Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie

Maria Bloksgaard; Bjarne Thorsted; Jonathan R. Brewer; Jo G. R. De Mey

doi:10.3791/57451

Methodenartikel

Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie

DOI:

10.3791/57451

⸱

9. April 2018

Maria Bloksgaard¹ , Bjarne Thorsted² , Jonathan R. Brewer² , Jo G. R. De Mey¹^,³

¹Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, ²Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, ³Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben, gleichzeitige mechanische Prüfung und 3D-Bildgebung der Arterienwand vereinzelter, Leben, menschlichen Widerstand Arterien und Fidschi und Ilastik Bild-Analysen für die Quantifizierung von Elastin und Kollagen räumliche Organisation und Volumen Dichte. Wir diskutieren die Verwendung dieser Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik.

Zusammenfassung

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Die pathogene Beitrag der Widerstand Arterie Umgestaltung ist essentieller Hypertonie, Diabetes und das metabolische Syndrom urkundlich erwähnt. Untersuchungen und die Entwicklung des microstructurally motiviert mathematische Modelle für das Verständnis der mechanischen Eigenschaften des menschlichen Widerstand Arterien in Gesundheit und Krankheit haben das Potential zum besseren Verständnis wie Krankheit und medizinische Behandlungen Auswirkungen auf die menschliche Mikrozirkulation. Um diese mathematische Modelle zu entwickeln, ist es wichtig, die Beziehung zwischen den mechanischen und Microarchitektonische Eigenschaften der mikrovaskuläre Wand zu entschlüsseln. In dieser Arbeit beschreiben wir eine ex-Vivo -Methode für die passive mechanische Prüfung und gleichzeitige markierungsfreie dreidimensionale Bildgebung der Mikroarchitektur von Elastin und Kollagen in der Arterienwand des isolierten menschlichen Widerstand Arterien. Das Image-Protokoll kann auf Widerstand Arterien aller Arten von Interesse angewendet werden. Bild-Analysen werden für die Quantifizierung i) Druck-induzierte Veränderungen der internen elastischen Lamina Verzweigung Winkel und adventitial Kollagen Geradheit mit Fidschi und (Ii) Kollagen und Elastin Volumen Dichte bestimmt, mit Ilastik-Software beschrieben. Vorzugsweise alle mechanischen und imaging sind Messungen auf live, PERFUNDIERTEN Arterien, jedoch ist ein alternativer Ansatz mit standard Video-Mikroskopie Druck Myographie in Kombination mit Post-Fixierung Bildgebung der erneut unter Druck stehenden Behälter diskutiert. Diese alternative Methode bietet dem Anwender mit verschiedenen Optionen für Analyse-Ansätze. Die Einbeziehung der mechanischen und bildgebenden Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik wird diskutiert, und zukünftige Entwicklung und Ergänzungen des Protokolls werden vorgeschlagen.

Einleitung

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Die pathogenen Beitrag und Auswirkungen der Widerstand Arterie Umgestaltung sind essentieller Hypertonie, Diabetes und das metabolische Syndrom¹^,²^,³^,⁴^,⁵dokumentiert. Entschlüsselung der Beziehung zwischen den mechanischen und Microarchitektonische Eigenschaften der mikrovaskuläre Wand ist unerlässlich für die Entwicklung mathematischer Modelle dieses Vereins. Solche Modelle verbessert den Umbau Prozess zu verstehen und unterstützen die Entwicklung der in Silico Modellen pharmakologische Strategien zielen Kr....

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Protokoll

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Sammlung von Biopsien der menschlichen parietalen Herzbeutel für den Einsatz in dieser Arbeit wurde als zuvor beschriebenen³³nach schriftlicher Einwilligung durchgeführt. Die Studie der menschlichen Geweben entsprechen die Grundsätze, die in der Deklaration von Helsinki³⁴ und wurde von der regionalen Ausschüssen auf Gesundheit Forschungsethik für Süd-Dänemark (S-20100044 und S-20140202) und der dänischen Datenschutzbehörde genehmigt.

1. sammeln Sie Gewebe und isolieren (Human) Widerstand Arterie

Gewebeproben von Interesse unmittelbar nach der Exzision während einer Operation zu samme....

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Ergebnisse

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Die speziell angefertigten Druck Myograph für die Bildgebung verwendet in diesem Werk ist in Abbildung 1dargestellt. Besondere Aufmerksamkeit für die Gestaltung der Myograph war (i) der Kammer mit einer kleinen Menge (2 mL) und (Ii) die Möglichkeit zur Positionierung der Kanülen nahe und parallel mit Glasboden (Abbildung 1 b). Der Boden der Kammer passt ein 50 × 24 mm #1.5 Glas Deckglas (austauschbar). Der Druckregler entstand au.......

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Diskussion

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Diese Arbeit stellt unser Vorschlag für eine standardisierte, kombinierte Bildgebung und Druck Myographie Ansatz, wertvoll für die gleichzeitige Prüfung der mechanischen Eigenschaften der Widerstand Arterien und der Druck im Zusammenhang mit Veränderungen in der Struktur der der arteriellen Wand über einem Druckbereich von 0 bis 100 MmHg. Das vorgestellte Konzept wurde entwickelt mit benutzerdefinierten gebauten Anlagen, jedoch Druck-Myograph, das passt auf eine zwei-Photon Erregung Fluoreszenzmikroskop eingesetzt werden.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Autoren danken den dänischen Molekulare Biomedical Imaging Center an der Fakultät für Naturwissenschaften, Universität von Süddänemark für die Nutzung von Labors und Mikroskope. Kristoffer Rosenstand und Ulla Melchior sind ausgezeichnete technische Unterstützung für den Druck Myographie und imaging anerkannt.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer
Fine Science Tools	15401-12
Fine Science Tools	11251-23
Nikon	SMZ800N
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	761028	zum Sezieren
Vitrex Medical A/S, Herlev, Dänemark	1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon	Ethilon 11-0
Sonderanfertigung		DK Patentnummer 201200167, Universität von Süddänemark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	Nr. B3259
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	Nr. A7030
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	C5670
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	G7021
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	E3889
Merck Millipore, Hellerup, Dänemark	1.00496.9010	Phosphatgepuffert (pH 6,9) 4%ige Formaldehydlösung
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	H3784
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	P9666&
nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	P5655
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	M2643
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	S2002
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	S5886
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	Nr. S5761
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific	10010015
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	PHR1423
Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.	Z370525
Tocris Bioscience, Bristol, UK	538944
Nikon	Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon	CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon	CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Dänemark	H7422P-40
Die AHF analysentechnik AG (Tü Bingen, Deutschland).	ChromaET 460 nm dichroitischer
AHF analysentechnik AG (Tü Bingen, Deutschland).	Semrock FF01-520/35-25 BrightLine Filter
AHF analysentechnik AG (Tü Bingen, Deutschland).	Chroma ET402/15X
Die Dicke des Scotch TM
	Deckglases sollte mit dem verwendeten Objektiv am Mikroskop (#1 oder #1.5) übereinstimmen, alternativ stellen Sie den Einstellkragen so ein, dass er dem Deckglas

Langpass entspricht

Referenzen

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Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med.....

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Schlagwörter

Kollagen Elastin Mikroarchitektur Mechanik von Widerstandsarterien Zwei Photonen Anregungsbildgebung Elastin Autofluoreszenz Kollagen Second Harmonic Generation Fiji Bildanalyse Ilastik Softwareanalyse druckinduzierte Gef ver nderungen Quantifizierung der extrazellul ren Matrix

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