Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

8.3K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/57442

⸱

10. April 2018

 ,  ,  , 
1IVI-RMA New Jersey, 2Jefferson College of Biomedical Sciences, Thomas Jefferson University, 3Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wie die genetischen Varianten, verbunden mit der menschlichen Krankheit beginnen, aufgedeckt zu werden, ist es immer wichtiger, Systeme, um schnell die biologische Bedeutung dieser identifizierten Varianten bewerten zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung der menschlichen Genfunktion während weibliche Meiose ich benutze Maus Eizellen.

Zusammenfassung

Embryonalen Aneuploidie ist die große genetische Ursache der Unfruchtbarkeit beim Menschen. Stammen die meisten dieser Ereignisse während der weibliche Meiose, und wenn auch positiv korreliert mit dem mütterlichen Alter, Alter allein ist nicht immer prädiktiv für das Risiko eines aneuploiden Embryonen zu erzeugen. Daher könnten falsche Chromosom Abtrennung während Oogenese Genvarianten entfallen. Angesichts der Tatsache, dass Zugang zu menschlichen Eizellen für Forschungszwecke beschränkt ist, eine Reihe von Tests wurden entwickelt, um menschliche Gen-Funktion während der Meiose ich benutze Maus Eizellen untersuchen. Erstens sind Boten-RNA (mRNA) des Gens und Genvariante des Interesses in Prophase-verhaftet Maus Eizellen mikroinjiziert. Nachdem Sie Zeit für Ausdruck, Eizellen sind synchron freigesetzt meiotische Reifung Meiose abgeschlossen ich. Durch die Kennzeichnung der mRNA mit einer Abfolge von fluoreszierenden Reporter, wie grün fluoreszierendes Protein (Gfp), kann die Lokalisierung des menschlichen Proteins neben der phänotypischen Veränderungen beurteilt werden. Z. B. Gewinn oder Verlust der Funktion durch die Gründung der experimenteller Bedingungen, die das Genprodukt meiotischen Fehler beheben Herausforderung untersucht werden kann. Obwohl dieses System bei der Untersuchung von menschlichen Proteinfunktion während Oogenese vorteilhaft ist, sollten angemessene Interpretation der Ergebnisse durchgeführt werden, da die Proteinexpression auf endogene Ebenen nicht ist und, sofern nicht für (d.h. klopfte gesteuert heraus oder unten) sind murinen homologe auch im System vorhanden.

Einleitung

Unfruchtbarkeit ist eine Erkrankung, die 10-15 % der menschlichen Bevölkerung der gebärfähigen Alter 1, betroffen, von denen fast die Hälfte medizinische Behandlung 2suchen. Obwohl die Ätiologie der Unfruchtbarkeit vielfältig ist und in vielen Fällen multifaktoriell, die häufigste genetische Anomalie beim Menschen embryonale Aneuploidie 3 ist. Aneuploidie ist definiert als die Abweichung (Gewinn oder Verlust) der die richtige Anzahl an Chromosomen in einer Zelle. Das Phänomen der Aneuploidie in menschlicher Embryonen ist verbreitet und steigt mit dem mütterlichen Alter 4,5. Vier randomisierte kontrollierte Studien haben deutlich gemacht, dass den nutzen nur chromosomal normale (euploide) Embryonen für uterine Übertragung zu wählen, weil diese Strategie führte zu erhöhten Implantation Raten, niedrigere fehl- und eine kürzere Zeit für Schwangerschaft- 6,7,8,9zu erreichen. Daher haben Verständnis der Ätiologie der menschlichen Aneuploidie wichtige Implikationen in der assistierten Reproduktion.

Obwohl vor der Implantation Gentests für Aneuploidien bei unfruchtbarkeitbehandlungen vorteilhaft ist, fehlt noch ein gründliches Verständnis der wie Aneuploidien stammen. Es ist weithin anerkannt, dass es eine positive Korrelation von meiotischen Aneuploidien (entstanden während der Produktion von Gameten) und Alter der Mutter, aber einige Frauen anwesend embryonalen Aneuploidie-Preise, die von den Mittelkurs für ihre bestimmten Alter 4abweichen. Diese Fälle zeigen, dass Alter allein nicht immer prädiktiv für das Risiko eines aneuploiden Embryonen zu erzeugen. Andere Faktoren können eine Rolle bei der Erhöhung des embryonalen Aneuploidie, z. B. Genvarianten spielen.

