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Methodenartikel

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

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DOI:

10.3791/57497

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27. April 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Protokolle für sammeln und microinjecting precellular westlichen Mais Maiswurzelbohrer Embryonen zum Zwecke der Ausführung der funktionellen Genomik Assays wie Keimbahn Transformation und CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung.

Zusammenfassung

Der Maiswurzelbohrer (WCR) ist ein wichtiger Schädling von Mais und ist bekannt für seine Fähigkeit, schnell zu Pest Managementstrategien anzupassen. RNA-Interferenz (RNAi) erwies sich ein leistungsfähiges Werkzeug für WCR Biologie zu studieren, hat aber seine Grenzen. Speziell, RNAi selbst vergänglich ist (d. h. nicht zu langfristigen Mendelian Erbschaft des zugehörigen Phänotyps), und es erfordert eine Kenntnis der DNA-Sequenz des Zielgens. Letzteres kann die Begrenzung wenn der Phänotyp des Interesses von schlecht erhaltenen oder auch neuartigen Genen gesteuert wird weil er einfach nur nützliche Ziele schwierig sein würde, wenn nicht gar unmöglich. Daher sollte die Anzahl der Werkzeuge in WCRs genomische Toolbox durch die Entwicklung von Methoden, die verwendet werden könnte, um stabile mutierte Stämme erstellen und aktivieren Sequenz-unabhängige Umfragen des Genoms WCR erweitert werden. Hier zeigen wir die Methoden zum Erfassen und microinject precellular WCR Embryonen mit Nukleinsäuren verwendet. Während die hier beschriebenen Protokolle auf die Schaffung von transgenen WCR ausgerichtet sind, könnte CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung auch mit durchgeführt werden die gleichen Protokolle mit dem einzigen Unterschied, die Zusammensetzung der Lösung in die Embryonen injiziert.

Einleitung

Maiswurzelbohrer (WCR), Diabrotica Virgifera Virgifera, ist ein wichtiger Schädling von Mais1. Interessanterweise scheint WCR Überwindung Kontrolle Maßnahmen schneller als die meisten landwirtschaftlichen Schädlinge, da sie nicht nur physiologisch sondern auch verhaltensorientierte2,3,4,5, anpassen 6. im letzten Jahrzehnt RNA-Interferenz (RNAi), ein leistungsfähiges funktionelle Genomik Werkzeug, wurde als eine mögliche Steuerungsmethode für WCR7,8untersucht, und wurde auch als Mittel verwendet, um gen Funktion9zu studieren. Während RNAi durch Mikroinjektion von doppelsträngige RNA (DsRNA) bei anderen Spezies häufig durchgeführt wird, ist jedoch Injektion basierende RNAi in WCR selten. In der Tat gibt es nur wenige Berichte über RNAi per Mikroinjektion von DsRNA in WCR9. Der Grund ist, dass WCR auch erlaubt das Studium der embryonalen Effekte durch die Fütterung von DsRNA der Mutter11High-Level der Gen Knockdown über Einnahme von DsRNA7,10, erreichen kann. Während diese Methode eine ausgezeichnete Thema für funktionelle Genomanalyse über RNAi WCR macht, hat es Fortschritte bei der Entwicklung von Methoden zur embryonalen Mikroinjektion in dieser Spezies verlangsamt.

Trotz der Macht der RNAi gibt es ein paar Nachteile. Zum Beispiel reagieren nicht alle Gene gleich auf RNAi. Diese Variabilität kann Interpretation der Ergebnisse eines funktionellen Genomik-Assays schwieriger machen. Auch, RNAi ist flüchtig und löst keine vererbbare Mutationen. Auf der anderen Seite erzeugen Keimbahn Transformation, eine weitere funktionelle genomische Tool, vererbbare Mutationen über Einfügung eines markierten Elements übertragbar in das Genom12,13. Dies macht Keimbahn Transformation ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Erstellung von mutierte Stämme für den Einsatz in genetischen Langzeitstudien. Transformation kann auch verwendet werden, um eine Mutation zu retten, durch die Bereitstellung einer funktionsfähige Kopie des Gens für eine mutierte Genom-14. Darüber hinaus ist die Keimbahn Transformation der Grundstein für eine Vielzahl von molekulargenetischer. Neben ausschlagen und/oder Rettung Genfunktion, Germline Veränderung Enhancer Trapping15, Gene Trapping16, Gal4-basierte ektopische Expression17und genomweite Mutagenese18einsetzbar.

