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Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie

DOI:

10.3791/57451

⸱

April 9th, 2018

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1Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben, gleichzeitige mechanische Prüfung und 3D-Bildgebung der Arterienwand vereinzelter, Leben, menschlichen Widerstand Arterien und Fidschi und Ilastik Bild-Analysen für die Quantifizierung von Elastin und Kollagen räumliche Organisation und Volumen Dichte. Wir diskutieren die Verwendung dieser Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die pathogene Beitrag der Widerstand Arterie Umgestaltung ist essentieller Hypertonie, Diabetes und das metabolische Syndrom urkundlich erwähnt. Untersuchungen und die Entwicklung des microstructurally motiviert mathematische Modelle für das Verständnis der mechanischen Eigenschaften des menschlichen Widerstand Arterien in Gesundheit und Krankheit haben das Potential zum besseren Verständnis wie Krankheit und medizinische Behandlungen Auswirkungen auf die menschliche Mikrozirkulation. Um diese mathematische Modelle zu entwickeln, ist es wichtig, die Beziehung zwischen den mechanischen und Microarchitektonische Eigenschaften der mikrovaskuläre Wand zu entschlüsseln. In dieser Arbeit beschreiben wir eine ex-Vivo -Methode für die passive mechanische Prüfung und gleichzeitige markierungsfreie dreidimensionale Bildgebung der Mikroarchitektur von Elastin und Kollagen in der Arterienwand des isolierten menschlichen Widerstand Arterien. Das Image-Protokoll kann auf Widerstand Arterien aller Arten von Interesse angewendet werden. Bild-Analysen werden für die Quantifizierung i) Druck-induzierte Veränderungen der internen elastischen Lamina Verzweigung Winkel und adventitial Kollagen Geradheit mit Fidschi und (Ii) Kollagen und Elastin Volumen Dichte bestimmt, mit Ilastik-Software beschrieben. Vorzugsweise alle mechanischen und imaging sind Messungen auf live, PERFUNDIERTEN Arterien, jedoch ist ein alternativer Ansatz mit standard Video-Mikroskopie Druck Myographie in Kombination mit Post-Fixierung Bildgebung der erneut unter Druck stehenden Behälter diskutiert. Diese alternative Methode bietet dem Anwender mit verschiedenen Optionen für Analyse-Ansätze. Die Einbeziehung der mechanischen und bildgebenden Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik wird diskutiert, und zukünftige Entwicklung und Ergänzungen des Protokolls werden vorgeschlagen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die pathogenen Beitrag und Auswirkungen der Widerstand Arterie Umgestaltung sind essentieller Hypertonie, Diabetes und das metabolische Syndrom1,2,3,4,5dokumentiert. Entschlüsselung der Beziehung zwischen den mechanischen und Microarchitektonische Eigenschaften der mikrovaskuläre Wand ist unerlässlich für die Entwicklung mathematischer Modelle dieses Vereins. Solche Modelle verbessert den Umbau Prozess zu verstehen und unterstützen die Entwicklung der in Silico Modellen pharmakologische Strategien zielen Krankheit im Zusammenhang mit Umbau der Arterienwand zu Testzwecken nützlich.

Vorherige Studien konzentrierten sich im Verständnis der Mikroarchitektur der Arterienwand bezieht sich auf die Arterienwand Mechanik durch den Einbau von mechanischen Maßnahmen und der Mikroarchitektur der extrazellulären Matrix (ECM) werden fast ausschließlich auf große durchgeführt , elastische Conduit Arterien von Mäusen oder Schwein6,7,8,9,10,11. Bildgebung von Mikrostrukturen der Wand erfolgt in der Regel mit nichtlinearen optischen Techniken, unter Ausnutzung der Autofluoreszenz von Elastin und harmonische der zweiten Generation von Kollagen. Dadurch räumlich-zeitliche Darstellung der zwei wichtigsten Komponenten der extrazellulären Matrix, Elastin und Kollagen, ohne Notwendigkeit einer Färbung. Bildgebung der Arterienwand in voller Stärke ist eine Herausforderung in großen Conduit Arterien durch Streuung des Lichts in den dicken Tunika-Medien. Aber, um festzustellen, wie der Mikroarchitektur der Strukturbestandteile der Arterienwand beziehen sich auf die beobachteten mechanischen Eigenschaften, dreidimensionale Informationen während der mechanischen Prüfung einzuholen. Für die großen Arterien wie die menschliche Aorta erfordert dies biaxialen Montage, mechanische Tests und imaging-Regionen von Interesse in 1-2 cm2 Stück der Arterienwand7,9,10, 12. nur einen Teil der Wand abgebildet und mechanisch getestet werden kann.