Ein wesentlicher Aspekt den möglichen Beitrag der eine Genvariante, Aneuploidie während der Eizelle Meiose zu untersuchen ist, ein System für meiotische Genfunktion schnell bewerten zu entwerfen. Aufgrund der ethischen Einschränkungen und begrenzten Zugang ist es unpraktisch, diese Experimente mit menschlichen Eizellen. Diese Probleme können mithilfe der Maus Eizellen umgangen werden, und hier eine Reihe von Tests zu menschlichen Gens Funktion während der Meiose zu beurteilen sind ich beschrieben. Von microinjecting, die Boten-RNA (mRNA) Kodierung für die Genvariante von Interesse, die Lokalisierung des menschlichen Proteins in der Maus Ei visualisiert und verwendet, um festzustellen, ob die ektopische Expression des Wildtyp und mutierten menschlichen Proteins ergibt sich eine phänotypischen Veränderungen, die Aneuploidie führen könnte. Diese Phänotypen gehören eine Erhöhung der Mikrotubuli, die an die falsche Schwester Kinetochor und die Unfähigkeit, Chromosom Ausrichtung auf Metaphase der Meiose I. vor allem zu unterstützen, dieses Protokoll kann verwendet werden, um Gewinn und Verlust der Funktion untersuchen genetische Varianten durch die Festlegung von bestimmter experimenteller Bedingungen wie herausfordern Schlüsselereignisse in Eizelle Meiose Spindel Gebäude und Chromosom Ausrichtung 10.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

