Synthese von Multi-walled Carbonnanotubes mit Silber-Nanopartikeln und Bewertung ihrer antibakteriellen Aktivitäten und zytotoxische Eigenschaften modifiziert

Zusammenfassung

In dieser Studie wurden antimikrobielle Nanomaterialien durch saure Oxidation von Multiwalled Carbonnanotubes und anschließende reduktive Abscheidung von Silber-Nanopartikeln synthetisiert. Antimikrobielle Aktivität und Zytotoxizität Tests wurden durchgeführt mit Nanomaterialien als vorbereitet.

Zusammenfassung

In dieser Studie wurden mit einer wässrigen Schwefelsäure-Lösung zu einer Sauerstoff-basierte Sachgruppe bilden Multi-walled Carbonnanotubes (MWCNTs) behandelt. Silber MWCNTs wurden von der reduktiven Abscheidung von Silber aus einer wässrigen Lösung von AgNO₃ auf die oxidierte MWCNTs vorbereitet. Die einzigartige Farbe der CNTs war es nicht möglich, auf der minimalen inhibitorischen Konzentration oder mitochondriale Toxizität Assays, die Toxizität und antibakterielle Eigenschaften, zu bewerten, da sie die Assays behinderen würde anzuwenden. Die Hemmung Zone und minimale bakterizide Konzentration für die Ag-MWCNTs wurden gemessen und Live/Dead und Trypan blau-Assays wurden verwendet, um die Toxizität und antibakterielle Eigenschaften zu messen, ohne die Farbe der CNTs zu stören.

Einleitung

Das ultimative Ziel dieser Studie ist zu umweltfreundlichen antibakteriellen Nanomaterialien, die das Wachstum von Bakterien hemmen können diese Form Biofilmen. Diese antibakteriellen Nanomaterialien haben das Potenzial, die Toxizität und Antibiotikum Resistenzprobleme von häufig verwendeten Chemikalien oder Antibiotika chemischer Verbindungen zu überwinden. Ein Biofilm ist eine hydratisierte extrazellulären Polymeren Substanz (EPS), die besteht aus Polysacchariden, Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden^1,2. Biofilme verhindern das Eindringen von Fremdstoffen und helfen Bakterien^3,4kräftig wachsen. Biofilme verursachen Geruch und chronische Infektionskrankheiten^5,6. Methylobacterium Spp., zum Beispiel, wächst durch das Festhalten an Orten, wo immer Wasser vorhanden ist oder ist es schwierig, bakterielle Beseitigung auf einer kontinuierlichen Basis, wie z. B. Klimaanlage Wärmetauscher, Duschräume und medizinische Geräte zu gewährleisten. Diese Arten von Biofilmen auslösen Geruch und chronische Infektionskrankheiten^5,6.

Normalerweise sind Chemikalien oder Antibiotika chemischen Verbindungen verwendet, um das Wachstum von Bakterien hemmen, die Biofilme bilden. Die Entstehung von Antibiotika-resistenten Bakterien und Sicherheitsbedenken in Vivo von Chemikalien fahren die Notwendigkeit zur Entwicklung neuer Materialien, um die Bildung von Biofilmen zu verhindern und das Wachstum von Bakterien hemmen.

In dieser Studie werden antimikrobielle Nanomaterialien synthetisiert, die frei von Antibiotika-Resistenz und Toxizität sind. Silber ist ein bekannter antimikrobieller Wirkstoff, und jüngste Entwicklungen im Bereich der Nanowissenschaften und Nanotechnologie führten zu aktive Forschung in die antimikrobielle Wirkung von Metall-Nanopartikeln^7,8. Jüngste Studien haben berichtet, dass die geringe Größe und hohe Oberflächen-Volumen-Verhältnisses der Nanopartikel erhöhte antibakterielle Aktivität^9,10,11führen.

Die enthaltenen Nanomaterialien kombinieren Silber-Nanopartikel mit erhöhten antimikrobielle Eigenschaften und Kohlenstoff-Nanoröhrchen mit einem hohen Seitenverhältnis, wodurch sich die Fläche pro Volumeneinheit. Die fabrizierten Silber Nanopartikel-Carbon-Nanotube-Composite weist beträchtliche antimikrobielle Eigenschaften und minimale Toxizität für menschlichen und tierischen Zellen. Die synthetischen Prozesse in früheren Studien verwenden gefährlicher Reduktionsmittel wie NaBH₄, Formamid, Dimethylformamid und Hydrazin. Der Prozess ist kompliziert, gefährlich und zeitaufwendig. Das synthetische Verfahren berichtet verwendet hier Ethanol als deutlich weniger gefährlichen Reduktionsmittel.