Für kleinere Arterien aller Arten (z. B. menschlichen Herzbeutel13, pulmonale14 und subkutane15 Arterien, Ratten mesenterialen Arterien16,17,18, 19 , 20, Maus Cremaster, mesenterialen, zerebrale, femorale und Halsschlagadern21,22,23,24,25,26, 27) Bildgebung der gesamte Wanddicke ist möglich und kombinierbar mit mechanischen Tests. Dies ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von der mechanischen Eigenschaften und die strukturellen Vorkehrungen innerhalb der Wand. Jedoch wurde eine direkte mathematische Modellierung des Verhältnisses zwischen der beobachteten Veränderungen in der dreidimensionalen Struktur des ECM und geänderten mechanischen Eigenschaften der Arterienwand Widerstand nach bestem Wissen und gewissen nur berichtet auf vor kurzem in menschlichen Widerstand Arterien13,15.

In dieser Arbeit wird eine ex-Vivo -Methode für die passive mechanische Prüfung und gleichzeitige dreidimensionale Bildgebung der Mikroarchitektur von Elastin und Kollagen in der Arterienwand des isolierten menschlichen Widerstand Arterien beschrieben. Das Image-Protokoll kann auf Widerstand Arterien aller Arten von Interesse angewendet werden. Bild-Analysen sind für den Erhalt der Maßnahmen der internen elastischen Lamina Verzweigung Winkel und adventitial Kollagen Geradheit13 mit Fidschi28beschrieben. Kollagen und Elastin Volumen Dichte werden mit Ilastik Software29 bestimmt und schließlich die Aufnahme der mechanischen und bildgebenden Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik wird diskutiert.

Das Ziel der Bildgebung und Bild Analysen Techniken in Kombination mit der mathematischen Modellierung soll Prüfern eine systematische Vorgehensweise zu beschreiben und zu verstehen, zu beschreiben beobachtet Druckänderungen induziert in den ECM Widerstand Arterien. Die beschriebene Methode konzentriert sich bei der Quantifizierung der Änderungen in das ECM in einem Gefäß während der Druckbeaufschlagung, durch den Vergleich der Struktur des ECM bei 20 / 40 / 100 MmHg. Diese Belastungen wurden ausgewählt, für die Bestimmung der Struktur der Arterienwand nachgiebiger (20 MmHg), steif (100 MmHg) und Zwischenzustand (40 MmHg), beziehungsweise. Jedoch kann jeder Prozess in der Gefäßwand der live Arterien, einschließlich Änderungen induziert durch vasoaktive Komponenten, Hysterese und Flow, abhängig von der Forschung-Hypothese in Frage durch den Prüfarzt quantifiziert werden.

Die Verwendung von zwei-Photon Erregung Fluoreszenz-Mikroskopie (TPEM) in Kombination mit einer Druck-Myograph für Studium Druck (oder andere) induziert Veränderungen in der ECM live Arterien wird betont. Erstens, weil das simultane Erfassung der insgesamt dreidimensionale Struktur der Arterienwand (Durchmesser und Wandstärke) sowie dreidimensionale markierungsfreie Erwerb von hoher Qualität ermöglicht, detaillierte Bilder von Kollagen und elastin Mikroarchitekturen wie beschrieben13 unter Ausnutzung die Autofluoreszenz Elastin und Kollagen zweite harmonische Erzeugung Signal (SHG)30. Zweitens ermöglicht TPEM Verwendung von Niedrigenergie-Nah-Infrarot-Anregungslicht, lichtbedingten der Gewebe und somit wiederholte Bildgebung an genau der gleichen Position innerhalb der Gefäßwand zu minimieren darf ermöglichen wiederholte Messungen Analysen beobachtet, Änderungen.

Die Verwendung eines alternativen Ansatzes mit konfokale Bildgebung des Drucks behoben Arterien wird besprochen, damit Benutzer ohne Zugriff auf TPEM Gelegenheit, sowie das beschriebene Verfahren verwenden können. Informationen zu Struktur und Volumen Dichte ECM kann auch aus zweidimensionalen Analysen der Gewebe geschnitten in Serie, z. B. wie beschrieben von31,32abgerufen werden. Aufgrund der fehlenden Möglichkeit zum Abrufen von dreidimensionalen Strukturinformationen über die Längenskalen der Arterie sowie bei wechselnden Bedingungen mit dieser Methode, ist es jedoch nicht empfehlen die Verwendung dieses Ansatzes für Untersuchungen von Druck und Behandlung induziert dreidimensionale Änderungen in das ECM.

Die Mindestanforderung für die Ermittler, die hierin beschriebene Methode anzuwenden ist der Zugriff auf ein Setup für Kanülierung und Druckbeaufschlagung der Arterien in Kombination mit einem konfokalen oder zwei-Photon Erregung-Fluoreszenz-Mikroskop. Die Einrichtung in das folgende Protokoll beschrieben ist ein Custom-Built Druck Myograph mit einer längs Kraftaufnehmer, gebaut, um auf eine benutzerdefinierte gebaute umgekehrten zwei-Photon Erregung Fluoreszenzmikroskop passen.