(1) molecular Cloning

  1. Full-Length kodierende Sequenz des Gens von Interesse erhalten und die Plasmid in Vitro Transkription (pIVT) Vektor-11.
    Hinweis: In voller Länge cDNA Clones sind von verschiedenen Herstellern im Handel erhältlich oder können über reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) generiert werden. Das National Center for Biotechnology Information (NCBI) Online-Ressource bietet Transkript Sequenzen für Gene aus der Nucleotide und ausgedrückt Sequenz markiert (EST) Datenbanken. Zur Erleichterung des Proteins können Visualisierung und Analyse von Ausdruck Niveaus, Fusion, grün fluoreszierendes Protein (Gfp) oder eine andere geeignete fluoreszierende Tag in der Klonen Strategie erwünscht sein.
  2. Mittels einer validierten Klonen Strategie legen Sie die kodierende Sequenz des Gens von Interesse in mehreren Klonen und Umgebung pIVT. Eine detaillierte Beschreibung der molekularen Klonen und die erforderlichen Schritte wurden zuvor beschriebenen 12.
    Hinweis: Wenn ein Gen-Fusion Produkt generiert werden, sicher sein, dass das Klonen ist in den richtigen Leseraster.
  3. Sequenz das Konstrukt mit Globin Primer um sicherzustellen korrekte gen einsetzen, richtige in-Frame Fusion und keine Polymerase-induzierte Punktmutationen entstanden.
    Hinweis: Wenn DNA Sanger-Sequenzierung Ausrüstung nicht verfügbar ist, bieten viele Unternehmen kostengünstige Optionen der DNA-Sequenzierung.
  4. Mutagenize DNA, wenn Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) oder Einfügungen/Löschungen (INDELS) zu generieren. DNA-Mutagenese wird in Schritte 1.5-1.7 unten beschrieben. Wildtyp Konstrukte fahren Sie fort mit der Linearisierung Schritt 1,7.
  5. Design-Mutagenese Primer und vervollständigen die Mutagenese-PCR-Reaktion um mutierte Konstrukt pro des Herstellers Protokoll zu generieren. PCR-vermittelten Site-verwiesene Mutagenese wurde zuvor beschriebenen 13. Darüber hinaus bieten viele Unternehmen Site-verwiesene Mutagenese-Kits die Protokolle enthalten.
  6. Verwandeln Sie mutagenisierter DNA in bakterielle Host. Isolieren und Plasmid zu reinigen.
    Hinweis: Viele Unternehmen stellen Kits, die lässt sich leicht isolieren und reinigen Plasmid DNA. Folgen Sie Hersteller-Protokoll entsprechend. Wenn ein gramnegatives Bakterienstamm wie E. Coliverwenden, empfiehlt es sich, ein Kit zu verwenden, die Endotoxine entfernt.
  7. Die isolierte DNA aus bakteriellen transformanten verwenden standard Sanger-Sequenzierung zur Bestätigung der Einführung des gewünschten SNP oder INDEL-Sequenz.
  8. Linearisieren Sie Endprodukte mit einzelnen Beschränkung Enzym Verdauung der gereinigte DNA.
    Hinweis: Der pIVT Vektor enthält mehrere Single-Enzym schneiden in der Plasmid-Karte auf Addgene 14aufgeführten Websites.
  9. Stellen Sie sicher, dass das Produkt linear über Agarose-Gelelektrophorese. Die Methodik für die Agarose-Gelelektrophorese wurde zuvor definierten 14.
    Hinweis: Für alle verbleibenden Schritte verwenden Sie Barriere (Filter) pipettieren Tipps und RNase-freie Materialien zur Herstellung von stabilen, hochwertigen RNA zu gewährleisten.