Die Hemmung Zone und minimale bakterizide Konzentration (MBC) für die Ag-MWCNTs wurden gemessen; Lebenden/Toten und Trypan blau-Assays wurden zur Toxizität und antibakteriellen Eigenschaften zu messen. Minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) und mitochondriale Toxizität (MTT) Assays wurden nicht durch die ungewöhnliche Farbe der Kohlenstoff-Nanoröhren durchgeführt, die mit der Assays gestört haben würde. Zu guter Letzt wurde die minimale Konzentration zu verhindern das Wachstum von Methylobacterium spp. ohne Säugetier-Zellen bestimmt.

Protokoll

1. MWCNT Oxidation

1. 30-50 mg MWCNT in ein 50-mL-Fläschchen zu messen. Fügen Sie langsam 8 mL eines H₂SO₄: Druckaufschluss₃ Lösung (90 % der Ausgangskonzentration, 3:1 Vol/Vol) mit Pipette mit 1 mL Pipettenspitzen.
   Achtung: Dieses Präparat muss in einem chemischen Abzug durchgeführt werden.
   1. Lassen Sie 30 min für die exotherme Reaktion abschließen.
2. Beschallen Sie die Lösung bei 60-80 ° C und 160 W für 1 h bis MWCNT an der Unterseite der Flasche absetzt.
   Vorsicht: Das Wasser-Niveau in der sonikator niedriger als die Spitze des Fläschchens ist, dass Wasser nicht in die Flasche eingeführt werden.
3. Übertragen Sie die Lösung in ein Zentrifugenröhrchen.
   1. Fügen Sie mit einer Mikropipette 30 mL destilliertem Wasser tropfenweise MWCNT-COOH Projektmappe hinzu.
      Achtung: Eine starke exotherme Reaktion tritt während der Zugabe von destilliertem Wasser. Fügen Sie langsam destilliertem Wasser und genügend Zeit für die Kühlung.
4. Zentrifugieren Sie die MWCNT-COOH-Lösung bei 12.000 x g und 15 min bei Raumtemperatur.
   Achtung: Beim Betrieb einer Zentrifuge, sicherzustellen Sie, dass die Zentrifuge ausgeglichen bleibt, indem man ein Rohr mit dem gleichen Gewicht gegenüber dem Probenröhrchen.
5. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und 1 mL PIPETTENSPITZE. 5 mL Ethanol mit einer Pipette und 1 mL PIPETTENSPITZE hinzugeben. Spülen Sie die Wände des Röhrchens mit zusätzlichen pipettiert Ethanol. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 12.000 x g und 15 min bei Raumtemperatur.
   1. PH-Wert des Überstands mit pH-Papier zu bestimmen. Wiederholen Sie waschen und Zentrifugieren, bis der Überstand pH neutral ist.
6. Entfernen Sie alle überstand. Fügen Sie 1 mL destilliertem Wasser auszufällen und MWCNT-COOH in Lösung gleichmäßig zu verteilen. Gefriertrocknen Sie Lösung bei-60 ° C unter Vakuum bis trocken.

2. Silber-Nanopartikel Ablagerung auf MWCNTs

1. 10 mg MWCNT-COOH in einem 50 mL konische Röhrchen und mit 30 mL destilliertem Wasser verdünnen. Beschallen Sie Lösung bei 60 ° C und 160 W für 1 h.
2. 6 mL 0,1 N AgNO₃ in einem 50 mL konische Röhrchen zu platzieren und mit 18 mL destilliertem Wasser verdünnen. Beschallen Sie Lösung bei 60 ° C und 160 W für 1 h.
   Achtung: Fügen Sie AgNO₃ im Verhältnis zur Gesamtmasse des MWCNTs so, dass die Gesamtmasse der Ag 20 % nicht überschreitet.
3. Fügen Sie AgNO₃ Lösung tropfenweise auf die MWCNTs Lösung mit einer Pipette und 1 mL PIPETTENSPITZE beim beschallen der Mischung bei 60 ° C und 160 W. weiter beschallen für 1 h nach dem Hinzufügen der AgNO_{3 hinzu}.
4. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 12.000 x g und 15 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den überstand zu. Zentrifugieren Sie die Lösung und entfernen Sie den überstand zwei weitere Male zu.
5. Die Ag-MWCNTs-Mischung 1 mL destilliertes Wasser hinzu und verteilen Sie den Niederschlag in die Lösung gleichmäßig zu. Fügen Sie 5 mL Ethanol und lassen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur 1 Stunde gehen.
6. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 12.000 x g und 15 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den überstand zu.
7. PH-Wert des Überstands mit pH-Papier zu bestimmen. Wiederholen Sie waschen und Zentrifugieren bis überstand pH neutral ist.
8. Ag-MWCNTs 1 mL destilliertes Wasser hinzu und verteilen Sie gleichmäßig in Lösung. Gefriertrocknen Sie die Lösung bei-70 ° C unter Vakuum für 24 h.