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Protocol

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Sammlung von Biopsien der menschlichen parietalen Herzbeutel für den Einsatz in dieser Arbeit wurde als zuvor beschriebenen33nach schriftlicher Einwilligung durchgeführt. Die Studie der menschlichen Geweben entsprechen die Grundsätze, die in der Deklaration von Helsinki34 und wurde von der regionalen Ausschüssen auf Gesundheit Forschungsethik für Süd-Dänemark (S-20100044 und S-20140202) und der dänischen Datenschutzbehörde genehmigt.

1. sammeln Sie Gewebe und isolieren (Human) Widerstand Arterie

  1. Gewebeproben von Interesse unmittelbar nach der Exzision während einer Operation zu sammeln. Übertragung des Gewebes auf 4 ° C HEPES gepufferten physiologischen Salzlösung (HBS) sofort bei Abholung und speichern es in HBS.
    Hinweis: Menschliche Gewebe werden nur dann erhoben nach Genehmigung durch institutionelle und ethischen Gremien sowie schriftliche Einwilligungserklärung Patienten. HBS-Komposition in mM: NaCl 144, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, HEPES 14,9 Glukose 5.5. Stellen Sie den pH-Wert 7,4 mit NaOH und Filtern Sie die Lösung aber 0,2 µm-Filter.
  2. Lassen Sie die gesammelten Gewebe in sterilen HBS bei 4 ° C über Nacht zum Auswaschen von Anästhetika.
    Hinweis: Eine Beeinträchtigung der Lagerung über Nacht Schiff Integrität und Funktionalität sollte vom einzelnen Research Laboratory überprüft werden.
  3. Widerstand, die großen Arterien (± 200 µm Lumen Durchmesser) mit einer scharfen Spitze Zange und Schere Mikro-Dissektion sorgfältig zu isolieren.
  4. Speichern Sie die Arterien bei 4 ° C im eiskalten HBS beim grundieren der Bildgebung/Druckkammer.

2. Montieren Sie die isolierte Arterie in der Druck-Myograph

  1. Montieren Sie die Glas-Kanülen mit einem Tipp Durchmesser von ~ 80 µm auf Kanülen-Halter. Positionieren Sie die Spitzen ca. 150 µm oberhalb der Kammer Glasboden.
    Hinweis: 45° gebogene Spitze Kanülen können präzise Positionierung des Schiffes über den Glasboden.
  2. Einlass und Auslass-Schlauch mit HBS mit 1 % BSA zu füllen und mit dem Drucksystem verbinden.
    Hinweis: BSA ist inbegriffen, endothelial Zelle Funktion zu bewahren.
  3. Montieren Sie die isolierte Arterie mit zwei doppelten Knoten Fäden pro Kanüle.
    Hinweis: Knoten können im Voraus vorbereitet und gespeichert auf doppelte Klebeband bis benötigt.
  4. Füllen Sie die Kammer mit HBS und legen Sie zwei doppelknoten auf jedes Glas Kanüle.
    Hinweis: Bei der Verwendung von Arterien anzeigen myogen Ton sollte HBS mit Kalzium ersetzt werden, die kostenlose HBS mit 3 µM EGTA und 3 µM Natrium Nitroprusside ergänzt.
  5. Halten Sie die Arterie sanft an einem Ende mit zwei Paar scharfe Spitze Pinzetten. Öffnen Sie das Lumen der Arterie und schieben Sie ihn sanft auf die Kanüle. Befestigen Sie an der Kanüle mit zwei Knoten.
  6. Ein Druck von 5 MmHg, sanft spülen das Lumen mit HBS / 1 % BSA.
  7. Cannulate das andere Ende der Arterie und an der Kanüle mit zwei doppelten Knoten sichern.
  8. Die Myograph auf den Mikroskoptisch übertragen und unter Druck die Arterie um 5 MmHg (Eingangsdruck Ausgangsdruck =), dann auf 37 ° C für 30 min erhitzen.
  9. Optional: Kalibrieren Sie längs Kraftaufnehmers gemäß den Anweisungen des Herstellers (1 g = 9,81 mN).
    Hinweis: Unbedingt Kalibrieren der Kraftaufnehmer nach Heizung, da es temperaturempfindlich ist.

