTP Mischen SieGE Healthcare28-4065-60Lösung, die jeweils 25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP enthält.
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)Kirkegaard & Perry Laboratories Inc50-76-02
50X TAEInvitrogen24710030
AgaroseFisherBP160
Carbenicillin, CarbSigmaC1389100 mg/ml in Wasser,   0,22 μ; M Filter-Sterilisieren, Arbeitskonzentration: 100 μ g/ml.
Chloramphenicol, cmpSigmaC0378100 mg/ml in Ethanol, 0,22 μ M Filter-Sterilisieren, Arbeitskonzentration: 10 μ g/ml.
EDTA 0,5 M, pH 8,0InvitrogenAM9620G
Granulierter AgarVWRJ637-500G
H2O2 Peroxidase-SubstratKirkegaard & Perry Laboratories Inc50-65-02
K2HPO4Sigma795488
Kanamycin, kanFisherAC6112950 mg/ml in Wasser,   0,22 μm; M Filter-Sterilisieren, Arbeitskonzentration: 50 μ g/ml.
KH2PO4SigmaP2222
Na2HPO4Sigma94046
NaClAlfa AesarU19C015
NanodropFisherND2000C
NaOHFisherSS256! VORSICHT NaOH verursacht Verbrennungen.
FETTFREIES MilchpulverSangon BiotechA600669
PEG-8000FisherBP233
Protein A-HRP KonjugatInvitrogen101123
QIAprep Spin M13 KitQiagen22704
QIAquick Gel-ExtraktionskitQiagen28706
QIAquick PCR-AufreinigungskitQiagen28104
Rekombinantes Protein LFisher77679
T4 DNA-PolymeraseNew England BiolabsM0203S
T4 PolynukleotidkinaseNew England BiolabsM0201S
T7 DNA-PolymeraseNew England BiolabsM0274S
Tetracyclin, tetSigmaT766050 mg/ml in Wasser, 0. 22 μ M Filter-Sterilisieren, Arbeitskonzentration: 10 μ g/ml.
TryptonFisher0123-07-5
Tween-20SigmaP2287
Ultrareines GlycerinInvitrogen15514-011
UridinSigmaU375025 mg/mL in Ethanol, Arbeitskonzentration: 0,25 μ g/ml.
HefeextraktVWRDF0127-08
NameUnternehmen Katalognummer<>Kommentare
Stämme
E.coli CJ236New England BiolabsE4141Genotyp: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Wird zur Präparation von dU-ssDNA verwendet.
E.coli SS320Lucigen60512Genotyp: [F'proAB+lacIq lacZΔ M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 & Delta; (araABC-leu)7679 Δ lacX74 galUgalK rpsL thi. Optimiert für hocheffiziente Elektroporation und filamentöse Bakteriophagenproduktion.
M13KO7New England BiolabsN0315S
NameUnternehmen KatalognummerKommentare
Ausrüstung
0,2 cm Elektroporationsküvette mit SpaltBTX
96-well 2mL Deep-Well-PlattenFisher278743
96-Well-Maxisorp-ImmunplattenNunc151759
PrallkolbenCorning
TischzentrifugeEppendorf5811000096
ZentrifugenflaschenNalgene
ECM-630 ElektroporatorBTX
Magnetisch RührstäbchenNalgene
Thermo Fisher ZentrifugeFisher
High Speed ShakerTAITEKMBR-034P
Mikrotiterplatten-ShakerQILINBEIERQB-9002
Liquid Handler für 96 und 384 WellsRAININ
Mutil-KanalpipetteRAININE4XLS
Amicon KonzentratorMerckUFC803096

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574(2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492(2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).

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