  10. Reinigen Sie das verdaute Produkt mit einem validierten DNA-Aufräum Protokoll oder Kit und eluieren in 30 µL RNase/DNase-freies Wasser.
    Hinweis: Silica-Matrix Spin spaltenbasierten Kits sind empfehlenswert für qualitativ hochwertige, gereinigte DNA. Folgen Sie Hersteller-Protokoll entsprechend.
  11. In-vitro- Transkription DNA mit Hilfe T7-Polymerase nach Protokoll des Herstellers.
  12. Reinigen Sie und eluieren Sie RNA in 30 µL RNase/DNase freies Wasser mit einem Silica-Matrix Spin spaltenbasierten Nukleinsäure Reinigung Kit nach der Hersteller-Protokolls.
  13. Führen Sie denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese mit Formaldehyd, um die endgültige Größe der RNA-Produkt zu bestätigen. Finden Sie unter Schritte 1.13-1.22 unter 14. (Abbildung 1).
  14. Bereiten Sie Gel durch Erhitzen 1 g Agarose in 72 mL Wasser aufgelöst, dann auf 60 ° c abkühlen lassen
  15. Bereiten Sie 10 X MOPS laufen Puffer durch Zugabe von 0,4 M MOPS (pH 7,0), 0,1 M Natriumacetat und 0,01 M EDTA vor.
  16. Zugeben Sie 10 mL 10 X MOPS laufen Puffer und 18 mL 37 % Formaldehyd (12,3 M) bis zur gekühlten Agarose-Lösung.
  17. Kaste das Gel durch die Agarose-Lösung in einem gelbildenden Behälter gießen. Verwenden Sie einen Kamm groß genug für 10 µL. Nachdem Gel gesetzt hat und fest im Griff ist haben, entfernen Sie vorsichtig den Kamm.
  18. Montieren Sie das Gel in der Elektrophorese-Tank, und fügen Sie genug 1 X MOPS laufen Puffer, sicherzustellen, dass das Gel vollständig bedeckt ist.
  19. Bereiten Sie RNA-Probe durch Zugabe von 1 µg RNA bis 0,5 X Datenmengen formaldehydhaltigen laden Farbstoff vor.
  20. RNA-Lösung mit einer Konzentration von 10 µg/mL Interkalation Bromid hinzufügen.
  21. Denaturieren Sie RNA Beispiellösung bei 70 ° C für 5 Minuten.
  22. Verwendung von sterilen, 10 µL Filterspitzen, laden 5 µL Molekulargewicht Marker und 5 µL RNA Probe(n) in separaten Vertiefungen des Gels und electrophorese mit 5 V/cm, bis der Farbstoff mindestens zwei Drittel der Länge des Gels migriert hat.
  23. Visualisieren Sie die RNA in das Gel auf eine UV-Trans-Hilfslicht. Sicherstellen Sie, dass die RNA die richtige Größe hat, durch den Vergleich mit dem Molekulargewicht Marker.
  24. Zur Messung der Konzentration und Reinheit der RNA übertragen Sie 1,2 µL gereinigten RNA mit sterilen 10 µL-Filter-Tips auf einem UV-Spektrophotometer.
    Beachten Sie, dass hochwertige RNA Extinktion Verhältnisse der A260/280 (1,8-2,2) und 260/230 haben sollte (> 1,7) beziehungsweise.
  25. Verwenden 10 µL Filterspitzen, aliquoten die restlichen gereinigte RNA in sterile 0,5 µL Zentrifuge Röhren (3-5 µL/Rohr). Röhren bei-80 ° C bis bereit für die Mikroinjektion zu speichern.
    Hinweis: Eine Konzentration der letzten Injektion von 500 ng/µL ist ein optimaler Ausgangspunkt. Es wird empfohlen, die RNA verdünnen 1:2 in RNase H20 vor der Mikroinjektion zu verringern Klebrigkeit der RNA in Mikroinjektion Pipette frei.