3. führen Sie Experiment: Darstellung der arteriellen Durchmesser, Wandstärke und Kollagen und Elastin Mikroarchitektur mit TPEM

  1. Schnell Scannen der kanülierte Arterie unter Druck, um 5 MmHg mit einem 20 X Objektiv (numerische Apertur (NA) ≥ 0,8) und low-Power-Anregungslicht Schiffs Durchmesser und Wandstärke um 5 MmHg zu beurteilen.
    Hinweis: Verwenden Sie ein Wasser-Immersion-Ziel für invertierte Mikroskope; Verwenden Sie für aufrechte Mikroskope eine Wasser eintauchen Ziel. Haben das Ziel keinen Korrektur Kragen, Deckglas Dicke zu korrigieren, stellen Sie sicher, entsprechend der verwendeten Deckglas mit dem Ziel verwendet. Die Software-Einstellungen und Beschreibungen variieren je nach Benutzer-Interphase und Mikroskop und Software verwendet.
    1. Richten Sie den Strahlengang.
      1. Aktivieren Sie Mai Tai-zwei-Photonen-Laser zu und setzen Sie ihn auf 820 nm Anregungslicht.
        Achtung: Vermeiden Sie jede sichtbare als auch unsichtbare Laserlicht.
      2. Emission in zwei Kanäle gleichzeitig zu sammeln. Teilen Emission Licht zwischen den Photomultipliern mit 460 nm langen Pass dichroitischen Spiegel und sammeln Emission mit 30-60 nm breit Bandpass Filter zentriert bei 520 nm (Elastin) und 410 nm (Kollagen), beziehungsweise.
    2. Kontinuierliche Abtastung mit 10 µs Laser wohnen Zeit/Pixel und 512 × 512 Pixel für 100 % Sichtfeld zu ermöglichen.
    3. Manuell scannen Sie durch die Arterie, die Tiefe bestimmen wo maximale Durchmesser beobachtet wird.
    4. Wählen Sie ein rechteckiges Stück für breiteste Durchmesser der Arterie und Scannen Sie ein Einzelbild mit Pixel Größe ≤ 300 nm/Pixel (Abbildung 2). Verwenden Sie als niedrige Erregung Lichtleistung und Pixel Verweilzeit möglichst Photodamaging live Arterie zu vermeiden.
      Hinweis: Es wird empfohlen, eine rechteckige, z.B.einzuholen., 100 × 1024 Pixel großes Bild, anstatt quadratische Bild an dieser Stelle Zeit zu sparen und die Gewebe-Photon-Exposition (Abbildung 2) begrenzen.
    5. Speichern Sie das Bild für spätere Analysen.
  2. Lumen Durchmesser und Wandstärke an der maximale Durchmesser der Arterie zu bestimmen.
    1. Laden Sie das Bild in Fidschi.
    2. Legen Sie den Maßstab durch Klicken auf Main Menü | Analysieren | Maßstab festlegen und geben Sie µm/Pixel und Pixel-Verhältnis (es wird dringend empfohlen, das Pixelverhältnis 1:1 zu halten).
    3. Die Fidschi- Linien -Werkzeug und ziehen Sie eine Linie zwischen zwei internen elastischen Schichten auf jeder Seite des arteriellen Lumens, klicken Sie und STRG + M. Fidschi-Berichte-Länge als Standard in der Ergebnistabelle.
    4. Ebenso zeichnen Sie mehrere Zeilen zur Messung der Dicke der Wände zu, und klicken Sie auf STRG + M um das folgende Markup zu messen.
    5. Speichern Sie die Messungen.
  3. Bild Kollagen und Elastin Mikroarchitektur um 5 MmHg durch die gesamte Dicke der Arterienwand, Erlangung 3D-Bild Stapel mit guter Qualität für 1-3-Regionen entlang der Länge der Arterie zu scannen.
    1. Bild-Stapel durch die gesamte Wand der Arterie mit einer 60 X Ziel, NA ≥ 1, optimierte Pixelgrößen und Z-Abstand zu erhalten.
      1. Berechnen Sie die optimale Bildgebung Bedingungen (Pixelgrößen und Z-Schritt Abstand) im Einklang mit den optischen Weg, Medium eintauchen und probieren Sie Refraktive Indizes mit dem wissenschaftlichen Volume Imaging Nyquist-Rechner (https://svi.nl/NyquistCalculator).
        Hinweis: Bitte achten Sie hierbei auf die Differenz zwischen optimale Pixelgröße und Z-Abstand gegenüber dem Rat in Abschnitt 3.4. oben auf die Verwendung von eine Maximale Pixelgröße.
    2. Verwenden Sie die gleichen Anregung und Emission Einstellungen wie oben (3.1.1.).
    3. Schnell Scannen der Gefäßwand, wie oben beschrieben auf um die Dicke des Z-Stack zu bestimmen.
    4. Z-Stapel-Start und Ende Tiefe, Z-Schritt Abstand und Pixeldichte (gerechnet in 3.3.1.1.) definieren und die Z-Scan durchführen. Speichern Sie jeder Kanal separat.
      Hinweis: Bilder sollte klein genug, z.B. 30 x 30 µm oder 50 × 50 µm je nach Schiffsgröße, jeglichen Einfluss der Krümmung in den nachfolgenden Bild-Analysen zu vermeiden.
  4. Arterielle Durchmesser, Wandstärke und Elastin und Kollagen Mikroarchitektur bei verbleibenden drücken des Protokolls zu bestimmen.
    1. Wiederholen Sie 3.1-3.2 auf Druck 10 und 20 MmHg zu, wiederholen Sie 3,3 bei Druck 20 MmHg.
    2. Wiederholen Sie 3.1 und 3.2 auf 40 MmHg Druck.
    3. Wiederholen Sie 3.1-3.2 auf Druck 60, 80 und 100 MmHg zu und wiederholen Sie 3,3 bei 100 MmHg.
      Hinweis: 3.1-3.3 kann für alle Drücke und Kombinationen von Druck (z.B. einer Serie/Kombination von zunehmenden sowie abnehmende Druck), je nachdem die Hypothese getestet werden wiederholt werden. Eosin Konzentration 0,3 - 1 µM zugesetzt werden, um Elastin Autofluoreszenz bei Immunofluoreszenz zu verbessern. Immunofluoreszenz kann durch die Anwendung als low-Power Anregungslicht möglichst vermieden werden.
    4. Ersetzen Sie den Puffer in der Myograph Kammer mit frischen 37 ° C HBS nach jedem Druck. Lassen Sie die Arterie für 5 min vor Bildgebung nach jeder Änderung im Druck anzupassen.
  5. Kanalstapel getrennt für Bild-Analysen zu speichern.
  6. Lebensfähigkeit der Arterie zu testen.
    1. Anwenden von 10 µM U46619 in der Myograph Kammer gefolgt durch die Zugabe von 10 µM Bradykinin, wenn eine stabile Verengung beobachtet wird.
    2. Zeichnen Sie Durchmesser und Wandstärke auf, wie oben beschrieben in Abschnitt 3.1 nach der Anwendung der einzelnen Verbindungen.
    3. Fügen Sie 3 µM Natrium Nitroprusside, wenn die Arterie nicht vollständig geöffnet ist nach Zugabe von Bradykinin und Datensatz Durchmesser und Wandstärke.
      Hinweis: Abhängig von den pharmakologischen Eigenschaften der Arterie von Interesse (vaskuläre Bett und Arten) können andere Vasokonstriktor und Vasodilatator (Endothel-abhängige) Verbindungen verwendet werden.
  7. Optional: Beheben Sie die unter Druck stehende Arterie zu oder fahren Sie mit Bildgebung von Kollagen und Elastin für Volumen dichten (Schritt 7).
    1. Fügen Sie 4 % Formaldehyd in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C für 1 h.
    2. Waschen Sie die feste Arterie dreimal in 1 X PBS und schieben Sie die Arterie aus der Kanülen, berühren nur die Teile der Arterie außerhalb der Knoten. Nicht entfernen Sie die Knoten zu, verwenden sie für die Abhaltung der Arterie bei der Übertragung auf einen Speicher-Schlauch.
    3. Laden in 1 x PBS / 0,05 % Natriumazid bei 4 ° C bis Imaging für Elastin und Kollagen Volumen Dichte oder für andere Zwecke.
      Hinweis: Feste Arterien können gespeichert werden, für mindestens 3 Monate 1 x PBS / 0,05 % Natriumazid bei 4 ° C.

