Hier präsentieren wir Protokolle für sammeln und microinjecting precellular westlichen Mais Maiswurzelbohrer Embryonen zum Zwecke der Ausführung der funktionellen Genomik Assays wie Keimbahn Transformation und CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung.
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Methodenartikel
Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Maiswurzelbohrer (WCR) ist ein wichtiger Schädling von Mais und ist bekannt für seine Fähigkeit, schnell zu Pest Managementstrategien anzupassen. RNA-Interferenz (RNAi) erwies sich ein leistungsfähiges Werkzeug für WCR Biologie zu studieren, hat aber seine Grenzen. Speziell, RNAi selbst vergänglich ist (d. h. nicht zu langfristigen Mendelian Erbschaft des zugehörigen Phänotyps), und es erfordert eine Kenntnis der DNA-Sequenz des Zielgens. Letzteres kann die Begrenzung wenn der Phänotyp des Interesses von schlecht erhaltenen oder auch neuartigen Genen gesteuert wird weil er einfach nur nützliche Ziele schwierig sein würde, wenn nicht gar unmöglich. Daher sollte die Anzahl der Werkzeuge in WCRs genomische Toolbox durch die Entwicklung von Methoden, die verwendet werden könnte, um stabile mutierte Stämme erstellen und aktivieren Sequenz-unabhängige Umfragen des Genoms WCR erweitert werden. Hier zeigen wir die Methoden zum Erfassen und microinject precellular WCR Embryonen mit Nukleinsäuren verwendet. Während die hier beschriebenen Protokolle auf die Schaffung von transgenen WCR ausgerichtet sind, könnte CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung auch mit durchgeführt werden die gleichen Protokolle mit dem einzigen Unterschied, die Zusammensetzung der Lösung in die Embryonen injiziert.
Einleitung
Maiswurzelbohrer (WCR), Diabrotica Virgifera Virgifera, ist ein wichtiger Schädling von Mais1. Interessanterweise scheint WCR Überwindung Kontrolle Maßnahmen schneller als die meisten landwirtschaftlichen Schädlinge, da sie nicht nur physiologisch sondern auch verhaltensorientierte2,3,4,5, anpassen 6. im letzten Jahrzehnt RNA-Interferenz (RNAi), ein leistungsfähiges funktionelle Genomik Werkzeug, wurde als eine mögliche Steuerungsmethode für WCR7....
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Protokoll
(1) Kolonie-Ebene Aufzucht von WCR Erwachsene
- Erhalten Sie eine ausreichende Menge an WCR Erwachsene (500-1.000) von einem zuverlässigen Unternehmen oder Forschung Labor (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel) und legen Sie in einem 30 cm3 -Käfig.
Hinweis: Eine nicht ruhenden Belastung wird sehr empfohlen. - WCR künstliche Ernährung nach Protokoll des Herstellers vorbereiten und Gießen Sie eine 1 cm dicken Schicht in eine 38 Unzen-Container (siehe Tabelle der Materialien). Nach dem Mischen speichern Sie ungenutzte Diät bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.
- Setzen Sie eine Petrischale (100 x ....
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Ergebnisse
Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung dieses Protokolls war die Phase der Embryonalentwicklung zum Zeitpunkt der Mikroinjektion. Insbesondere erfordert Keimbahn Transformation Mikroinjektion von DNA vor der embryonalen Cellularization. Und zwar deshalb, weil DNAs Zellmembranen leicht überschreiten können. Versuche, die Phasen des WCR Embryonalentwicklung mit einem nuklearen Fleck visualisieren blieben erfolglos, weil Dechorionation WCR Embryonen im Wesentlichen alle verantwortlich für .......