(2) Kinetochor-Mikrotubuli Anlage Assay

  1. Unterteilen Sie Eizellen in gleich große Gruppen für die Mikroinjektion.
    Hinweis: Eizellenentnahme, Transfer, Mikroinjektion und meiotischen Reifung hat in Jupiter ausführlich beschrieben wurden bisher 15.
  2. Microinject, eine Gruppe mit experimentellen mRNA und die anderen Gruppen mit dem WT-Kontrolle und PBS oder Gfp mRNA.
    Hinweis: 500 ng/µL ist die empfohlene Injektion Konzentration mit 10beginnen. Ein Picoinjector kann zur Injektion Beträge zu kontrollieren. Ein Injektionsvolumen von 5-10 pL wird 15empfohlen.
  3. Mit einer Hand oder Mund betriebenen pipettieren Apparat, wo das Glas pipette Öffnung, leicht ist im Embryo Qualität Mineralöl größer als der Durchmesser einer Eizelle (100-150 µm), Transfer Eizellen zu einem 100 µL Tropfen Milrinone-freien Kulturmedium in einer Petrischale abgedeckt und inkubieren Sie Eizellen für 7 h bei 37 ° C in 5 % C02 ermöglichen ausreichende Reifung zur Metaphase der Meiose ich (ich traf) 15.
  4. Nach der Inkubation mit derselben Pipette Apparatur wie oben beschrieben, Eizellen in der Mitte gut Orgel Kulturschale mit 700 µL vorgekühlt minimale wesentlichen Medien (MEM) Sammlung Medium in der Mitte gut und 500 µL H20 in den äußeren Ring zu übertragen und Legen Sie Gericht für 7 min auf Eis.
    Hinweis: Es wird empfohlen, vorab chill MEM Media und Mitte gut Orgel Kultur Gerichte bei-20 ° C für mindestens 20 Minuten vor der Behandlung der Eizellen.
  5. Befestigen Sie die Eizellen übertragen sie mit Hilfe der Pipette Apparat in einen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL 2 % Paraformaldehyd in 1 X PBS für 20 min bei Raumtemperatur.
  6. Mit gleichen pipette Apparat, übertragen die Eizellen in einem anderen Brunnen auf einem Fleck Teller mit 400 µL blocking Lösung (PBS + 0,3 % BSA + 0,01 % Tween-20 + 0,02 % NaN3) und Store bei 4 ° C bis bereit für Immunostaining verarbeiten.
    Hinweis: zum Speichern von Eizellen bei 4 ° C, Deckel Glasplatte vor Ort mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern.
  7. Mit derselben Pipette Apparatur, Transfer Eizellen zu einem neuen Brunnen an einem Ort Platte mit 400 µL Permeabilisierung Lösung (PBS + 0,3 % BSA + 0,1 % TritonX-100 + 0,02 % NaN3) und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Transfer Eizellen schnell durch drei 400 µL Tropfen blockiert Lösung um jede verbleibende Reinigungsmittel zu entfernen.
    Hinweis: Eine 9-gut klare Glasplatte vor Ort eignet sich gut für Gruppen durch mehrere Behandlungen auf ein einziges Gericht (Schritte 2,4-2,5) verschoben.
  8. Führen Sie die verbleibenden Immunocytochemistry Verfahren in eine Feuchte Kammer, lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Verwendung einer mittelständischen Kunststoff-Behälter gefüttert mit feuchten Papiertüchern und mit Alufolie abdecken.
  9. Mit der Pipette Apparat übertragen Eizellen zu 30 µL Lösung auf dem Deckel einer 96-Well-Platte und Ort innerhalb der Feuchte Kammer für 10 Minuten blockiert.
    Hinweis: In den runden Einkerbungen auf der Platte befinden sich Tropfen.
  10. Beschriften Sie Zentromere und Spindel, mit Hilfe der Pipette Apparat, transfer Eizellen zu 30 µL blockiert Lösung mit Anti-Zentromer Antigen (ACA, Crest) (01:30) und Anti-acetyliert Tubulin (1: 1000) und inkubieren Sie für mindestens 1 h.
  11. Spülen Sie Eizellen durch die Übertragung durch drei 30 µL Tropfen Lösung für 10 min zu blockieren.
  12. Mit Hilfe der Pipette Apparat, Transfer Eizellen zu 30 µL drop von blockierenden Lösung, komplementär zu den Antikörpern verwendet oben (Anti-Human IgG 1: 200, Anti-Maus IgG 1: 200) sekundäre Antikörper enthält und 1 h inkubieren.
  13. Wiederholen Sie die 3, 10 min spülen Schritte in 30 µL Lösung blockiert, wie in Schritt 2.11 beschrieben.
  14. Transfer die Eizellen, die mit der Pipette Apparat in 3-5 µL Montage mittlerer mit DAPI (5,9 µg/µL) auf einen Glas-Objektträger.
  15. Legen Sie 4 kleine Tropfen (groß wie ein Stecknadelkopf) Vaseline an den Ecken des Deckglases, Zerkleinerung von Eizellen zu verhindern.
  16. Legen Sie sanft die Deckglas Vaseline Seite nach unten auf die Folie.
  17. Versiegeln Sie Deckglas Kanten mit klaren Nagellack und 5 Minuten trocknen lassen.
  18. Bewahren Sie Folien bei 4 ° C bis zur Verarbeitung über konfokalen Mikroskopie lichtgeschützt auf.
    Hinweis: Sicherstellen der Brechungsindex des Eindeckmittel und Deckglas, Spiele die Mikroskop-Ziele genutzt. Empfohlene Montage, die Materialien bisher beschriebenen 15.
  19. Bild von Eizellen mit einer 40-63 X Objektiv auf einem confocal Mikroskop, kleine Schritte zu erfassen (≤ 1 µm) in der Z-Ebene, für die Arbeiten Ziel, und das Image der gesamten Region der Metaphase Spindel optimiert.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle 3 Kanäle, basierend auf spezifischen Sekundärantikörper verwendet im Schritt 2.11 Bild. Bild von durchschnittlich ≥ 4 und ein Zoom von 3 sind ideal für ausreichende Auflösung. Eine 1 µm Schrittgröße bietet übersichtliche Visualisierung von Mikrotubuli und Kinetochore in Maus Eizellen. Das Verfahren für die Bilderfassung variiert von Mikroskop, Mikroskop. Entnehmen Sie bitte der Hersteller konfokale Benutzerhandbuch für konkrete Schritte zum Mikroskop-Einstellungen konfigurieren.
  20. Identifizieren Sie Kinetochor-Mikrotubuli Anlage Status mithilfe von imaging-Software folgende Schritte 2.21-2.23.
    Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben dieses Verfahren mit Bild J (NIH) kostenlos downloadbare Software, jedoch Alternativen imaging-Software genutzt werden. Anlage-Status, die Arten bisher definiert 16 .
  21. Bild öffnen, indem Sie die Datei in Bild J-Tool-Leiste ziehen.
  22. Machen Sie in der geöffneten Z-Serie alle Kanäle sichtbar (DNA, Kinetochor und Spindel) durch Klicken auf "Kanäle zusammenfügen", erhältlich im Dropdown-Menü "Bild" unter der Registerkarte "Farbe" Sub.
  23. Verwenden den Schalter am unteren Rand des Bildes, bewegen Sie sich durch jede Z-Scheibe und bestimmen Sie Kinetochor-Mikrotubuli-Anlage zu. Detaillierte Anlage, die Beschreibungen bisher beschriebenen 16