Vor kurzem wurden Tools, mit denen anspruchsvolle Genom-Bearbeitung entwickelt. Zu diesen Tools zählen Transkription Activator-Like Effektor Nukleasen (TALEN) und die CRISPR/Cas9-Nuklease System19,20. Der Vorteil dieser neuen Werkzeuge ist, dass sie Forscher die Fähigkeit, eine doppelsträngige DNA Pause an fast jedem Ort in fast jedem Genom zu induzieren. Sobald induziert, diese Pausen können repariert werden, durch nicht-homologe Enden verbinden, die Deletionen oder Insertionen in das gezielte gen einführen kann, oder durch Homologie gerichtete Reparatur, die in der Gegenwart ein veränderter Konstrukt, katalysieren kann die Ersatz des gesamten Gene oder genetische Regionen21,22. Diese Methoden erfordern jedoch Mikroinjektion von DNA, RNA und Protein zu sehr jungen Embryonen.

Wichtig ist, überschreiten nicht anders als die DsRNAs verwendet für RNAi, Nukleinsäuren und Proteine zur Keimbahn Transformation und Genom-Bearbeitung leicht Zellmembranen. Daher muss Mikroinjektion von Plasmid-DNA, mRNAs und/oder Proteine statt in der syncytial Blastoderm Phase (d. h. vor der Insekten Embryo cellularizes). Dadurch wird dem Zeitpunkt der Injektionen einen kritischen Faktor. Zum Beispiel in Drosophila Melanogastermüssen Embryonen injiziert werden, innerhalb von zwei Stunden nach Ei12zu legen. Daher muss Entwicklung eines erfolgreichen embryonalen Mikroinjektion Protokolls für WCR die besten Voraussetzungen für weibliche Eiablage, sowie die beste Methode zum Sammeln von precellular Embryonen in ausreichender Menge berücksichtigen.

Dem Bemühen, eine Vielzahl von molekularen genetischen Werkzeuge auf WCR Biologie zu bringen erfordert Methoden zum Sammeln und microinjecting precellular WCR Embryonen entwickeln. Hier bieten wir Ihnen eine ausführliche Anleitung, zusammen mit Tipps und Tricks, um anderen Transformation-basierte Techniken WCR Forschung verwendet zu helfen. Diese Techniken ermöglichen neben der Verlängerung transgener Technologies, WCR für funktionelle Genomforschung Studien, auch leistungsstarke neue Bekämpfungsstrategien wie gen Fahrt23,24 in diesem wirtschaftlich bedeutenden getestet werden Schädling.

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Protokoll

(1) Kolonie-Ebene Aufzucht von WCR Erwachsene

  1. Erhalten Sie eine ausreichende Menge an WCR Erwachsene (500-1.000) von einem zuverlässigen Unternehmen oder Forschung Labor (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel) und legen Sie in einem 30 cm3 -Käfig.
    Hinweis: Eine nicht ruhenden Belastung wird sehr empfohlen.
  2. WCR künstliche Ernährung nach Protokoll des Herstellers vorbereiten und Gießen Sie eine 1 cm dicken Schicht in eine 38 Unzen-Container (siehe Tabelle der Materialien). Nach dem Mischen speichern Sie ungenutzte Diät bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.
  3. Setzen Sie eine Petrischale (100 x 15 mm) mit Erwachsenen Diät (10-15 g) in einen 30 cm3 -Käfig. Fügen Sie weitere Diät, wenn das Essen trocken oder niedrig ist.
  4. Setzen Sie eine Flasche (300 mL) mit Wasser, bedeckt mit einem Wattebausch, die verwendet wird, um eine Watterolle (6 "x 3/8"), dienen zu halten als eine Wasserquelle. Wechseln Sie das Wasser, wenn es zur Neige geht.
  5. WCR bei 26 ° C mit 60 % Luftfeuchtigkeit zu erhalten und eine 14:10 leichte Zyklus in ein Insekt Aufzucht Inkubator.

