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Methodenartikel

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

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DOI:

10.3791/57383

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14. Mai 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Boston University School of Medicine, 2Department of Medicine, Section of Hematology and Oncology, Boston University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Live Cell Imaging bietet eine Fülle von Informationen über einzelne Zellen oder ganze Bevölkerungen, die unerreichbar ist von festen Cell imaging allein. Hier werden live-Cell imaging Protokolle Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel bewerten beschrieben.

Zusammenfassung

Live Cell Imaging ist eine kraftvolle Methode, die verwendet werden, um biologische Phänomene in Einzelzellen direkt über längere Zeit zu visualisieren. Im letzten Jahrzehnt haben neue und innovative Technologien die Praktikabilität des live Cell Imaging erheblich verbessert. Zellen können jetzt im Fokus gehalten werden und kontinuierlich über mehrere Tage während gepflegt unter 37 °C und 5 % CO2 Zelle Kulturbedingungen abgebildet. Darüber hinaus können mehrere Sichtfelder aus verschiedenen experimentellen Bedingungen gleichzeitig, wodurch Hochdurchsatz-experimentelle Daten erworben werden. Live Cell Imaging bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber fixiert-Cell Imaging, da für die direkte Visualisierung und zeitliche Quantifizierung der dynamische zelluläre Ereignisse. Live Cell Imaging kann auch Unterschiede im Verhalten einzelner Zellen identifizieren, die sonst verpasst würde mit bevölkerungsbezogenen Assays. Hier beschreiben wir leben-Cell imaging Protokolle, um Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel zu beurteilen. Wir zeigen, dass Methoden, ob mitotically visualisieren Zellen sterben direkt von Mitose oder schlüpfen wieder in Interphase verhaftet. Wir beschreiben auch, wie das fluoreszierende Ubiquitination basierende Zellzyklus-Anzeigesystem (FUCCI) der Bruch der Interphase Zellen von mitotischen Schlupf geboren bewerten, die in der Lage, wieder in den Zellzyklus sind einsetzbar. Schließlich beschreiben wir eine Leben-Zelle bildgebende Methode zur Kernhülle Bruch Ereignisse zu identifizieren.

Einleitung

Anti-mitotische Drogen habe lange in der chemotherapeutischen Therapien verschiedener Arten von soliden Tumoren und zeigen oft große Wirksamkeit1,2,3. Mechanistisch, diese Medikamente stören normalen mitotischen fortschreiten und Förderung der mitotischen Verhaftung in rasch proliferierenden Krebszellen. Schicksal der Zelle als Reaktion auf mitotischen Verhaftung ist jedoch sehr unterschiedlich: während ein Teil der Zellen Absterben von Zellen direkt von Mitose erfährt, andere Mitose verlassen und zurückkehren, um als tetraploide Zellen interphase (ein Prozeß benannt mitotischen Schlupf)4, 5,6,7,8. Diese Interphase Zellen Apoptose führen, ständige Zellzyklus Festnahme zu unterziehen oder sogar erneut eingeben der Zellzyklus4,5,6,7,8,9 ,10,11. Zellen, die mitotische Zelltod zu entziehen, durch Ausrutschen in Interphase, nur für den Zellzyklus, die nach dem Medikament entfernen, erneut eingeben können daher auf das erneute Auftreten von Krebs-Zell-Populationen beitragen. Darüber hinaus Rückfall Zellen, dass Slip von Mitose tetraploiden und tetraploidy bekannt ist, Chromosom Instabilität zu fördern, der Tumor antreibt12,13,14,15. Daher ist es wichtig, aktuelle Therapie zu optimieren, Festlegung der Faktoren, die Zelle Schicksal als Reaktion auf Anti-mitotische medikamentöse Behandlungen zu steuern.

Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um direkt zu beobachten und studieren das Schicksal der Zellen, die längeren mitotischen Verhaftung als Reaktion auf die Anti-mitotische Droge Paclitaxel zu unterziehen. Paclitaxel ist eine etablierte Therapie in der Klinik und hat sich als sehr wirksam in vielen Arten von Tumoren, einschließlich der Brust, der Eierstöcke und der Lunge16,17,18,19, 20. Paclitaxel, die eine Pflanze Alkaloid aus der Rinde der Eibe abgeleitet ist, stabilisiert Mikrotubuli und verhindert so deren Dynamik21,22. Während Dämpfung der Mikrotubuli Dynamik von Paclitaxel Zellzyklus Progression von G1 bis G2, nicht beeinflusst führt das Medikament zu einer nachhaltigen Aktivierung der Spindel Baugruppe Prüfpunkt während der Mitose durch die Behinderung Kinetochor-Mikrotubuli Anlage (rezensiert in der Tiefe hier23,24)25. Infolgedessen ist Anaphase Beginn in Paclitaxel-behandelten Zellen und führt zu einer längeren mitotischen Verhaftung verhindert.