4. Berechnung der Stress-Strain-Beziehungen und innere Wand Steifigkeit

  1. Bitte befolgen Sie die Formeln und Berechnungsschritte für die Berechnung der Spannungen, Belastungen und Wand Steifigkeit wie von Bloksgaard, M. Et Al. beschrieben 13 und Verweise hierin.

(5) Bildanalyse - (interne elastischen Lamina) IEL Verzweigung Winkel

  1. Bild öffnen-Stack in Fidschi. Gehen Sie zu Datei | Bild öffnen , Bildstapel zu wählen.
    Hinweis: Max Intensität Projektionen von 2 bis 7 aufeinander folgenden Z-Abschnitte, die die IEL (1-2 µm Dicke) dienen zur Bestimmung der IEL Elastin Faser Verzweigung Winkel mit dem Winkel-Tool in Fidschi28,35. Entnehmen Sie Abbildung 4A Abbildung.
  2. Gehen Sie zu Bild | Stapel | Z Projekt... , die Bilder und "Max Intensität Projektion" wählen.
  3. Speichern Sie die maximale Intensität Projektion als TIFF.
  4. Wählen Sie so viele IEL Faser Verzweigungspunkten möglichst mit dem "Winkel-Tool", und gehen Sie systematisch durch die Bilder. Klicken Sie auf STRG + M um jeden Winkel zu messen.
  5. Speichern Sie die Fidschi-Ergebnisse-Blatt.