(2) Embryo Sammlung und Ausrichtung

  1. Machen Sie ein Ei Sammelkammer mit 1 % Agar in Wasser in einem sterilen 100 x 15 mm2 Petrischale. Nach das Agar erstarrt bei 4 ° C lagern.
  2. Um neu gelegten Eiern zu sammeln, legen Sie eine einzelne Schicht aus Filterpapier, gefolgt von 4 Schichten von Gaze (jeder Schnitt, Größe) auf der Oberfläche des Nährbodens (Abbildung 1A).
    Hinweis: Gaze kann wiederverwendet werden, nachdem er gewaschen in Bleichmittel und autoklaviert, aber es ist nicht notwendig, dies bei der ersten Verwendung zu tun. Filterpapier darf nicht wiederverwendet werden und muss nicht sterilisiert werden.
  3. WCR Käfig so spät in den Tag wie möglich (Ende des Arbeitstages) Ei Sammlung Platte setzen und abdecken mit Alufolie Zelt. Lassen Sie über Nacht.
    Hinweis: Nachdem die Lichter auf von 10:00 bis 12: 00 Uhr (14 h) Verzögerungen Eiablage, erleichtert die Sammlung von jüngeren Eiern für die Mikroinjektion ohne Laborpersonal Sammelkammer in Käfig spät in der Nacht zu platzieren.
  4. Entfernen Sie das Ei Sammelkammer rund 8 oder 09:00
  5. Verwenden Sie Zange um zu holen 1 Schicht aus Gaze Zeit und Ort in einem Becherglas (500 mL) Wasser. Waschen von Eiern aus Gaze von leichtem rühren (Abbildung 1 b und 1 C).
  6. Verwenden Sie eine Glühbirne Pipette Eiern in ein weiteres Becherglas (500 mL) Wasser zu übertragen. Wiederholen Sie 2-3 X um die Eizellen zu reinigen.
  7. Verwenden Sie die Glühbirne Pipette übertragen von Eiern auf Filterpapier (Abbildung 1) bei gleichzeitiger Minimierung der Menge an Wasser Verschleppung.
  8. Schneiden Sie schwarzes Filterpapier in Streifen so breit wie ein Glas Folie und Klebeband fest an der Folie, um sicherzustellen, liegt das Papier flach (Abbildung 2A).
    Hinweis: Schwarzes Filterpapier verbessert die Sichtbarkeit unter dem Mikroskop durch Verringerung der Menge des reflektierten Lichts.
  9. Ungiftigen Kleber auftragen (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel) auf das Filterpapier in feinen Linien (Abb. 2 b). Halten Sie die Klebstoff-Linien dünner ist als der Durchmesser eines Eies zu vermeiden, die Eiern, die im Klebstoff beschichtet.
  10. Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um sanft WCR Eiern eins nach dem anderen aus ihrer Filterpapier in die Klebefuge verschieben. Versuchen Sie, die Eiern auf den Kleber legen, bevor es trocknet aus und halten Sie mindestens ein Ei Abstand zwischen jedem Ei.
  11. Injektion Effizienz zu maximieren, indem Sie mehrere Zeilen von Eiern auf einem Filterpapier Folie (Abbildung 3).
  12. Nachdem alle Eizellen auf dem Filterpapier gelegt sind, warten Sie, bis der Leim, bevor Mikroinjektion trocknet.
    Hinweis: Für Germline Veränderung und CRISPR/Cas9-vermittelten Genom Bearbeitung, Spritzen Sie alle Embryonen bis zum Mittag (12:00), damit der älteste Embryo nicht mehr als 19 h alt ist. Jedoch für RNAi gibt es keine zeitliche Begrenzung, da im WCR, DsRNA zwischen den Zellen bewegen kann. In der Tat könnte bessere Überlebensraten für RNAi, Alterung Embryonen führen.