Dieses Protokoll wird zunächst Ansätze zur Identifizierung der mitotischen Zellen in live Cell imaging Experimente beschreiben. Mitose kann in adhärenten Gewebekultur Zellen durch zwei deutliche zellenveränderungen biologische visualisiert werden. Erstens werden Chromosomen unmittelbar vor dem Zusammenbruch der Kernhülle hoch verdichtet. Während oft nachweisbar durch standard Phasenkontrast-Mikroskopie, Chromosom Kondensation deutlicher zu erkennen, dass Leuchtstofflampen mit diesem Label Chromosomen (z.B. eindringmittel beschriftet Histon-Proteine) Stichwörter. Zweite, mitotische Zellen können auch durch die dramatischen morphologische Veränderungen identifiziert werden, die aus Zelle Rundung ergeben.

Dieses Protokoll wird dann zeigen, wie live Cell imaging Ansätze verwenden, um das Schicksal der Zellen erleben längerer mitotischen Verhaftung zu verfolgen. Zellen in Mitose verhaftet durchlaufen eine der drei unterschiedliche Schicksale. Erstens können Zellen Zelltod während der Mitose durchlaufen. Dieses Phänomen wird leicht durch Lichtmikroskopie, visualisiert, wie sterbende Zellen zu schrumpfen, Blase und/oder Bruch eingehalten werden. Zweitens: Zellen können Mitose verlassen und zurück zurück zur ohne Chromosom Segregation oder zytokinese interphase, bezeichnet ein Prozess mitotischen Schlupf. Die enttauung der Chromosomen und/oder die Abflachung der mitotischen Zellen leicht identifiziert dieses Prozesses. Zellen, die von Mitose abrutschen auch oft unregelmäßig, Multi-gelappte Kerne anzeigen und häufig mehrere Mikrokerne5Hafen. Drittens können Zellen in Mitose verhaftet Anaphase zu initiieren und fahren Sie durch Mitose nach einer langen Verzögerung. Während ungewöhnlich bei höheren Konzentrationen des Medikaments, schlägt dieses Verhalten, dass die verhafteten Zellen den Spindel Baugruppe Checkpoint erfüllt haben können oder die Spindel Baugruppe Checkpoint teilweise geschwächt oder defekt ist. Anaphase auftreten kann durch Chromosom Segregation und anschließende zytokinese mit live Cell Imaging sichtbar gemacht werden.

Leben-Zelle Bildgebungsverfahren, das Schicksal der Zellen zu verfolgen, die mitotische Zelltod zu entziehen, durch mitotische Schlupf unterziehen werden auch beschrieben werden. Zellen, die mitotische Schlupf zu unterziehen sterben in der anschließenden Interphase, auslösen eine dauerhaftere G1 Zellzyklus Festnahme oder geben Sie den Zellzyklus um eine neue Runde der Zellteilung4zu initiieren. Ein Ansatz mit FUCCI (fluoreszierende Ubiquitination basierende Zellzyklus) Indikatorensystems der Anteil der Zellen zu bestimmen, die den Zellzyklus mitotischen Schlupf nach Wiedereintritt werden beschrieben. FUCCI ermöglicht die direkte Visualisierung des Übergangs G1/s und kann in Verbindung mit langfristigen live-Cell imaging in Vitro und in Vivo26,27verwendet werden. Das FUCCI System nutzt zwei eindringmittel markierte Proteine, verkürzte Formen des hCdt1 (Chromatin Lizenzierung und DNA-Replikation Faktor 1) und hGeminin, deren Ebenen schwingen basierend auf Zellzyklus Position. hCdt1 (verschmolzen zu einem rot fluoreszierende Protein) ist auf einem hohen Niveau in G1 Phase, wo es um DNA für die Replikation zu lizenzieren wirkt, aber ist Ubiquitinated von der E3-Ubiquitin-Ligase, SCFSkp2 präsentieren und abgebaut, während S/G2/m Phasen, um zu verhindern, dass erneute Replikation von DNA-26. Im Gegensatz dazu hGeminin (verschmolzen zu einem grün fluoreszierendes Protein), ist ein Hemmstoff des hCdt1 dessen Ebenen Gipfel während S/G2/m, aber ist Ubiquitinated von der E3-Ubiquitin-Ligase APCCdh1 und am Ende der Mitose und im gesamten G1 abgebaut 26. infolgedessen FUCCI liefert eine einfache Fluoreszenz Auslesen der Zellzyklus-Phase, wie Zellen rote Fluoreszenz während G1, und grüne Fluoreszenz während S/G2/m aufweisen. Das FUCCI System ist ein wesentlicher Fortschritt gegenüber anderen Ansätzen (z. B. Bromodeoxyuridine Färbung), proliferative Zellen zu identifizieren, weil es keine Zelle Fixierung erfordert und für die einzelne Zelle Bildgebung ohne die Notwendigkeit für zusätzliche erlaubt pharmakologische Behandlungen, Zellpopulationen zu synchronisieren. Obwohl nicht in diesem Protokoll diskutiert, wurden zusätzliche live-Cell-Sensoren auch entwickelt, um Zellzyklus Fortschreiten, einschließlich eines Helikase B Sensors für G128, DNA Ligase-RFP29 und PCDNA-GFP30 Sensoren visualisieren für die S-Phase und die jüngsten FUCCI-4 Sensor erkennt die alle Phasen des Zellzyklus-31.