(6) Bildanalyse - Adventitial Kollagen welligkeit

  1. Bild öffnen-Stack in Fidschi. Gehen Sie zu Datei | öffnen Bild Bildstapel zu wählen.
    Hinweis: Max. Intensität Projektionen von 2 bis 7 aufeinander folgenden Z-Profile mit Kollagen direkt vor der externen elastischen Lamina (Aal, 1-4 µm Dicke) werden zur Ermittlung der Kollagen welligkeit mit Fidschi NeuronJ Plugin36 wie beschrieben durch Rezakhaniha, R verwendet . Et Al. 37 (Abbildung 4 b).
  2. Legen Sie den Maßstab. Gehen Sie zu analysieren | Maßstab Pixelmaße eingeben.
  3. Gehen Sie zu Bild | Stapel | Z Projekt... , Bilder, mit zu arbeiten und "Max Intensität Projektion" zu wählen.
  4. Bildtyp, 8 Bitt TIFF ändern, indem Bild | Typ | 8 Bitt und die maximale Intensität Projektion als TIFF speichern.
  5. Kollagen Fasern Geradheit mit dem Fidschi Neuron J Plugin zu messen.
    1. Öffnen Sie das NeuronJ-Plugin, indem Fidschi | Plugins | Neuron J.
    2. Öffnen Sie die 8-Bit-TIFF in NeuronJ, indem Load Image | Wählen Sie die Datei.
    3. Klicken Sie auf Kurven hinzufügen, und wählen Sie Fasern, indem Sie auf Start und Ende jeder Faser zu analysieren.
    4. Klicken Sie auf Maß Umzeichnungen, wählen Sie die Ablaufverfolgung angezeigt (Lf) und Scheitelpunkt Messungen im Dialogfeld.
  6. L0/Lf berechnen in excel (oder ähnlich) und die Ergebnisse speichern.
    1. Kopieren und Einfügen von Fidschi Neuron J Kurven und Eckpunkte Ausgabe in excel (oder ähnlich) und berechnen L0 mit Pythagoras Pythagoras aus den Scheitelpunkt Messungen. Ersten und letzten Punkt auf Linie zeigen die Positionen der Enden der Hypotenuse in einem 2D Koordinatensystem.
      Hinweis: Ein L0/Lf [Kollagen Faserlänge Bundle zu einem Ende durch eine gerade Linie (L0) / volle Länge (Lf)] nahe 1 zeigt eine fast gerade kollagene Faser.

(7) Imaging für Kollagen und Elastin Volumen Dichte

  1. Waschen die (feste) Arterie 1 X mit PBS-Puffer und für 15 min in 1 µM Eosin in 1 X PBS im Dunkeln Flecken. Führen Sie für feste Arterien diesen Schritt bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Eosin verbessert die Elastin-Fluoreszenz. Eosin färbt andere Strukturen wie Kollagen und das Zytoplasma der Zelle, wird die Probe in der Färbelösung für längere Zeit gelassen. Wenn die Färbung anderer Strukturen zu intensiv ist, senken Sie die Konzentration von Eosin 0,3 µM oder wiederholen Sie waschen.
  2. Waschen Sie die Arterie 3 X in 1 X PBS
    1. Für feste Arterien: Montieren Sie die Arterie für die Bildgebung.
      Achtung: Abbildung des drucklosen Behälter erlaubt keine Abruf von geometrischen quantitative Informationen. Bei der absolute Mengen benötigt werden, sollten diese immer auf live, unter Druck stehenden Arterien gewonnen werden. Volumen-Verhältnis erhalten Sie mit dieser Methode auf den drucklosen Arterien.
      1. Legen Sie zwei Stücke der doppelte Klebeband Klebeband 1-1,5 cm Abstand auf ein Objekt-Glas. Doppelte Klebeband ist etwa 100 µm dick. Wenden Sie eine oder mehrere Schichten des Bandes entsprechend den Durchmesser der Arterie montiert werden.
      2. 10-20 µL PBS auf dem Glas in der Mitte des Platzes und die Arterie in der PBS-Drop.
        Hinweis: Der Tropfen sollte möglichst klein und flach wie möglich zu vermeiden, schieben die Arterie aus der Position, bei der Montage des Deckglas.
      3. Das Deckglas und drücken Sie auf doppelte Klebeband.
      4. Füllen Sie das Reservoir zwischen Deckglas und Objekt Glas mit 1 X PBS. Füllen Sie ihn stündlich um Trocknung der Probe zu vermeiden.
  3. Erhalten Bild-Stacks für Kollagen und Elastin Volumen Dichte mit einem 20 X Objektiv mit NA > 1, so viel der Arterienwand wie möglich abzudecken, während immer noch eine gute optische Auflösung (Abbildung 2D, 2 G und 2 H).
    Hinweis: Verwenden Sie ein Wasser-Immersion-Ziel für die Darstellung von festen Arterien unter einem deckgläschen und verwenden Sie eine Wasser eintauchen Ziel für die Darstellung von Lebensadern. Haben das Ziel keinen Korrektur Kragen, Deckglas Dicke zu korrigieren, stellen Sie sicher, entsprechend dem Deckglas zum Ziel. Verwenden Sie vorzugsweise optimale Pixelgrößen und Z-Abstand. Berechnen Sie diese mit dem Nyquist-Rechner (Schritt 3.3.1.1.). Alternativ können Sie eine minimale Pixelgröße von 300 nm und Z-Abstand von 1 µm. Es wird empfohlen, drei Bilder entlang der Länge der Arterie, die dem Benutzer erlauben, Intra-Assay-Variabilität ermitteln zu erhalten.
  4. Bild Elastin mit 820 nm Anregungslicht und sammeln Emission mit einem 30-60 nm breit Bandpass filter zentriert bei 520 nm.
  5. Bild-Collagen mit 990 nm Anregungslicht zu vermeiden jede Anregung von Elastin und anderen Autofluorescent Proteinen und sammeln Emission mit 10-30 nm breit Bandpass filter zentriert bei 495 nm.
  6. Speichern Sie Bild Stapel aus jeder Kanal separat als TIFF-Dateien