3. Vorbereitung der Plasmid-DNA und Injektionsnadeln

  1. Bereiten Sie qualitativ hochwertige supercoiled Plasmid-DNA mit Hilfe einer Endotoxin-freie kommerzielle kit (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel).
  2. Um die Injektionslösung vorzubereiten, überprüfen Sie die Konzentration der einzelnen Plasmid und verbinden Sie Helfer Plasmid (250 ng/µL Endkonzentration), Spender Plasmid (750 ng/µL Endkonzentration) und Phenol rot Puffer (20 % Endkonzentration). Wirbel die Lösung kurz und Zentrifuge für 3 min bei maximaler Geschwindigkeit Partikel ausgefällt, die die Nadel verstopfen könnten.
  3. Ziehen Sie Borosilikatglas Nadeln (O.D. 1 mm, I.D. 0,58 mm, Länge 10 cm) mit einem flammenden/braun Typ Mikropipette Abzieher. Für die Lagerung deaktivieren sichere zog Nadeln auf doppelseitiges Klebeband in einer Petrischale oder andere Container.
    Hinweis: Für die Mikropipette Puller System, die verwendeten Einstellungen waren: Wärme = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.
  4. Abgleich die Injektionsnadel mithilfe einen Mikro-Loader Spitze (siehe Tabelle der Materialien) zu pipettieren 0,5 - 1,0 µL nach unten in die Nadel in der Nähe das spitz zulaufende Ende. Entfernen Sie Luftblasen aus der Spitze der Nadel, wenn auftreten.
  5. Legen Sie die Injektionsnadel in den Nadelhalter.
  6. Öffnen Sie die Spitze der Nadel durch sanft brechen mit einer feinen Pinzette oder sanft berühren/ziehen die Spitze auf das Deckglas oder Glas Folie.
    Hinweis: Das Ziel ist es, die kleinste Öffnung haben, noch die Injektion Mischung zu kommen, erlaubt (kleinere Öffnungen erfordern in der Regel höheren Einspritzdruck). Abgeschrägte Nadeln erforderlich nicht diesen Schritt, da sie bereits geöffnet sind.

4. Mikroinjektion und nach der Injektion Pflege

  1. Mit einem feinen Pinsel, vorsichtig die Oberfläche von 1 bis 3 Eiern mit sterilem Wasser nass, Stechen Sie die Nadel und die Lösung zu injizieren. Jedes Ei zu injizieren, bevor die Oberfläche trocknet. Suchen Sie das Erscheinungsbild eine kleine Menge der roten Farbe in Eiern während der Einspritzung an die erfolgreiche Mikroinjektion. Zerquetschen Sie, oder entfernen Sie alle Eizellen, die suchen Sie beschädigt, leer, oder sonst können nicht injiziert werden.
    Hinweis: Obwohl Einspritzdruck je nach Bohrung Nadelstärke variiert, 10-13 Psi ist ein guter Ausgangspunkt.
  2. Nachdem alle Eizellen injiziert werden, entfernen Sie das Filterpapier aus der Glas-Folie.
  3. Legen Sie das Filterpapier auf die Oberfläche einer 1 % Agar-Schale (oben beschrieben).
  4. Verwenden Sie Kunststoff Paraffin Film zu versiegeln die Schüssel, und legen Sie in einem 26 ° C Insekt Aufzucht Inkubator für 12 Tage.
    Hinweis: Der Paraffin-Film verhindert Kreuzkontamination von Schimmel zwischen den Gerichten. Eine andere Behandlung, Schimmel und Bakterienwachstum zu verhindern könnte jedoch das Überleben der injizierten Embryonen reduzieren.