Schließlich wird ein live-Zelle bildgebendes Verfahren Kernhülle Bruch erkennen beschrieben. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die nukleare Umschläge von Krebszellen instabil und neigen zu platzen, wodurch der Inhalt des Nukleoplasma und Zytoplasma zu vermischen. Dieses Phänomen bezeichnet nukleare Bruch, kann DNA-Schäden und Stimulation der angeborenen Immunantwort32,33,34,35,36,37, fördern. 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. während die zugrunde liegenden Ursachen der nuklearen Bruch unvollständig gekennzeichnet bleiben, es ist bekannt, dass Verformungen im Kernstruktur mit einer erhöhten Inzidenz von nuklearen Bruch42 korrelieren. Ein bekannter Effekt von Paclitaxel Behandlung ist die Generation der auffallend abnorme atomaren Strukturen nach Mitose; als solche wird eine Methode mit Hilfe von live-Cell imaging, um nukleare Bruch zu quantifizieren beschrieben werden, während die Erkundung auch Paclitaxel Behandlung erhöht sich die Häufigkeit der nuklearen Bruch Ereignisse. Nukleare Bruch kann durch die beobachteten Auslaufen eines nuklearen gezielt fluoreszierenden Proteins in das Zytoplasma (z. B. ein Tandem-Dimer Wiederholen des RFP verschmolzen zu einem nuklearen Lokalisierung Signal, TDRFP-NLS) erkannt werden. Diese Leckage ist deutlich sichtbar durch Auge, die einfachen Quantifizierung der Bruch Ereignisse ermöglicht.

Dieses Protokoll erfordert ein Weitfeld Epifluoreszenz-Mikroskop, das mit einem codierten Bühne und Autofokus-Software ausgestattet ist. Die codierte Bühne ermöglicht eine präzise automatische Bewegung zu definierten X / Y-Koordinaten, während Autofokus-Software für die Dauer der bildgebenden Zellen im Fokus behält. Darüber hinaus erfordert dieses Protokoll Ausrüstung weiterhin Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2 befeuchtet Atmosphäre. Dies kann erreicht werden durch umschließen das gesamte Mikroskop innerhalb einer Temperatur und Atmosphäre kontrolliert Gehäuse oder mithilfe Bühne-Top-Boxen, dass lokal verwaltet, Temperatur und Umgebung. In diesem Protokoll verwendeten Phasenkontrast-Ziel ist es ein Plan Fluor 10 X mit einer numerischen Apertur von 0,30. 20 X Ziele sind aber auch ausreichend, um beide abgerundeten mitotischen und abgeflachte Interphase Zellen in eine einzelne Brennebene zu identifizieren. Wenn Phasenkontrast-durchführen kann bildgebende Verfahren (wie in diesem Verfahren beschrieben), die Abdeckung entweder aus Glas oder Kunststoff sein. Wenn differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie verwendet wird, ist es unerlässlich, eine Glasabdeckung verwenden, um zu verhindern, dass die Depolarisation des Lichts.

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Protokoll

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung nicht-transformierten und chromosomal stabilen retinalen pigmentierten epithelialen (RPE-1) Zelllinie für live Cell imaging Experimente. Jedoch kann dieses Protokoll an jedem adhärente Zell-Linie angepasst werden, so lange Zelle Kulturbedingungen nach Bedarf angepasst werden. Alle Verfahren müssen institutionelle Biosafety und ethischen Richtlinien und Vorschriften einhalten.