(8) Bildanalyse für die Gewinnung von Elastin und Kollagen Volumen dichten mit Ilastik

  1. TIFF-Bild Stacks, um HDF5 mit Fidschi28,35 durch Klicken auswählen Datei konvertieren | Speichern als... Hdf5.
  2. Erstellen Sie zwei Daten Dateiordner auf Festplatte des Computers, für Elastin, Kollagen Bild Stapel, beziehungsweise. Entsprechenden Bildes Stapel in den entsprechenden Ordner zu kopieren.
  3. Erstellen Sie zwei neue Ilastik-Projekte in der Ilastik-Software, eines für Kollagen, Elastin bzw..
    1. Öffnen Sie Ilastik | Neues Projekt anlegen | Pixel-Klassifizierung | Neues Projekt | Hinzufügen von Daten und wählen Sie das Bildordner in Schritt 8.2 erstellt.
      Hinweis: Folgen Sie dem Ilastik-Assistenten.
  4. Importieren Sie ein 3D-Bild Stapel, um die Software zu trainieren.
    1. Wählen Sie das Applet Eingangsdaten | Hauptarbeitsbereich Bereich | Registerkarte "Raw Data" | Neues hinzufügen... | Fügen Sie eigene Bilder und wählen Sie die gewünschten Bilddaten
  5. Wählen Sie relevanten Funktionen in die Software.
    1. Offene Feature Selection Applet | Wählen Sie die Funktion die öffnet einen neuen Dialog. Details siehe Abbildung 5A .
  6. Fügen Sie mindestens zwei Bezeichnungen, die mit dem Label hinzufügen -Button unter Training-Applet.
    Hinweis: Jedes Etikett eines Objekttyps entspricht, die getrennt werden soll. In dieser Arbeit drei Labels dienen für Elastin: Elastin selbst, helle Flecken (auszuschließende) und Hintergrund (auszuschließende).
  7. Etiketten auf dem raw-Bild-Stapel mit dem Pinsel gestylt Annotation Tool zu zeichnen.
    1. Wählen Sie die entsprechende Bezeichnung: Pinsel -Werkzeug und Start Zeichnung klicken.
  8. Ilastik zu den Bildstapel zu analysieren und suchen Sie nach ähnlichen Eigenschaften durch Anklicken Aktivieren Live Updateaufgefordert.
  9. Überprüfen Sie sorgfältig die Vorhersage-Karte (Abbildung 5).
    Hinweis: Der Prozess von raw-Bild in eine komplette Vorhersage-Karte ist in Abbildung 5dargestellt. Ilastik nutzt die Vorhersage Karte, um das Bild zu segmentieren Stapeln, je nachdem welches Label ist ein Pixel eher verbunden (Abbildung 5).
  10. Kommt ein Mindestwert zur Anwendung.
    1. Wählen Sie Schnittstellenüberwachung Applet, wählen Sie eine geeignete Methode, Eingang Label, glatt, Schwelle und Filterparameter Größe, und klicken Sie abschließend auf anwenden.
      Hinweis: Dies trennt die entsprechend gekennzeichneten Teile des Bildes in einzelne Objekte. Hochgradig vernetzten Gewebe, wie Elastin und Kollagen muss nicht getrennt werden, daher wird eine Schwelle von 0,4 angewendet (der Standardwert ist 0.5). Abbildung 5E und 5F illustrieren das Ergebnis der Anwendung einer Schwellenwerts.
  11. Die Ausbildung von Ilastik zu wiederholen, bis das Ergebnis zufriedenstellend ist (nur Elastin, bzw. Kollagen ist anerkannt für die jeweiligen Analysen).
    1. Häufig wechseln Sie zwischen der Ausbildung und Segmentierung (und manchmal auch die Schwellwerte) Applets während dieses Prozesses. Ein Beispiel für die Auswirkung der Umschulung Ilastik ist in Abbildung 6dargestellt.
  12. Charge analysieren ähnliche Bilddaten: Wählen Sie Batch Vorhersage Eingangswahl und relevanten Dateien hinzufügen.
    Hinweis: Die Ilastik Ausgabe ist eine Sammlung von Pseudo - 1 Bit 3D-Bild Stacks (Bildmasken) mit 0 (null) bezeichnet das Fehlen von Elastin (oder Kollagen) und 1 (eins) bezeichnet das Vorhandensein dieses Vertrags (die tatsächliche Bittiefe ist 8-Bit).
  13. Überprüfen Sie die Ergebnisse für jedes Bildstapel von visuell vergleichen die Bildmasken und die raw-Bilddateien.
  14. Optimieren Sie die Ilastik Maske (Schritte 8,4-8,9) und erneut analysieren Sie alle Bild-Stapel mit unbefriedigenden Ergebnissen.
  15. Berechnen von Elastin und Kollagen Volumen-Dichte von Ilastik Bildmasken mit MATLAB
    1. MATLABzu öffnen.
    2. Wählen Sie Ordner mit Ilastik Bildmasken in MATLAB "aktueller Ordner" Fenster.
    3. Kopieren Sie das MATLAB-Skript aus ergänzende Datei 1 in der MATLAB-Editor und speichern Sie den Code als volumeCalculator.m in der MATLAB-Ordner auf der Festplatte des Computers.
    4. Geben Sie in die Skript-Zeilen Pixelgrößen und Höhe in pixel
      PixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % MIKRON * Mikron
      PixelHeight = 0,9; % Mikron
    5. Speichern Sie das Skript.
    6. MATLAB-Command-Fenster und geben Sie "VolumeCalculator (" Pfad-zu-Daten ")", das Skript zu laden.
    7. Klicken Sie auf eingeben. Jede Bild-Maske ist jetzt fasste und multipliziert mit der (bekannten) Pixel/Voxel-Volumen (Abmessungen eines Pixels multipliziert mit der z-Achse Auflösung). Die Ausgabe von MATLAB ist das Gesamtvolumen von Elastin und Kollagen in jeder Bildstapel.
  16. Speichern Sie die Ergebnisse.