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Diskussion
Obwohl Mikroinjektion des WCR mit DsRNAs zum Zwecke der RNAi gemeldeten9wurde, dies ist das erste Protokoll, best Practices für microinjecting precellular WCR Embryonen, ein kritischer Prozess für die Durchführung von Keimbahn Transformation zu etablieren und/oder CRISPR/Cas9 Genom Bearbeitung in dieser Art. Erfolgreiche Mikroinjektion WCR Embryonen ist abhängig von vielen Faktoren ab, wie transformationseffizienz. Nachfolgend sind einige der wichtigsten Fragen das Ergebnis unter Verwendung dieses.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Forschungsprogramm von Monsanto Mais Maiswurzelbohrer wissen, MDL aus NCSU Nummer AG/1005 (, MDL und YC) und Startkapital gewähren. Gewähren Sie FC wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Monsantos Mais Maiswurzelbohrer wissen Research Program (AG/1005) und der National Science Foundation, Nummer MCB-1244772 (MDL). Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt. FC und MDL konzipiert und gestaltet die Experimente; FC, PW und SP durchgeführt die Experimente; FC und MDL analysiert die Ergebnisse; und FC, NG und MDL schrieb das Manuskript. Teresa O'Leary, William Klobasa und Stephanie Gorski danken wir für ihre ko....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Qualitatives Filterpapier (Schwarz) | Ahlstrom | 8613-0900 | Für Ei Mikroinjektion |
| 1 oz Behälter | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg Container |
| Drosophila Agar Typ II | Apex | 66-103 | Substrat für WCR Eiablageschale |
| Federleichte Pinzette | Bioquip | 4748 | Umgang mit Larven und Puppen |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Mais und Geschirr waschen |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Mais zum Füttern WCR |
| Microinjection System (hausgemacht) | NA | Teile & Anweisungen auf Anfrage erhältlich | Steuert den Injektionsdruck (0-20 psi) |
| Elmer's ungiftiger Kleber | Elmer's Products, Inc. | E304 | Eier auf Filterpapier kleben |
| epTIPS Microloader-Spitzen | Eppendorf | C2554691 | Verfüllnadeln Ladespitzen |
| Falcon Gewebekulturschalen | Falcon | 25383-103 | Keimen von Mais /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Filterpapier in quantitativer Qualität Kreise | Fisher Scientific | S47576C | Herstellung einer Agarschale für die Eiablage/9 cm |
| Sparkleen Fisher | Scientific | 04-320-4 | Waschgeschirr |
| Einfache Objektträger | Fisher Scientific | 12-549-3 | Halten von Filterpapier und Eiern für die Mikroinjektion |
| Westlicher Maiswurzelbohrer ohne Pollenersatz | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR Künstliche Ernährung für Erwachsene |
| Wattebäusche, groß | Genesee Scientific | 51-101 | Schließen Sie den Kolben |
| Globe Scientific 3,0 mL Kleine Kugeltransferpipetten | Globe Scientific | 137035 | Sammeln und übertragen Sie Eier |
| Leica M165 FC Fluoreszenz-Stereomikroskop | Leica | M165 FC | WCR-Screening |
| DsRed Filterset für Fluoreszenz-Stereomikroskop | Leica | DSR | Anregungsfilter: 510-560 nm, Emissionsfilter: 590-650 nm |
| EGFP Filter | Leica | GFP2 | Anregungsfilter: 440– 520 nm, Emissionsfilter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Käfig für adulte Kolonie |
| Miniatur-Pinsel | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Mikromanipulator | Narishige | MN-151 | Mikromanipulator und Nadelhalter |
| Mikroskop XY Tisch | Olympus | 265515 | Mikroskoptisch (angepasst für die Verwendung mit Stereoskop) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | Für Eiablage |
| Kunststoff Paraffinfolie | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Siegel Agarschale nach Mikroinjektion / Rollengröße 4 Zoll x 125 ft |
| Percival Inkubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR-Anzuchtkammer (Inkubator für die Insektenaufzucht) |
| Erlenmeyerkolben mit engem Mals | VWR | 4980-300-PK | Wasserbehälter für adulte Völker |
| Griffin Low Form Becher | VWR | 1000-600-PK | Für die Eierwäsche |
| Geflochtene Watterollen | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Verwendung in der Wasserversorgung für adulte Völker |
| Petrischalen (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | Für Diätplatten |
| Phenolrot | Sigma | 143-78-8 | Mikroinjektionspuffer |
| Laserbasierter Mikropipiettenabzieher | Sutter Instrument | P-2000/G | Nadelabzieher/Hitze = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Mutterboden | The Scotts Company | 71130758 | Erde für den Cron-Anbau |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Tasche Agarschale nach Mikroinjektion / 5x7 |
| Petrischalen (100x15m) | VWR | 89038-968 | Herstellung von Agarschale für die Eiablage / 100 x 15 mm |
| 6 oz Behälter | Webstaurantstore | 128E506 | WCR Einzelpaar Paar-Paarungskammer |
| 38 oz Behälter | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvenaufzuchtbox/38 |
| oz ChoiceHD 16 oz. Mikrowellentauglicher durchscheinender Kunststoff Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvenaufzuchtbox/16 oz |
| Mikroinjektion Zielfernrohr | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Mikroinjektions-Zielfernrohr mit einem XY-Tisch |
| Standard-Glaskapillaren | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Mikroinjektionsnadeln |
| Westlicher Maiswurzelbohrer | Centeral Aqricultural research laboratory | Nicht-Diapase-Stamm | Anfrage von Dr. Bryan Wade Französisches Labor |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Aufreinigung von injektionsfertigen Plasmid-DNAs |
Referenzen
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W.
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Nachdrucke und Genehmigungen