1. Vorbereitung der Zellen für Live Cell Imaging

  1. Verwenden Sie frisch aufgetaut und frühe Passage RPE-1 Zellen mit dem Ausdruck menschlichen Histon, die H2B verschmolzen zu einem fluoreszierenden Protein (z.B. H2B-GFP) oder das FUCCI-System (ein detailliertes Protokoll zum FUCCI exprimierenden Zellen erzeugen finden Sie im Referenz-45) mitotische Zelle Schicksal zu beurteilen.
    1. Um die Häufigkeit der nuklearen Bruch zu messen, verwenden Sie RPE-1-Zellen H2B-GFP und ein Tandem-Dimer rot fluoreszierenden Proteins verschmolzen zu einem einzigen nuklearen Lokalisierung-Signal (TDRFP-NLS) zum Ausdruck bringt.
      Hinweis: Konstrukte der drei grüne fluoreszierende Proteine verschmolzen im Tandem zu einem einzigen nuklearen Lokalisierung-Signal (GFP3- NLS) wurden auch verwendet, um Bruch (wie in Referenz42) zu demonstrieren.
    2. Pflegen Sie Zellen auf 10 cm Gewebekultur Platten in das entsprechende Wachstumsmedium. RPE-1-Zellen in Phenol rotfrei-, bestehen Dulbeccos Eagle Medium/Nährstoff-Mischung geändert f-12 (DMEM:F12) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 IU/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin ergänzt.
  2. Aspirieren Sie Medium aus den Zellen, waschen Sie das Gewebe Kulturschale mit 10 mL steril, Raumtemperatur Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) verbleibenden Medium zu entfernen, und dann Aspirieren der PBS.
    1. Hinzufügen von 0,25 % 2 mL Trypsin mit Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in die Zellen und Inkubation bei 37 ° C für 3 Minuten oder bis der Großteil der Zellen von der Platte gelöst haben.
      Hinweis: Bewahren Sie Zellen nicht im Trypsin länger als nötig.
  3. Fügen Sie 10 mL der kompletten Medium zu sammeln die trypsiniert Zellen mit einer 10 mL serologische Stripette und in einem 15 mL konische Röhrchen zu verzichten.
    1. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 180 X g für 3 min bei Raumtemperatur.
  4. Aspirieren Sie den überstand, wobei Sie darauf achten, nicht zu stören das Pellet und dann Aufschwemmen Sie gründlich das Pellet in 10 mL frisches Medium durch sanft pipettieren des Mediums nach oben und unten in der serologischen Stripette.
  5. Verwenden Sie eine Hemocytometer oder eine automatisierte Zelle zählen Maschine Zellen46zu zählen.
    1. Verdünnen Sie Zellen in einem neuen konischen Rohr bis 30.000 Zellen/mL des kompletten Medium.
    2. Platte 30.000 RPE-1 Zellen (1 mL Volumen) pro Bohrloch eine 12-Well Glasboden (#1.5 Dicke) imaging Gericht um die nötige zelluläre Dichte am nächsten Tag (30 – 50 % Zusammenfluss) zu erreichen.
      Hinweis: Immer verarbeiten Sie die Platte mit Handschuhen und achten Sie darauf, nicht den Glasboden berühren.
  6. Können Sie Zellen in einem 37 ° C Gewebekultur Inkubator wachsen, bis sie vollständig legen und flach auf die Glasboden-Bildplatte. Während Zellen in weniger als 4 h angefügt werden können, empfiehlt es sich, dass Zellen nicht mit Medikamenten behandelt und bis zum nächsten Tag abgebildet.
  7. Fügen Sie Paclitaxel (aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) auf die gewünschte Endkonzentration im kompletten Medium und Mischung gründlich hinzu.
    1. Bereiten Sie komplette Medium mit ein gleiches Volumen an DMSO allein, als ein Steuerelement zu verwenden.
    2. Drogen- oder DMSO auf 37 ° C vor dem Hinzufügen zur Zellen-haltigem Medium warm. Dadurch wird fokal Drift durch eine plötzliche Temperaturwechsel verhindert.
    3. Fügen Sie 1 mL Paclitaxel oder DMSO allein zu einzelnen Vertiefungen der bildgebenden Schale 12-Well-haltigem Medium.