(3) Zone der Hemmung Test

1. Mischen Sie 18,12 g R2A Agar und 1 L destilliertes Wasser in ein Auffanggefäß. Sterilisieren Sie die Mischung in einem Autoklaven bei 121 ° C für 15 Minuten.
2. Lassen Sie Gel bei Raumtemperatur abkühlen. Setzen Sie 10 mL Gel in Petrischalen vor dem Härten, die feste Medium vorzubereiten.
3. Platz 100 µL der Bakterien auf festem Medium. Verteilen Sie die Bakterien auf die festen Medium mit einem Spreader.
   Achtung: Dieses Verfahren muss in einer chemischen Abzugshaube mit einem Alkohol-Lampe beleuchtet durchgeführt werden.
4. Inkubieren Sie die Gerichte bei 30 ° C für 48 h.
5. Mischen Sie 3,12 g R2A Brühe mit 1 L destilliertes Wasser in ein Auffanggefäß. Sterilisieren Sie die Mischung in einem Autoklaven bei 121 ° C für 15 Minuten.
6. Die gewachsenen Kolonien zu einem flüssigen Medium mit einer Schleife und Nadel zu übertragen und in einem Inkubator bei 180 u/min und 30 ° c inkubieren
7. Nehmen Sie den OD (optische Dichte) Wert von UV-Spektrophotometrie bei 600 nm auf Stundenbasis um bakterielles Wachstum zu messen.
   Hinweis: R2A Agar wurde in diesem Test, anstatt die standard Mueller-Hinton-Agar verwendet, weil R2A bevorzugte Nährboden für das Wachstum von Methylobacterium SPP ist.
8. Platz 10 mL der vorbereiteten R2A Nährboden in einer Petrischale ein Bottom-Agar vorzubereiten.
   1. Mischen Sie 3,12 g R2A Brühe und 8 g Agar mit 1 L destilliertem Wasser. Sterilisieren Sie die Mischung in einem Autoklaven bei 121 ° C für 15 min. Platz 10 mL dieses Gels auf der Unterseite-Agar.
9. Laden Sie 50 µL Ag-MWCNTs-Lösung auf sterile papierscheibe mit einer Mikropipette.
   1. Trocknen Sie und Sterilisieren Sie Ag-MWCNTs-Probe in einer Vakuumkammer unter UV-Licht für 30 Minuten.
10. Ort Ag-MWCNTs-Probe auf Agar.
11. Inkubieren Sie die Agarplatte bei 30 ° C für 48 h.
12. Maßnahme-Zone der Hemmung¹².
    Hinweis: Anweisungen für die verwendete Software sind in den Referenzen enthalten.

(4) antibakteriell Test

1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.7 Bakterienkultur vorzubereiten.
2. Impfen Sie bei maximaler OD 100 µL der Bakterien in 3 mL frisches flüssiges Medium mit einer Pipette und 100 µL Mikro PIPETTENSPITZE.
3. Bereiten Sie fünf 50 µL Proben der Kontrolllösung in 15 mL konische Röhrchen. Fügen Sie folgenden jedes Rohr: 1) Methanol; (2) 1000 µg/mL MWCNT-COOH; (3) 50 µg/mL Ag-MWCNTs; (4) 40 µg/mL Ag-MWMWCNTs; (5) 30 µg/mL Ag-MWCNTs.
4. Inkubieren Sie 180 u/min und 30 ° C, bis das Steuerelement maximal aktiv UV Spektrophotometrie bestimmt, wie oben beschrieben ist.
5. Messen Sie die OD-Wert jeder einzelnen Probe und berechnen Sie die MIC-Konzentration. OD-Wert bezieht sich direkt auf die Zahl der bakteriellen Zellen in der Probe-Brühe.
6. Die kultivierten Bakterien auf einem festen Medium mit einem Spreader zu verbreiten.
7. Inkubieren Sie das Gericht bei 30 ° C für 48 h.
8. Anzahl der Bakterienkolonien und KBE Messwerte antibakterielle Aktivität¹²zu bestimmen.
   Hinweis: Anweisungen für die verwendete Software sind in den Referenzen enthalten.