(3) Chromosom Ausrichtung Herausforderung Assay

  1. Verwenden die Pipette-Apparat, wie unter Punkt 2.3 beschrieben, Eizellen zu einem 100 µL Tropfen Milrinone-freien Kulturmedium unter Öl zu übertragen und inkubieren Sie Eizellen für 7 h ermöglichen ausreichende Reifung zur Metaphase der Meiose ich (ich traf) wie oben beschrieben im Schritt 2.3 17 .
    Hinweis: Verfahren zur Eizelle Sammlung, Mikroinjektion und Reifung umrissen wurden bisher 15. Beziehen sich auf die Anlage Assay Protokoll in Schritte 2.1-2.2 für Steuerelemente und RNA Mikroinjektion Konzentrationen.
  2. Mit derselben Pipette Apparatur, Transfer Eizellen zu einer Kultur Zentrum gut Orgel Schale mit 700 µL Kulturmedium mit Monastrol [100 µM] im Zentrum gut und 400 µL H20 in das umgebende Ring und Inkubation bei 37 ° C für 2 h.
  3. Monastrol durch die Übertragung von Eizellen, mit Hilfe der Pipette Apparat als oben durch drei Tropfen 100 µL CZB Kulturmedium, ausspülen und übertragen dann die Eizellen für eine neue Mitte-gut Orgel Kulturschale mit 700 µL Kulturmedium + MG132 [5 µM] für 3 h in der Mitte Ring. Den äußeren Ring 400 µL H20 hinzufügen.
  4. Befestigen Sie die Eizellen durch Übertragung, mit der Pipette Apparat in einen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL 2 % Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei Raumtemperatur.
  5. Nach der Fixierung, die Eizellen zu übertragen, mit Hilfe der Pipette Apparat in einen neuen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL blockierende Lösung und Store bei 4 ° C bis für Immunostaining verarbeitet.
    Hinweis: zum Speichern von Eizellen bei 4 ° C, Deckel Glasplatte vor Ort mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern.
  6. Permeabilize und Eizellen über Immunocytochemistry zu kennzeichnen, wie 2,6-2.16 beschrieben.
  7. Eizellen mit einer 40-63 X Objektiv auf einem confocal Mikroskop, Erfassung Bild < 1 µm Schritte in der Z-Ebene und achten Sie auf die gesamte Region der Metaphase Spindel Bild.
  8. Ermittlung von Chromosom Ausrichtung Status offen über imaging-Software-Image-Dateien.
    Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben dieses Verfahren mit Bild J (NIH) kostenlos downloadbare Software, jedoch Alternativen imaging-Software genutzt werden.
  9. Ziehen Sie Bild in Bild J Bedienfeld.
  10. In der geöffneten Z-Serie, verwenden Sie das punktwerkzeug (verfügbar durch Klicken auf das Werkzeugsymbol Punkt auf der Bedienleiste Bild J), Punkte am Ende jeder Spindel Stange in ihre jeweiligen Z-Scheibe zu markieren, indem das Tool über die Spindel Pol im Bild und Klick auf das Bild. Fügen Sie diese Punkte auf die Region of Interest (ROI) Manager Command + t auf der Tastatur drücken.
  11. Bestimmen Sie die spezifischen Koordinaten für jede der Positionen durch Hervorhebung des spezifischen Punktes im ROI-Manager und klicken Sie auf die Schaltfläche Measure in Schritt 3.10 gesetzt. Dies wird ein Ergebnis liefern Tisch-haltigen x- und y-Koordinaten für jeden Punkt. Diese werden die Punkte X1, Y1, und X1, Y2, beziehungsweise.
  12. Bestimmen Sie als nächstes die wahre Z-Koordinate. Dies geschieht durch Multiplikation der Slice-Nummer des bestimmten Z-Segments im Z-Stapel in der Spindel Pol identifiziert wurde (d. h. Scheibe #2 von 6), die jeder einzelner Punkt ist durch die Dicke Stapel (d. h. 1 µm) (Beispiel: Schneiden Sie 2 x 1 µm = 2). Diese werden jeweils die Z1 und Z2 Punkte.
  13. Spindellänge unter Verwendung der Satz des Pythagoras-Gleichung zu bestimmen (eine2 + b2 = C2) unter Verwendung der zuvor definierten x-, y- und Z-Koordinaten von Schritten 3.11-3.13. Für jede Spindel ist die endgültige Länge gleich:
    √((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)
  14. Bestimmen Sie die Spindel Midzone. Dies errechnet sich die Hälfte der Länge der Spindel. Mit dem Linienwerkzeug in Bild J, indem Sie auf die Zeile-Symbol in der Symbolleiste Bild J zeichnen Sie eine Linie, die von einem Pol der Spindel zu Spindel Midzone ist. Die Länge wird auf der Symbolleiste Bild J angezeigt.
  15. Bestimmen Sie Chromosom Ausrichtung Status durch die Bewertung Chromosom Abstand von der Spindel Midzone mit dem Linienwerkzeug Messung. Verwenden das Linien-Werkzeug durch Klicken auf die Zeile-Symbol in der Symbolleiste Bild J, zeichnen Sie eine Linie von der Spindel Midzone auf dem Chromosom. Die Länge wird auf der Symbolleiste Bild J angezeigt. Chromosomen, die größer als 4 µm aus der Spindel Midzone gelten nicht ausgerichtete 18.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Nach in-vitro- haben Transkription hochwertige RNA eine A260/A280 Verhältnis (1,8-2,2) eine A260/A230 Verhältnis ≥1.7, wenn mit einem Spektralphotometer gemessen. Das Bild in Abbildung 1 zeigt die Migration von in-Vitro-RNA auf einem denaturierenden Agarosegel nach Elektrophorese hergestellt. Eine Band, die verschmiert ist, Muster oder ein Beispiel, das hat mehrere große Bänder kann Verunreinigung oder Zerstörung der Probe angeben. Alternati...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Wegen der raschen und zunehmende Identifizierung des menschlichen genetischen Varianten mit Krankheit verbunden ist es unerlässlich, dass Systeme entstehen, um deren biologische Bedeutung zu bewerten. Funktion des Proteins in menschlichen Meiose stellt besondere Herausforderungen zu verstehen, weil menschliche Eizellen kostbar sind und seltene und menschliche Spermien nicht zugänglich, Genmanipulation sind. Maus Eizellen sind Säugetiere Modellsystem wertvoll für die Bewertung der menschlichen meiotische Gene Funktion