2. Einrichten der Mikroskop für Live Cell Imaging

  1. Reinigen Sie den Glasboden der bildgebenden Schale mit optischen Reiniger entfernen alle Fingerabdrücke oder Staub, die Bildgebung stören können. Verwenden Sie ausreichend optischen Reiniger zu die gesamten Glasfläche benetzen.
  2. Die Glasboden Form auf den Mikroskoptisch in den bildgebenden Dish-Adapter, die Kunststoffabdeckung aus der Schale, und bedecken Sie die Schüssel mit einer Glasplatte Kammer. Sicherstellen Sie, dass die Kammer hat ein Ventil, um einen stetigen Luftstrom bestehend aus 5 % CO2zu ermöglichen.
    Hinweis: Um die 5 % CO2befeuchten, fließt das Gas durch Schläuche in ein steriles Wasser-Bad-Gehäuse eingesetzt. Dies ermöglicht das Gas bis zu 95 % Luftfeuchtigkeit equilibriert geworden.
  3. Einleitung/Kalibrieren der codierten Bühne mit dem Softwareprogramm das Mikroskop zu kontrollieren. Dies sorgt für genaue X / Y-Koordinaten und fokale Drift verhindern.
  4. Konzentrieren Sie sich auf die Zellen mittels Phasenkontrast-Optik und führen Sie Kohler Beleuchtung (in Referenz47ausführlich beschrieben), um das Licht zu konzentrieren und optimalen Kontrast bieten.
  5. Verwenden Sie Software zur Datenerfassung um zu bestimmen, die optimale Belichtungszeiten für weißes Licht und alle fluoreszierenden Kanäle verwendet wird (Aufnahmen, dass geben 75 % Pixel Sättigung auf der Kamera sind ideal, vorausgesetzt, diese Menge an Licht nicht giftig für Zellen).
    1. Datenerfassungs-Software verwenden, um mehrere, wählen nicht überlappende Gesichtsfelder aus jedem Brunnen für die Bildgebung. Wählen Sie Image Regionen wo Zellen haben auch den Glasboden eingehalten und liegen zwischen 50 % und 70 % Zusammenfluss. Vermeiden Sie Bereiche der aufgehäuften Zellen, wie dies die anschließende Analyse erschweren wird.
      Hinweis: Es ist wichtig, nicht überlappende Gesichtsfelder aus jedem Brunnen zu vermeiden, verfolgen die gleichen Zellen zweimal zu haben. Wenn Zellen sehr bewegliche sind, ist es möglicherweise notwendig, mehrere Bilder, die strahlenförmig von einem zentralen Punkt und Heften Sie sie wieder zusammen zu einem großen Sichtfeld zu erwerben.
  6. Aktivieren Sie das Mikroskop Autofokus Funktion um sicherzustellen, dass alle Punkte im Fokus für die Dauer des Experiments beibehalten werden.
  7. Zur Beurteilung der mitotischen Zellen Schicksal gesetzt der imaging-Software zum Sammeln von jedem ausgewählten Sichtfeld Bilder alle 10 Minuten für bis zu 96 h. Unperturbed Mitose dauert 20-40 min, und somit 10 min Abständen werden genug Probenahme zu identifizieren, wenn Zellen sich teilen. Um nukleare Bruch zu identifizieren, die eine vorübergehende Veranstaltung handelt, Abrufen von Bildern alle 5 Minuten.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Computer Bild-Erfassungssoftware fahren Auto-Update, Bildschirmschoner und Energieeinsparung Modi deaktiviert, als diese Bildaufnahme über lange Experimente oft stören können.
  8. Das Image Experiment zu initiieren. In regelmäßigen Abständen bestätigen Sie, dass die Bildaufnahme im Laufe des Videos reibungslos abläuft.

3. video Analyse zur Ermittlung von Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel

  1. Bestätigen Sie, dass die abgebildete Zellen im Laufe des imaging Experiment gesund sind. Lebensfähig und aktiv wuchernden sollten DMSO behandelte Kontrollzellen.
    Hinweis: Wenn Zellen weisen Anzeichen von Stress, nicht das Video quantitate und stattdessen auf die Optimierung der bildgebenden Bedingungen48. Anzeichen von Stress Bildgebung sind Blebbing/sterben Zellen, Zellen, die nicht zu befestigen/Spread auf dem Teller und Zellen, die eine geringe mitotische Index und/oder längerer Mitose zeigen. Mögliche Quellen von Stress sind Schwankungen in der Temperatur oder CO2 -Konzentration im Inneren der bildgebenden Kammer oder Phototoxizität48.
  2. Wenn eine gesamte Sichtfeld mit einem 10 X oder 20 X Objektiv imaging, können Hunderte von einzelnen Zellen vorhanden sein. Deshalb um Quantifizierung zu unterstützen, teilen Sie das Sichtfeld in kleinere Quadranten mit verfügbaren Software-Tools. Punkten Sie Zellen in jedem Quadranten separat (siehe Schritte 3.3.1–3.6.2).
  3. Bei der Analyse der des Videos verfolgen Sie jede Zelle in eine zusammengeführte Ansicht mit Phasenkontrast-und/oder fluoreszierende Bilder. Verwenden Sie Software-Analyse-Tools, um die zusammengeführte Ansicht zu erstellen.
    1. Beginnend am Anfang des Videos, identifizieren Sie eine einzigen Interphase Zelle zu und verfolgen Sie ihre Fortschritte durch den Zellzyklus mit Phase-Optik. Um eine einzelne Zelle zu verfolgen, beobachten Sie die Zelle von Frame zu Frame vom Auge. Interphase Zellen aufgrund ihrer abgeflachten Morphologie (als durch Phasenkontrast-bewertet) und ihren Mangel an DNA-Kondensation (wie H2B-GFP bewertet) zu identifizieren (Abb. 1A).
  4. Zellen, die Mitose durch Beobachtung der Zelle Rundung (mit Phasenkontrast-Optik) eingeben zu identifizieren und/oder Chromosom Kondensation (mit H2B-GLP) (Abb. 1A-C). Beide Zellen Rundung und Chromosom Kondensation werden leicht vom Auge visualisiert.
    1. Beschriften Sie die Zeit, wenn die Zelle Mitose betritt. Fahren Sie fort, die Zelle zu verfolgen, bis er seinem Schicksal (Anaphase wie in Schritt 3.5, Zelltod von Mitose wie in Schritt 3.6.1 oder mitotische Schlupf wie in Schritt 3.6.2) erreicht.
  5. Kontrollzellen sollte effizient richten ihre Chromosomen und geben Sie Anaphase innerhalb von 1 h (Abbildung 1). Visualisieren Sie Anaphase durch Phasenkontrast-Optik, wie die Zelle beginnt, in zwei oder durch Visualisierung der polwärts verschieben Chromosomen gekennzeichnet mit H2B-GLP (Abbildung 1A) einklemmen. Beschriften Sie die Zeit, wenn die Zelle Anaphase erfährt.
  6. Im Gegensatz dazu bleiben Zellen mit Paclitaxel behandelt abgerundet mit kondensierten Chromosomen für mehrere Stunden (3-40 h) (Abbildung 1 b-D).
    1. Mitotically verhaftet Zellen, die durchmachen Zelltod zu identifizieren.
      Hinweis: Zellen, die während der Mitose sterben werden durch Phasenkontrast-Mikroskopie visualisiert, wie Zellen auf, schrumpfen und/oder Bruch (Abbildung 1 b). Wenn H2B-GFP imaging, werden auch die Chromosomen während Zelltod fragment.
    2. Identifizieren Sie mitotically verhaftet Zellen, die Zelle Schlupf zu unterziehen.
      Hinweis: Zellen, die mitotische Schlupf zu unterziehen sind durch Phasenkontrast-Mikroskopie, beobachtet, wie sie in Interphase abflachen und decondense Chromosomen ohne Anaphase (Abbildung 1). Zellen, die mitotische Schlupf unterziehen geben Anlass zu großen tetraploide Zellen, die sind oft mehrkernig (Abbildung 1).
  7. Weiter verfolgen Zellen aus der ursprünglichen Sehfeld. Sobald eine ganze Sichtfeld verfolgt wird, eine separate Blickfeld gewonnenen gleich gut bewegen und weiter tracking-Zellen.