(5) kultiviert und schlüpfen der Embryonen

  1. Fangen Sie an Embryonen 12 Tage nach der Injektion für die frisch geschlüpften Larven überprüfen und weiterhin täglich für die nächsten 2 Wochen.
  2. Larven, mit einem feinen Pinsel um eine Aufzucht Box mit gekeimtes Getreide und Boden zu übertragen.
    Hinweis: Schimmel in der Agar-Schale wachsen könnte, sondern Larven schlüpfen nach wie vor in den meisten Fällen. Suchen Sie nach Larven sorgfältig in die Form, um sie alle zu fangen. Einige Larven auf den Deckel der Schale bewegen könnte und möglicherweise in der Kondensation stecken.
  3. Hinten Sie Larven bei 26 ° C standard WCR Aufzucht Methoden25nach.

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Ergebnisse

Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung dieses Protokolls war die Phase der Embryonalentwicklung zum Zeitpunkt der Mikroinjektion. Insbesondere erfordert Keimbahn Transformation Mikroinjektion von DNA vor der embryonalen Cellularization. Und zwar deshalb, weil DNAs Zellmembranen leicht überschreiten können. Versuche, die Phasen des WCR Embryonalentwicklung mit einem nuklearen Fleck visualisieren blieben erfolglos, weil Dechorionation WCR Embryonen im Wesentlichen alle verantwortlich für ...