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Forschungsstipendium von der American Society for Reproductive Medicine und von der Karl und Johanna Busch Memorial Fund an der Rutgers, The State University von NJ, k.s. A.L.N. wurde durch einen Zuschuss aus dem N.I.H. (F31 HD0989597) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 mL Seal-Rite PCR-RöhrchenUSA Scientific1602-4300
1 kb DNA-LeiterThermo ScientificSM0313
100 bp DNA-LeiterThermo ScientificSM0243
6X DNA-Beladung FarbstoffThermo ScientificR0611
9-Well-Glas-SpotplatteThomas Scientific7812G17
AgaroseSigma AldrichA9539
Albumin aus Rinderserum Sigma-AldrichA3294 
Alexa-Fluor-568 konjugiertes Anti-Maus-IgGThermo ScientificA210501:200 Verdünnung
Alexa-Fluor-633 konjugiertes Anti-Human-IgGThermo ScientificA210911:200 Verdünnung
AmpicillinVWR AA0356
Anti-VibrationstischTechnical Manufacturing Corpjedes Standardmodell
Anti-Acetyliertes Tubulin AntikörperSigma AldrichT74511:100 Diution
Anti-Zentromer (CREST) AntikörperAntikörper Enthalten15-2341:30 Verdünnung 
Barriere (Filter) PipettenspitzenThermo ScientificAM12635Stellen Sie sicher, dass sie mit Ihren Pipettiermarken kompatibel sind. Diese sind mit Pipettierern der Marke Eppendorf kompatibel.
BD Difco Dehydrierte Nährmedien: LB Agar, Miller (Luria Bertani)Fisher ScientificDF0445-07-6
BD Difco Dehydrierte Nährmedien: LB Broth, Miller (Luria Bertani)Fisher ScientificDF0446-07-5
KapillarschlauchSutterB100-75-10
Center Well OrgankulturschaleVWR25381-141
CO2-TankFür Inkubator
KonfokalmikroskopZeissjedes Standardmodell
Zentrifuge (mit Kühlfähigkeit)Thomas Scientificjedes Standardmodell 
Deckglas 11 x 22 mmThomas Scientific6663F10
DeckgläserThomas Scientific6663-F10Die Dicke variiert je nach Mikroskop
DAPISigma AldrichD9542
DEPC H20Life TechnologiesAM9922
Digitales TrockenbadThermo Scientific888700001
Easy A hoch Fidelity KlonierungsenzymAgilent600400Für die DNA-Klonierung 
Enzyme zur Linearisierung von pIVTNew England BiolabsNdeI oder KasI können verwendet werden
EthidiumbromidThermo Scientific155585011
Fluoreszenzmikroskop Jedes Fluoreszenzmikroskop kann verwendet werden
Formaldehyd (37%)Thermo Fisher Scientifc9311
Formaldehyd-RNA-LadefarbstoffAmbion8552
Frosted Mikroskop Slides (ungeladen) 25X75 mmFisher Scientific12-544-3
cDNA-KloneKann von jedem Anbieter bezogen werden, der Open Reading liefert Rahmenklone
GelelektrophoresegerätBio-Radjedes Standardmodell
Glas Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-200
Globin Forward Primer für pIVT Construct5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.  Kann von jedem Unternehmen erworben werden, das kundenspezifische Oligonucelotide herstellt
Globin Reverse Primer für pIVT Construct5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G G -3' Kann von jedem Unternehmen erworben werden, das kundenspezifische Oligonucelotide herstellt
HaltepipettenEppendorf930001015Vacutip
Befeuchtete KammerTupperware kann verwendet werden
Illustra Ready-To-Go RT-PCR-BeadsGE Life Sciences27925901
InkubatorJedes Standardmodell mit CO2- und Wassermanteltechnologie
Inverses MikroskopNikon-InstrumenteJedes Standardmodell
Image J (NIH) SoftwareNIHBildanalysesoftware
Deckel der 96-Well-PlatteNalgene Nunc International263339
Geringe Adhäsion 0,5 mL Mikrozentrifgue-RöhrchenUSA Scientific1405-2600
MacVector MacVectorSequenzanalysesoftware
MG132SelleckchemS2619
ObjektträgerFisher Scientific12-544-3 
Millenium RNA-Marker-Formaldehyd AmbionAM7151
MilrinoneSigma-AldrichM4659Resuspendierung in DMSO bei 2,5 mM
MineralölSigma-AldrichM5310Nur verwendet embryogetestet, sterilfiltriert
MonastrolSigma-AldrichM8515Resuspendierung in DMSO bei 100 mM
MundstückBiodisenoMP-001-Y
N2 Tankfür Antivibrationstisch
Nagellack; Auswahl zurücksetzenJeder klare Nagellack kann verwendet werden
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpektralphotometerThermo Scientificjedes Standardmodell