4. video Analyse zur Ermittlung von Zelle Schicksal nach mitotischen Schlupf

  1. Zelle Schicksal nach mitotischen Schlupf (wie in Schritt 3.6.2 beschrieben) zu bewerten mit RPE-1-Zellen, die mit dem Ausdruck der FUCCI System. Neben Phasenkontrast-Bildgebung, ist es notwendig, rote Fluoreszenz (indikativ für G-1 -phasig) und grüne (indikativ für S/G2/m) Fluoreszenzbilder zu erwerben).
    1. Verfolgen Sie FUCCI RPE-1-Zellen wie unter Punkt 3.3 bis 3.7 beschrieben.
      1. Um zu bestätigen, dass das FUCCI System ordnungsgemäß funktioniert, überprüfen Sie, ob Kontrolle alternativer Ausdruck der rote und grüne fluoreszierende Proteine entsprechend aus der Analyse der Bilddaten der Leben-Zelle Zellen. Kontrollzellen sollte der Übergang von ausstellenden völlig nuklearen rote Fluoreszenz ausstellen ganz nuklearen grün fluoreszieren während Interphase Zellen Fortschreiten von G-1 , S-Phase. Zellen sollten weiterhin grün fluoreszieren in die Fertigstellung der Mitose ausstellen. Unmittelbar nach der Mitose sollen die Zellen wieder ganz rote Fluoreszenz während der Interphase aufweisen.
        Hinweis: Während Methoden existieren um RFP und GFP-Fluoreszenz-Intensitäten aus dem FUCCI System in einzelne Zellen mit fluoreszierenden Spuren49zu quantifizieren, ist dies oft nicht notwendig, da der Fluoreszenz-Farbwechsel robust und mit dem Auge sichtbar ist.
  2. Identifizieren Sie Zellen in Mitose mit Phasenkontrast-Mikroskopie verhaftet zu und verfolgen Sie bis mitotischen Schlupf zu unterziehen wie in 3.4 und 3.6.2 beschrieben. Zellen, die Rutschen aus Mitose und zurück in Interphase ändert der ausstellenden grün fluoreszieren bei Mitose, rote Fluoreszenz in G1 Phase (Abbildung 2A- C).
    1. Verfolgen Sie diese Zellen mittels Phasenkontrast- und Epifluorescent Bildgebung mit dem Auge beurteilen ihre Zelle Schicksal (Bild 2D) rutschte.
      1. Identifizieren Sie die Zellen, die den Zellzyklus erneut eingeben. Diese Zellen sind gekennzeichnet durch die rot-grün-Änderung der Fluoreszenz-Ausdruck mit dem FUCCI-System, das angibt, G1/s Übergang (Abb. 2A).
      2. Zellen, die G1 Zellzyklus Festnahme unterziehen zu identifizieren. Diese Zellen sind gekennzeichnet durch Ausdruck der rote Fluoreszenz, die weiterhin für > 24 h (Abb. 2 b).
      3. Zellen, die in Interphase sterben zu identifizieren. Diese Zellen werden durch Bruch/Blebbing/schrumpfen mit Phasenkontrast-Bildgebung (Abbildung 2) Zelle identifiziert.

5. video Analyse zur Ermittlung der Häufigkeit der Kernhülle Bruch

  1. Verwenden Sie RPE-1-Zellen, die mit dem Ausdruck H2B-GFP und TDRFP-NLS Kernhülle Bruch zu beurteilen. Erwerben Sie neben Phasenkontrast-Bildgebung, rote Fluoreszenz (TRITC) und grüne (FITC) Fluoreszenzbilder. Abrufen von Bildern alle 5 min um Bruch zu visualisieren.
    Hinweis: Es ist entscheidend für die Zell-Linien zu erzeugen, in denen die TDRFP-NLS effizient in den Zellkern mit minimalen zytoplasmatischen Fluoreszenz importiert wird.
  2. Bildzellen wie unter Punkt 3.3 durch 3.4 beschrieben. Die TDRFP-NLS Fluoreszenzsignal und H2B-GFP sollte während der Interphase Co lokalisieren. Bei der Mitose (als visualisierte von Zelle Rundung mit Phase Optik und/oder Chromosom Kondensation durch H2B-GFP), die Kernhülle brechen und das TDRFP-NLS-Signal wird zytoplasmatisch (Abb. 3A). Nach Mitose wird die Kernhülle wird in den Tochterzellen zu reformieren und die TDRFP-NLS-Signal nukleare.
  3. Live Cell Imaging verfolgen Sie Tochterzellen während der anschließenden Interphase. Identifizieren Sie nukleare Bruch Ereignisse durch die Beobachtung einer transienten Platzen der nuklearen lokalisiert TDRFP-NLS in die umgebenden Zytoplasma. Innerhalb von Minuten die Kernhülle wird repariert und die TDRFP-NLS wird in den Zellkern (Abbildung 3A) relocalized.
    Hinweis: Oft wird der Zellkern-DNA, wie durch H2B-GFP, visualisiert eingesehen werden außerhalb der Bruch-Website als eine kleine Blase herausragen.
  4. Ergebnis der Bruchteil der Kerne, die eine Bruch-Veranstaltung während der Interphase unterzogen werden. Um diesen Anteil zu zählen, die Anzahl der Zellen, die eine Bruch-Veranstaltung über die Gesamtzahl der Zellen verfolgt zu unterziehen.