(5) Lebensfähigkeit Assay

1. Nach dem Entfernen der Zellkulturen aus Inkubator, Saug-Medium und dreimal mit einem tropfenweise Waschen von 5 mL PBS waschen.
2. Hinzu kommen 1 mL Trypsin-EDTA mit PBS-Puffer die gewaschenen Zelle und Absaugung nach 1 min.
   1. Tippen Sie auf die Platte, um stecken Zellen zu entfernen.
3. Fügen Sie 5 mL DMEM (Dulbeccos geändert Eagle Medium hinzu) und entfernen Sie dann die Zellen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 200 X g für 3 min und entfernen Sie den überstand zu.
   1. Fügen Sie 1 mL des DPBS und Mix.
   2. Anzahl Zellen in 10 µL der Lösung mit einer automatisierten Zellzählung Maschine.
      Hinweis: Anweisungen für Zellzählung Maschine verwendet, sind in den Referenzen¹³enthalten.
4. Platz 1 × 10⁵ AML12 Zellen pro Bohrloch in einem sechs-Well-Platte mit DMEM Lösung. Das Medium enthält 10 % (V/V) fötalen Rinderserum und 1 % sterile Antibiotikum.
5. Inkubieren Sie Platte für 8-12 h bei 37 ° C in einer Umgebung mit 5 % CO₂95 % Luft.
6. Den überstand von Brunnen mit einer Absauganlage Absaugung.
   1. Fügen Sie jedes Muster bestehend aus 30-40 µg/mL Ag-MWCNT zu 1 mL DMEM, Kontrolle und NMS-DMSO (Dimethyl Sulfoxid hinzu).
   2. Inkubation bei 37 ° C in einer Umgebung 5 % CO₂95 % Luft für 8 h.
7. Überstand und waschen Proben mit 5 mL PBS zu entfernen.
8. 1 mL der vorbereiteten lebenden/Toten Kit (20 µL 2 mM EthD-1 mit 5 µL 4 mM Calcein AM in DMSO in 10 mL PBS) tropfenweise auf die Zelle hinzufügen.
9. Inkubation bei Raumtemperatur für 30-45 min oder 37 ° C für 10 min. Maßnahme Fluoreszenz mit standard Fluoreszenzmikroskopie X 100 oder 300 X.

6. Trypan blau-Assay

1. Proben entsprechend Schritte 5.1 durch 5.6.2 oben vorbereiten.
2. Entfernen Sie überstand.
3. Platte mit 1 mL 1 X DPBS waschen und Dekantieren.
4. Fügen Sie 1 mL Trypsin, Platte und inkubieren Sie für 3 Minuten, die Zellen von Kultur zu lösen. Verwenden Sie Zellkulturmedium Teller waschen und Zellen zu sammeln. Platzzellen Sie gesammelten in eine 15-mL-Tube.
5. Zentrifugieren Sie Rohr bei 200 x g und 4 ° C für 3 min.
6. Verwerfen Sie überstand. Zelle Pellet 1 mL frisches Medium hinzu und verteilen Sie die Zellen neu zu.
7. Fügen Sie 10 µL Trypan blau mit 10 µL verteilten Zellen und zählen Sie die Zellen mit einer automatisierten Zellzählung Maschine.
   Hinweis: Anweisungen für Zellzählung Maschine verwendet, sind in den Referenzen enthalten.

Ergebnisse

Transmission Electron Microscopy (TEM) Bilder bestätigen die Bildung der Ag-MWCNTs (Abb. 1A und 1 b). Ihre gelungene Synthese wurde durch die Veränderung der Oberflächenladung bestätigt. Die Größe der Ag Partikel lagern sich auf der MWCNTs wurde ermittelt (Abbildung 1). Die mittlere Teilchengröße war ca. 3,83 nm. Das XRD-Muster der als synthetisiert Ag-MWCNTs ist in Abbildung 1darge...

Diskussion

Hier berichten wir über eine einfache Methode zur Herstellung von MWCNTs mit hinterlegten Ag Nanopartikel. Diese silberhaltigen Nanomaterial zeigt erhebliche antibakterielle Aktivität und minimalen Potenzial für unkontrollierte Aufnahme von Silber-Nanopartikeln in den Körper. Wir zeigen, dass 30 µg/mL der synthetisierten Ag-MWCNTs ist eine wirksame antibakterielle Aktivität gegen Methylobacterium spp. mit vernachlässigbar Zytotoxizität für Leber Säugerzellen. Obwohl zusätzliche Verbesserungen und biologische Sic...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,1 N Silbernitrat	SIGMA-ALDRICH	1090811000
Kohlenstoff-Nanoröhre, mehrwandig	Tokyo Chemical Industry Co., LTD	308068-56-6
R2A-Agar	MBcell	MB-R1129
R2A-Bouillon	MBcell	MB-R2230
Methylobacterium spp.	KCTC	12618	aus Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit	ThermoFisher SCIENTIFIC	R37601
AML12			von Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC	ATCC	PCS-800-011
TEM	JEOL	JEM-2100F
XRD	Rigaku	D/MAX 2500	Cu K Photonenquelle (40kV, 100mA)
JuLI Br	NanoEnTek	JULI-BRSC