NorthernMax 10X Denaturierungsgel PufferLife TechnologiesAM8676
NorthernMax 10X LaufpufferLife TechnologiesAM8671
NuPAGE MOPS SDS LaufpufferThermo ScnentificNP0001
Organkulturschale 60x15mmLife Technologies08-772-12
ParaformaldehydPolysciences, Inc. 
PCR ThermocyclerThermo Fisher Scientific4484075
Petrischale 139 mmThermo Fisher Scientifc501V
Petrischale 35 mmThermo Fisher Scientifc121V
Petrischale, 60 mmFalcon BD351007
PicoinjectorXenoWorks Digital Microinjectorjedes Standardmodell
PipettenabzieherFlaming-Brown MikropipettenabzieherModell P-1000
pIVT-PlasmidAddGene32374Leerer Vektor, geeignet für die Eizellexpression.
Trächtige Stute Serum GonadotropinLee BioSolutions493-10
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104Aufreinigung von bis zu 20 μl Plasmid-DNA
QIAquick PCR-AufreinigungskitQiagen28104
Quikchange II Site Directed MutageneseKit Agilent 200523Mutagenese-Kit für Insertionen und Deletionen
Quikchange Lightning Multi-Site Directed Mutagenese KitAgilent 210512Mutagenese-Kit für Veränderungen an einer einzelnen Stelle
Schere (feine Spitze)Feinwissenschaftliche Werkzeuge14393
Schere (mittlere Spitze)Feinwissenschaftliche WerkzeugeWP114225
Seal-Rite 1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenUSA Scientific1615-5500
Objektträgerwärmerfür jedes Standardmodell
Spektralphotometer (Nanotropfen)Thermo Fisher ScientificND-ONE-W
Stereomikroskopbeliebiges Standardmodell
Subklonierungseffizienz DH5a Kompetente ZellenThermo Fisher Scientifc 18265017
SpritzeBD Bioscienes3096231 ml, 27G(1/2)
T4 DNA-LigaseNew England BiolabsM0202L
T7 mMessage Maschine mit hoher Ausbeute Kappen-RNA-TranskriptionskitLife TechnologiesAM1340
TritonX-100Sigma-Aldrichx-100
Tween-20Sigma-Aldrich274348
Pinzette (feine Spitze - Größe 5)Feinwissenschaftliche WerkzeugeSN.743.12.1
Ultrareines Dnase/Rnase-freies destilliertes WasserThermo Fisher Scientifc10977015
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mLThermo Fisher Scientifc15585011
UVP UV/White lite TransilluminatorFisherScientific UV95041501
Vectashield EindeckmediumVector LaboratoriesH-1000
in voller Länge 577773

Referenzen

  1. Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
  2. Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
  3. Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
  4. Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
  5. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  6. Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
  8. Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24(2012).
  9. Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
  10. Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
  11. Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
  12. Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
  13. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
  14. Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
  15. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
  16. Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
  17. Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
  18. Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
  19. Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
  20. Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
  21. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
  22. Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  23. Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
  24. Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
  25. Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
  26. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  27. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

mRNA MikroinjektionKonfokalmikroskopieSpindelanalyseChromosomenausrichtungKinetochor AnbindungGFP ReporterIn vitro Transkription
Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.