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Results

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Die speziell angefertigten Druck Myograph für die Bildgebung verwendet in diesem Werk ist in Abbildung 1dargestellt. Besondere Aufmerksamkeit für die Gestaltung der Myograph war (i) der Kammer mit einer kleinen Menge (2 mL) und (Ii) die Möglichkeit zur Positionierung der Kanülen nahe und parallel mit Glasboden (Abbildung 1 b). Der Boden der Kammer passt ein 50 × 24 mm #1.5 Glas Deckglas (austauschbar). Der Druckregler entstand au...

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Discussion

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Diese Arbeit stellt unser Vorschlag für eine standardisierte, kombinierte Bildgebung und Druck Myographie Ansatz, wertvoll für die gleichzeitige Prüfung der mechanischen Eigenschaften der Widerstand Arterien und der Druck im Zusammenhang mit Veränderungen in der Struktur der der arteriellen Wand über einem Druckbereich von 0 bis 100 MmHg. Das vorgestellte Konzept wurde entwickelt mit benutzerdefinierten gebauten Anlagen, jedoch Druck-Myograph, das passt auf eine zwei-Photon Erregung Fluoreszenzmikroskop eingesetzt werden...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Die Autoren danken den dänischen Molekulare Biomedical Imaging Center an der Fakultät für Naturwissenschaften, Universität von Süddänemark für die Nutzung von Labors und Mikroskope. Kristoffer Rosenstand und Ulla Melchior sind ausgezeichnete technische Unterstützung für den Druck Myographie und imaging anerkannt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fine Science Tools15401-12
Fine Science Tools11251-23
NikonSMZ800N
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.761028zum Sezieren
Vitrex Medical A/S, Herlev, Dänemark1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
EthiconEthilon 11-0
SonderanfertigungDK Patentnummer 201200167, Universität von Süddänemark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.Nr. B3259
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.Nr. A7030
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.C5670
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.G7021
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.E3889
Merck Millipore, Hellerup, Dänemark1.00496.9010Phosphatgepuffert (pH 6,9) 4%ige Formaldehydlösung
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.H3784
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.P9666&
nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.P5655
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.M2643
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.S2002
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.S5886
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.Nr. S5761
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific10010015
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.PHR1423
  Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.Z370525
  Tocris Bioscience, Bristol, UK538944
NikonCustom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
NikonCFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
NikonCFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, DänemarkH7422P-40
Die AHF analysentechnik AG (Tü Bingen, Deutschland).ChromaET 460 nm dichroitischer
AHF analysentechnik AG (Tü Bingen, Deutschland).Semrock FF01-520/35-25 BrightLine Filter
AHF analysentechnik AG (Tü Bingen, Deutschland).Chroma ET402/15X 
Die Dicke des Scotch TM
Deckglases sollte mit dem verwendeten Objektiv am Mikroskop (#1 oder #1.5) übereinstimmen, alternativ stellen Sie den Einstellkragen so ein, dass er dem Deckglas
Langpass entspricht

References

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