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Diskussion

Obwohl Mikroinjektion des WCR mit DsRNAs zum Zwecke der RNAi gemeldeten9wurde, dies ist das erste Protokoll, best Practices für microinjecting precellular WCR Embryonen, ein kritischer Prozess für die Durchführung von Keimbahn Transformation zu etablieren und/oder CRISPR/Cas9 Genom Bearbeitung in dieser Art. Erfolgreiche Mikroinjektion WCR Embryonen ist abhängig von vielen Faktoren ab, wie transformationseffizienz. Nachfolgend sind einige der wichtigsten Fragen das Ergebnis unter Verwendung dieses...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Forschungsprogramm von Monsanto Mais Maiswurzelbohrer wissen, MDL aus NCSU Nummer AG/1005 (, MDL und YC) und Startkapital gewähren. Gewähren Sie FC wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Monsantos Mais Maiswurzelbohrer wissen Research Program (AG/1005) und der National Science Foundation, Nummer MCB-1244772 (MDL). Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt. FC und MDL konzipiert und gestaltet die Experimente; FC, PW und SP durchgeführt die Experimente; FC und MDL analysiert die Ergebnisse; und FC, NG und MDL schrieb das Manuskript. Teresa O'Leary, William Klobasa und Stephanie Gorski danken wir für ihre kompetente Unterstützung in screening-WCR. Wir danken Dr. Wade French (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) für Sendungen von Eiern, Lab Kolonien und die Aufzucht Protokolle zu etablieren.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Qualitatives Filterpapier (Schwarz)Ahlstrom8613-0900Für Ei Mikroinjektion
1 oz Behälter Anny's Plastic TablewareASET101Egg Container
Drosophila Agar Typ IIApex66-103Substrat für WCR Eiablageschale
Federleichte PinzetteBioquip4748Umgang mit Larven und Puppen 
Clorox Regular-Bleach1Clorox44600-30770Mais und Geschirr waschen
Trucker's Favorite YellowCoor Farm Supply502Mais zum Füttern WCR
Microinjection System (hausgemacht)NATeile & Anweisungen auf Anfrage erhältlichSteuert den Injektionsdruck (0-20 psi)
Elmer's ungiftiger KleberElmer's Products, Inc.E304Eier auf Filterpapier kleben
epTIPS Microloader-SpitzenEppendorfC2554691Verfüllnadeln Ladespitzen
Falcon GewebekulturschalenFalcon25383-103Keimen von Mais /150 x 25 mm
Fisherbrand  Filterpapier in quantitativer Qualität KreiseFisher ScientificS47576CHerstellung einer Agarschale für die Eiablage/9 cm
Sparkleen FisherScientific04-320-4Waschgeschirr
Einfache ObjektträgerFisher Scientific12-549-3Halten von Filterpapier und Eiern für die Mikroinjektion
Westlicher Maiswurzelbohrer ohne PollenersatzFrontier Agricultural Sciences F9766BWCR Künstliche Ernährung für Erwachsene
Wattebäusche, großGenesee Scientific51-101Schließen Sie den Kolben
Globe Scientific 3,0 mL Kleine KugeltransferpipettenGlobe Scientific137035Sammeln und übertragen Sie Eier
Leica M165 FC Fluoreszenz-Stereomikroskop LeicaM165 FC WCR-Screening
DsRed Filterset für Fluoreszenz-StereomikroskopLeicaDSRAnregungsfilter: 510-560 nm, Emissionsfilter: 590-650 nm
EGFP FilterLeicaGFP2Anregungsfilter: 440– 520 nm, Emissionsfilter: 510 nm
BugDormMegaView ScienceDP1000_5PKäfig für adulte Kolonie
Miniatur-PinselMyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 
Joystick MikromanipulatorNarishigeMN-151Mikromanipulator und Nadelhalter
Mikroskop XY TischOlympus265515Mikroskoptisch (angepasst für die Verwendung mit Stereoskop)
Grade 90 CheeseclothOnline Fabric StoreCHEE90Für Eiablage
Kunststoff Paraffinfolie Pechiney Plastic PackagingPM-996Siegel Agarschale nach Mikroinjektion / Rollengröße 4 Zoll x 125 ft
Percival InkubatorPercival I41VLH3C8WCR-Anzuchtkammer (Inkubator für die Insektenaufzucht)
Erlenmeyerkolben mit engem MalsVWR4980-300-PKWasserbehälter für adulte Völker 
Griffin Low Form BecherVWR1000-600-PKFür die Eierwäsche
Geflochtene WatterollenRichmond Dental Cotton Co.605-3599Verwendung in der Wasserversorgung für adulte Völker 
Petrischalen (35x10mm)SIGMACLS430588-500EAFür Diätplatten
PhenolrotSigma143-78-8Mikroinjektionspuffer
Laserbasierter MikropipiettenabzieherSutter InstrumentP-2000/GNadelabzieher/Hitze = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
Premium MutterbodenThe Scotts Company71130758Erde für den Cron-Anbau
Reloc Zippit 2 Mil Zipper BagsUnited States Plastic Corporation48342Tasche Agarschale nach Mikroinjektion / 5x7
Petrischalen (100x15m)VWR89038-968Herstellung von Agarschale für die Eiablage / 100 x 15 mm
6 oz BehälterWebstaurantstore128E506WCR Einzelpaar Paar-Paarungskammer 
38 oz BehälterWebstaurantstore128NC888Larvenaufzuchtbox/38
oz ChoiceHD 16 oz. Mikrowellentauglicher durchscheinender Kunststoff Deli ContainerWebstaurantstore128HRD16Larvenaufzuchtbox/16 oz
Mikroinjektion Zielfernrohr Wild HeerbruggWILD-M8Mikroinjektions-Zielfernrohr mit einem XY-Tisch
Standard-GlaskapillarenWorld Precision Instruments1B100F-4Mikroinjektionsnadeln
Westlicher MaiswurzelbohrerCenteral Aqricultural research laboratoryNicht-Diapase-StammAnfrage von Dr. Bryan Wade Französisches Labor
Plasmid DNA Midi KitQiagen12143Aufreinigung von injektionsfertigen Plasmid-DNAs
Erwachsene North

Referenzen

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