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Ergebnisse

Mit der oben beschriebenen Protokoll, wurden RPE-1-Zellen, die mit dem Ausdruck H2B-GFP mit einer Anti-mitotische oder Fahrzeug-Steuerung (DMSO) behandelt und analysiert von live Cell Imaging. Analyse ergab, dass 100 % der Kontrollzellen mitotischen RPE-1 Anaphase durchschnittlich 22 min. nach Eingabe von Mitose (Abbildung 1A, 1 D) eingeleitet. Im Gegensatz dazu ausgestellt RPE-1-Zellen mit Paclitaxel behandelt eine tiefgreifende mitotische V...

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Diskussion

Der wichtigste Aspekt der langfristigen live Cell Imaging sichert die Gesundheit der Zellen wird abgebildet. Es ist wichtig, dass die minimale äußere Umwelt Stressoren, wie unwürdigen Bedingungen hinsichtlich Temperatur, Luftfeuchtigkeit und/oder CO2 -Konzentration Zellen ausgesetzt werden. Es ist auch wichtig, lichtbedingten von fluoreszierenden Erregung Beleuchtung zu begrenzen, wie imaging Stress genannt wird, auf die Zelle Verhalten50. Begrenzung der lichtbedingten kann auf vielfält...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

AFB, MAV und NJG möchte Ryan Quinton für Kommentare auf dem Manuskript und Adrian salischen für das TDRFP-NLS-Konstrukt zu danken. AFB und MAV sind NIGMS biomolekularen Pharmakologie Ausbildung Grant 5T32GM008541 finanziert. NJG ist Mitglied der Shamim und Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories und stützt sich auf NIH-Stipendien GM117150 und CA-154531, Karin Grunebaum Foundation, die Smith-Familie-Awards-Programm, Searle Scholars Program und Melanoma Research Alliance.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
phenolrotfrei, DMEM:F12-MediumHycloneSH3027202
10 % fötalem Rinderserum (FBS)Gibco10438026
100 IE/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin.Gibco15070063
PBSGibco10010049
0,25 % Trypsin/EDTAGemini50-753-3104
12-Well-Bildgebungsschüssel mit GlasbodenCellvisP12-1,5H-N
PaclitaxelTSZ ChemRS036
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaNC0215085
Umwelt KammerIn Vivo Scientific
5% CO2AirgasZ03NI7432000201
15 mL konische RöhrchenFisherbrand05-539-12
10 cm Polystyrol-GewebekulturplattenFalcon08772E
10 mL Serologische EinwegpipetteFisherbrand4488
5804R 15 Ampere ZentrifugeEppendorf97007-370
1000 Mikroliter PipetteGilsonPipetman Classic
20 Mikroliter PipetteGilsonPipetman Classic
p1000 PipettenspitzenSharpp1126
p20 PipettenspitzenSharpp1121
RPE-1 ZellenATCCCRL-4000
Inkubator Galaxy 170SEppendorfCO17011005
Pipette BoyIntegra156401
HämazytometerFisher Scientific0267110
Nikon Ti-E-PFS Inverses Mikroskop für die Bildgebung lebender ZellenMicro Video Instruments, Inc.
Prior X-Y Stage System und Weißlicht-LED-BeleuchtungMicro Video Instruments, Inc.500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ mit EncodernMicro Video Instruments, Inc.500-H31XYZE
Andor DigitalkameraMicro Video Instruments, Inc.D10NLC
Nikon NIS Elements AR SoftwareMicro Video Instruments, Inc.
SOLA LED-Beleuchtung fürFluoreszenz-Mikrovideoinstrumente, Inc.SOLA-E
InVivo-Klimakammer mit CO2-DurchflussregelungMicro Video Instruments, Inc.Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Motorisierter Objektivrevolver mit perfektem FokusMicro Video Instruments, Inc.
Ti-C System KondensatorrevolverMicro Video Instruments, Inc.
Ti-C LWD LWD-Objektiveinheit für SystemkondensatorrevolverMicro Video Instruments, Inc.
Te-C LWD Ph1 ModulMicro Video Instruments, Inc.
CFI Plan Fluor DLL 10X Objektiv 0,3 wd 16mmMicro Video Instruments, Inc.
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM ObjektivMicro Video Instruments, Inc.
MEA53100MQS31000MEP59391MEL51000MEL56200MEH41100MRH10101MRH48230

Referenzen

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411(2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724(2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564(2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7 (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101(2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).

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